Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll, um eine unterstützte Lipiddoppelschicht auf festen Substraten ohne Verwendung von Lipidbläschen bilden. Wir zeigen, ein einstufiges Verfahren zur Herstellung einer Lipid-Doppelschicht auf Siliciumdioxid und Gold sowie trägergestützten Membranen mit Cholesterin angereicherten Domäne für verschiedene biologische Anwendungen bilden.
Um Zellmembranen zu imitieren, ist der unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) eine attraktive Plattform, die In-vitro-Untersuchung von Membranbezogenen Prozesse ermöglicht, während zur Übertragung der Biokompatibilität und Biofunktionalität auf feste Substrate. Die spontane Adsorption und Ruptur Phospholipidvesikel ist die am häufigsten verwendete Methode, um SLBs bilden. Jedoch unter physiologischen Bedingungen Vesikelfusion (VF) ist, nur eine Teilmenge der Lipidzusammensetzungen und feste Träger begrenzt. Hier beschreiben wir ein einstufiges allgemeine Verfahren genannten Lösungsmittel-unterstützte Lipiddoppelschicht (SALB) Bildungsverfahren um SLBs die nicht Vesikel erfordert bilden. Die SALB Verfahren beinhaltet die Abscheidung von Lipidmolekülen auf einer festen Oberfläche in Gegenwart eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel (zB Isopropanol) und anschließender Lösungsmittelaustausch mit wßriger Pufferlösung um SLB Bildung auszulösen. Die kontinuierliche Lösungsmittelaustauschschritt ermöglicht Anwendung desVerfahren in einem Durchflusskonfiguration für die Überwachung Doppelschichtbildung und nachfolgende Änderungen unter Verwendung einer Vielzahl von oberflächensensitive Biosensoren. Die SALB Methode kann verwendet werden, um SLBs auf einer Vielzahl von hydrophilen festen Oberflächen, einschließlich derjenigen, die unlösbar zu Vesikelfusion sind herzustellen. Darüber hinaus ermöglicht es die Herstellung von SLBs von Lipidzusammensetzungen zusammengesetzt, die nicht mit der Vesikelfusion Verfahren hergestellt werden können. Hierin vergleichen wir Ergebnisse mit den SALB und konventionellen Vesikelfusion Methoden auf zwei veranschaulichende hydrophile Oberflächen, Siliciumdioxid und Gold erhalten. Um die experimentellen Bedingungen für die Herstellung von hochwertigen Doppelschichten über die SALB Verfahren hergestellt zu optimieren, wird die Wirkung von verschiedenen Parametern ab, einschließlich der Art des organischen Lösungsmittels in der Abscheidungsschritt, die Rate der Lösungsmittelaustausch, und der Lipidkonzentration sowie Tipps zur Problemlösung diskutiert . Bildung unterstützt Membranen, die hohe Anteile an Cholesterin ist auch DämonenFett mit dem SALB Verfahren, Hervorhebung der technischen Möglichkeiten des SALB Technik für eine breite Palette von Membrankonfigurationen.
Der Feststoff-unterstützten Lipiddoppelschicht 1 (SLB) ist eine vielseitige Plattform, die die grundlegenden Eigenschaften von Biomembranen wie die Dicke der Doppelschicht, zweidimensionalen Lipiddiffusionsvermögen und die Fähigkeit, membranassoziierten Biomolekülen Host bewahrt. Aufgrund der Komplexität von natürlichen Zellmembranen wurde dieses einfache Plattform wurde gezeigt, als eine effiziente Plattform für in vitro-Untersuchungen von Membranbezogenen Prozesse wie Floßbildung 2, Proteinbindungs 3, Viren und virusartige Partikel Bindungs 4,5 funktionieren und Zellsignal 6. In unmittelbarer Nähe zu einem festen Träger gebildet ist, ist der SLB-Plattform mit einer Vielzahl von Oberflächen-empfindliche Messungen Techniken kompatibel wie Gesamtreflexionsmikroskopie (TIRF), Quarzkristall-Mikrobalance-Dissipation (QCM-D) und die Impedanz-Spektroskopie.
Mehrere Verfahren wurden entwickelt, um verschiedene Arten von SLBs einschließlich Luftblase zu erzeugenZusammenbruch 7 und Dip-Pen-Nanolithographie 8 für Submikrongröße Lipidflecken, Spin-Beschichtung 9 für Doppelschicht-Stacks und Langmuir-Blodgett (LB) 10 und Vesikelfusion (VF) 11 für die vollständige übergreifende, einzelne Lipiddoppelschichten. Die VF-Methode besteht aus der Adsorption von kleinen unilamellaren Vesikeln mit einem festen Träger und nachfolgender spontaner Bruch und Fusion, um eine kontinuierliche Lipid-Doppelschicht zu bilden. Jedoch unter physiologischen Bedingungen spontan Vesikel Bruch hauptsächlich auf Silizium basierende Materialien wie Siliziumdioxid, Glas und Glimmer beschränkt. Zusätzlich Vesikel Bruch nicht spontan Vesikel komplexer Lipidzusammensetzungen wie solche, die hohe Anteile an Cholesterin oder negativ geladenen Lipiden auftreten. Je nach System kann Vesikel Bruch durch weiteres Maßschneidern der experimentellen Bedingungen wie Temperatur 12 Lösung pH 13, und der Salzgehalt 14, osmotischen Schock 15 induziert werden </sauf> oder Druck 16 oder die Zugabe von zweiwertigen Ionen, wie Ca 2+ 17. Alternativ kann das membranaktive Peptid AH, um eine Schicht von adsorbiertem Vesikel destabilisieren eingeführt werden, was zu einer Vesikel Bruch und die Doppelschichtbildung auf einer Strecke der Flächen 18-22.
Außerdem ist eine erfolgreiche Doppelschichtbildung Herstellung einer gut kontrollierten Population von kleinen unilamellaren Vesikeln, die zeitaufwendig und schwierig, die für bestimmte Membranzusammensetzungen zu erreichen sein kann. Daher ist trotz seiner hohen Effizienz bei der optimalen Fällen (beispielsweise nach umfangreichen Gefrier-Auftau-Vorbehandlung von Vesikeln 23), deren allgemeine Anwendung Vesikelfusion wird durch den Umfang der geeigneten Substrate und Membranzusammensetzungen beschränkt.
Das Lösungsmittel-unterstützte Lipiddoppelschicht (SALB) Methode 24-28 ist eine alternative Herstellungsmethode, die nicht Lipidvesikel erfordert. Das Verfahren beruht auf der Abscheidung o basierendf Lipidmoleküle auf einer festen Oberfläche in Gegenwart eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, gefolgt von einer allmählichen Austausch dieser Lösemittel mit einer wässrigen Pufferlösung, um SLB Bildung auszulösen. Während des Lösungsmittelaustauschschritt, der ternären Mischung von Lipiden, organischen Lösungsmittel und Wasser durchläuft eine Reihe von Phasenübergängen mit zunehmendem Wasseranteil, der zur Bildung von lamellaren Phasenstrukturen in der Hauptmassenlösung und einer SLB auf dem festen Substrat führt. Wichtig ist, umgeht diese Selbstorganisation Route die Notwendigkeit Vesikel Bruch, die in der Regel ist der limitierende Schritt für die Transformation von adsorbierten Vesikel in ein SLB. Das Protokoll ist anwendbar auf eine große Vielzahl von Oberflächen, einschließlich Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Chrom, Indiumzinnoxid und Gold. In diesem Dokument und in der begleitenden Video wird ein Vergleich von Lipidablagerung durch die SALB und Vesikelfusion Methoden vorgestellt. Insbesondere der Einfluss der experimentellen Parameter, einschließlich Lipidkonzentration, Strömungsgeschwindigkeit, und die Wahl des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels auf die Qualität des von der SALB Verfahren gebildet Bilayer diskutiert. Analytische Charakterisierung der hergestellten SLBs wird von der QCM-D, Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzerholung nach Photobleaching (FRAP) Techniken durchgeführt. QCM-D-Überwachung ist eine oberflächensensitive Massenmesstechnik, die seit den bahnbrechenden Arbeiten von Keller und Kasemo 29 durchgeführt wird, wurde ausgiebig genutzt, um quantitativ Doppelschichtbildung zu untersuchen. Fluoreszenzmikroskopie erlaubt Inspektion der Membranhomogenität sowie die Visualisierung von Membrandomänen. Die FRAP Technik ist ein Standardwerkzeug, um die seitliche Beweglichkeit der Lipid-Moleküle in einer SLB, die eine wesentliche Eigenschaft des fluidischen Membranen bestimmen.
Der erste Teil dieser Studie beinhaltet QCM-D-Analyse der SALB und Vesikelfusion Methoden angewandt, um Doppelschichtbildung auf Siliziumdioxid und Gold zu versuchen. Im zweiten Teil,Die Herstellung und Charakterisierung dieser Membranen mit einem Bereich von Cholesterinkonzentration mit dem SALB Verfahren demonstriert und die Ergebnisse werden mit den von der Vesikelfusion Verfahren erhaltenen verglichen.
In dieser Arbeit wird ein Lösungsmittel-Austausch-Protokoll, in dem Lipide in Alkohol (Isopropanol, Ethanol oder n-Propanol) mit einem festen Träger inkubiert werden präsentiert und dann wird der Alkohol nach und nach mit einer wässrigen Pufferlösung, um einen Antrieb der Serien ersetzt von Phasenübergängen schließlich produzieren Lamellenphasen Lipid-Doppelschichten 24. Es wird gezeigt, daß das Verfahren ermöglicht die Herstellung von unterstützten Lipiddoppelschichten auf Oberflächen, wie etwa Gold, die unlösbar an den Vesikelfusion Verfahrens geeignet ist.
Eine optimale Lipid-Konzentrationsbereich (0,1 bis 0,5 mg / ml) wurde für die komplette Doppelschichtbildung in experimentellen Standardformate bisher getestet wurde bestimmt. Bei Lipidkonzentrationen von weniger als 0,1 mg / ml, diskrete, mikroskopische Flecken von Doppelschichten gebildet werden. Andererseits wird bei Konzentrationen über 0,1 mg / ml und weniger als 0,5 mg / ml, eine vollständige und einheitliche Doppelschicht gebildet wird. Bei Lipidkonzentrationen oberhalb dieses Bereichs wurde ein Fluid-Doppelschicht noch als verifi gebildetvon FRAP Analyse ed zeigt jedoch, Fluoreszenzmikroskopie auf das Vorhandensein weiterer Lipidstrukturen auf der Oberseite der Doppelschicht. Auffällig ist, die Morphologie dieser zusätzlichen Lipidstrukturen, wie durch QCM-D-Analyse bestimmt, hing von dem Alkohol, der während der Inkubation Schritt verwendet wurde. Im Fall von Ethanol, die relativ hohen Δ f und Δ D verschiebt ähneln der QCM-D Signatur für ein adsorbiertes Vesikel Schicht erhalten. Wenn Isopropanol oder n-Propanol wurde stattdessen verwendet, war der Δ f etwas höher als der Wert für eine Doppelschicht (final Δ f von -30 bis -40 Hz) erwartet, während der Δ D war erheblich höher. Solche QCM-D Antworten würde ausgestreckte Lipidstrukturen (zB wurmähnliche Micellen) nach außen von der Membranoberfläche vorstehenden erwarten (wie durch Fluoreszenzmikroskopie in einigen Fällen sichtbar).
Die Rate der Lösungsmittelaustausch ist ein weiterer wichtiger Parameter, der entscheidend sein kann, especmathematisch bei geringeren Lipidkonzentrationen (zB 0,1 mg / ml) verwendet werden. Schnelle Lösungsmittelaustausch bei niedriger Lipidkonzentration kann zur Bildung von unvollständigen Doppelschichten führen. In der Standard-Messkammer für QCM-D-Messungen in diesem Papier (Q-Sense E4 Messkammer), Durchflussraten von etwa 100 & mgr; l / min verwendet wird, waren geeignet für hoch reproduzierbare komplette Doppelschichtbildung. Für Durchflusszellen mit anderen Geometrien und Volumen kann die optimale Durchflussrate variieren und muss empirisch auf der Grundlage der hier vorgeschlagenen Schritte bestimmt werden.
Zusätzlich zum unterstützten Lipiddoppelschichten auf Oberflächen, die unhandhabbar Vesikelfusion sind, kann die SALB eingesetzt werden, um die Notwendigkeit von Lipidvesikeln, die zerreißen kann, wodurch die Tür zur Herstellung dieser Membranen mit komplexen Zusammensetzungen Öffnung zu umgehen. Als illustratives Beispiel Zusammensetzung wurden Lipidmischungen mit einem hohen Anteil von Cholesterin untersucht. Cholesterin ist ein wichtiger Bestandteil der mammalian Zellmembranen und ihre Bruch nähern können 45-50 Mol-% der Membranlipidzusammensetzung (beispielsweise in Erythrocyten). So sollte auch ein einfaches Modell einer Lipid-Doppelschicht, die eine menschliche Zelle Membran schließen Cholesterin.
Während Vesikelfusion könnte zur fluidischen Lipiddoppelschichten nur 10-15% Cholesterin enthält, herzustellen, können die Verfahren SALB Bildung fluidischen Lipiddoppelschichten, die hohe Anteile von Cholesterin (bis zu 57 mol%, bestimmt durch QCM-D-Messungen quantifiziert) 36. Wenn jedoch das Niveau des Cholesterins wurde weiter erhöht (bis zu 63 mol%) wurden streifenförmigen Bereichen beobachtet 37. Die Co-bestehenden Domains waren flüssig, erinnern an die im Phasendiagramm des Cholesterin / Phospholipide Monoschicht an der Luft-Wasser-Grenzfläche in der β-Region beobachtet.
Insgesamt ist die SALB Methode gezeigt, um eine einfache und effiziente Vorgehensweise sein, unterstützten Lipiddoppelschichten zu bilden, insbesondere in Fällen würde den Rahmen der herkömmlichen Vesikelfusion Methode. Bisher wurden die QCM-D Technik und Fluoreszenz-Mikroskopie hauptsächlich verwendet, um die unterstützten Lipiddoppelschichten durch die SALB Verfahren gebildet charakterisieren. Wir freuen uns, eine breite Palette von oberflächensensitiven analytischen Messungen Techniken, einschließlich der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) 38, Rasterkraftmikroskopie (AFM) 39,40, Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie 41, X-ray 42 und Neutronenreflexionsvermögen 43, kann verwendet werden, um weiter zu charakterisieren und untersuchen einfache und komplexe Doppelschicht-Konfigurationen vorbereitet durch die SALB Verfahren werden. Diese neuen Möglichkeiten öffnen die Tür zu einer größeren Anzahl von Wissenschaftlern, die künstliche Zellmembranen durch die Nutzung eines einfachen und robusten Versuchsprotokoll zu erkunden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten sich Unterstützung von der National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 und NRF2015NRF-POC0001-19), der National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012) und Nanyang Technological University, um NJC bestätigen
QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Isopropanol | Sigma | 673773 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
n-propanol | Sigma | 279544 | |
Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
Silicon tubing 1.6mm ID | IBIDI | 10842 | |
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |