Vi præsenterer en forsøgsprotokol for at danne en understøttet lipiddobbeltlag på faste substrater uden brug lipidvesikler. Vi demonstrerer en ettrins fremgangsmåde til dannelse af et lipiddobbeltlag på siliciumdioxid og guld samt understøttede membraner med kolesterol-beriget domæne for forskellige biologiske anvendelser.
For at efterligne cellemembraner, den understøttede lipiddobbeltlaget (SLB) er en attraktiv platform, som muliggør in vitro undersøgelse af membran-processer samtidig giver biokompatibilitet og biofunctionality til faste substrater. Den spontane adsorption og sprængning af phospholipidvesikler er den mest almindeligt anvendte metode til dannelse SLBs. Men under fysiologiske betingelser, er vesikelfusion (VF) er begrænset til en delmængde af lipidsammensætninger og faste bærere. Her beskriver vi en ettrinsprocedure generelle fremgangsmåde kaldes opløsningsmiddelbaserede assisteret lipiddobbeltlag (Salb) dannelse metode for at danne SLBs som ikke kræver vesikler. Den Salb fremgangsmåde involverer aflejring af lipidmolekyler på en fast overflade i nærværelse af vandblandbare organiske opløsningsmidler (fx isopropanol) og efterfølgende opløsningsmiddel-udveksling med vandig pufferopløsning med henblik på at udløse SLB formation. Den løbende skridt udveksling opløsningsmiddel muliggør anvendelsen af denFremgangsmåde i et flow-through konfiguration er egnet til overvågning dobbeltlag dannelse og efterfølgende ændringer ved hjælp af en lang række overfladeaktive følsomme biosensorer. Den Salb fremgangsmåde kan anvendes til at fremstille SLBs på en bred vifte af hydrofile faste overflader, herunder dem, der er intraktabel til vesikelfusion. Desuden muliggør fremstilling af SLBs sammensat af lipid sammensætninger, som ikke kan fremstilles ved hjælp af vesikelfusion metode. Heri vi sammenlign resultaterne opnået med de Salb og konventionelle vesikelfusion metoder på to illustrative hydrofile overflader, siliciumdioxid og guld. For at optimere de eksperimentelle betingelser for udarbejdelse af kvalitet dobbeltlag høj forberedt via Salb metode effekten af forskellige parametre, herunder typen af organisk opløsningsmiddel i deposition trin, satsen af opløsningsmiddel udveksling, og lipidkoncentrationen diskuteret sammen med tip til fejlfinding . Dannelse af understøttede membraner indeholdende høje fraktioner af cholesterol er også dæmonertreret med Salb metoden, fremhæver de tekniske muligheder i Salb teknik til en bred vifte af membran konfigurationer.
Det faste stof-støttede lipiddobbeltlag 1 (SLB) er en alsidig platform, som bevarer de væsentlige egenskaber ved biomembraner såsom dobbeltlaget tykkelse, todimensional lipid diffusivitet, og evnen til at være vært membran-associerede biomolekyler. På grund af kompleksiteten af naturlige cellemembraner, har vist denne enkle platform til at fungere som en effektiv platform for in vitro-undersøgelser af membran-processer såsom klumpdannelse 2, proteinbinding 3, virus og viruslignende partikel binding 4,5 og celle signalering 6. Dannet i umiddelbar nærhed til en fast bærer, SLBs platformen er kompatibel med en række overfladeaktive følsomme målinger teknikker, såsom total indre refleksion mikroskopi (TIRF), kvartskrystalmikrovægt-dissipation (QCM-D), og impedans spektroskopi.
Der er blevet udviklet flere metoder til at fremstille forskellige typer af SLBs, herunder luftboblekollaps 7 og dip-pen nanolithography 8 for submicron mellemstore lipid pletter, spin-belægning 9 til dobbeltlag stakke og Langmuir-Blodgett (LB) 10 og vesikelfusion (VF) 11 for fuld spænder, enkelt lipiddobbeltlag belægninger. VF metode består i adsorption af små unilamellare vesikler til en fast bærer og efterfølgende spontane brud og fusion til dannelse af en kontinuert lipiddobbeltlag. Men under fysiologiske betingelser, spontan vesikel brud er hovedsageligt begrænset til silicium-baserede materialer såsom siliciumdioxid, glas og glimmer. Hertil kommer, at vesikel brud ikke opstå spontant til vesikler af komplekse lipidsammensætninger såsom dem der indeholder høje fraktioner af cholesterol eller negativt ladede lipider. Afhængigt af systemet, kan vesikel brud induceres ved yderligere at skræddersy de eksperimentelle betingelser, såsom temperatur 12, opløsning pH 13, og saltindhold 14, osmotisk chok 15 </sop> eller tryk 16, eller tilsætning af divalente ioner, såsom Ca2 + 17. Alternativt kan membranen-aktive AH peptid indføres med henblik på at destabilisere et lag af adsorberede vesikler, hvilket fører til vesikel brud og dobbeltlagsformation på en række overflader 18-22.
Endvidere vellykket dobbeltlagsformation kræver fremstilling af en velkontrolleret population af små unilamellare vesikler, som kan være tidskrævende og vanskelig at opnå for visse membran sammensætninger. Derfor på trods af sin høje effektivitet i optimale tilfælde (f.eks efter omfattende fryse-tø forbehandling af vesikler 23), den generelle anvendelse af vesikelfusion er begrænset af omfanget af egnede substrater og membran sammensætninger.
Opløsningsmidlet-assisteret lipiddobbeltlag (Salb) metode 24-28 er en alternativ fremstillingsteknik, som ikke kræver lipidvesikler. Metoden er baseret på aflejring of lipidmolekyler på en fast overflade i nærværelse af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel efterfulgt af en gradvis udveksling af dette opløsningsmiddel med en vandig pufferopløsning for at udløse SLB formation. Under opløsningsmiddel-udveksling trin, den ternære blanding af lipider, organisk opløsningsmiddel og vand gennemgår en serie faseovergange med stigende vand fraktion, hvilket fører til dannelsen af lamellare fase strukturer i bulkopløsningen og en SLB på det faste substrat. Vigtigere er det, denne selv-samling rute omgår behovet for vesikel brud, som normalt er det begrænsende trin for omdannelsen af adsorberede vesikler i en SLB. Protokollen er anvendelig til en lang række overflader, herunder siliciumdioxid, aluminiumoxid, krom, indiumtinoxid, og guld. I dette dokument, og i den ledsagende video, er en sammenligning af lipiddeponering af Salb og vesikelfusion metoder fremlagt. Især påvirkning af eksperimentelle parametre, herunder lipidkoncentration, Strømningshastighed, og valget af vand blandbart organisk opløsningsmiddel, om kvaliteten af dobbeltlaget dannet ved Salb fremgangsmåden drøftes. Analytisk karakterisering af færdige SLBs udføres af QCM-D, fluorescensmikroskopi og fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) teknikker. QCM-D overvågning er en overflade-sensitive masse måleteknik, som siden pionerarbejde udført af Keller og Kasemo 29, er blevet grundigt anvendes til kvantitativ undersøgelse dobbeltlagsformation. Fluorescensmikroskopi tillader inspektion af membranen homogenitet samt visualisering af membrandomæner. FRAP teknik er et standardværktøj at bestemme den laterale mobilitet lipidmolekyler i et SLB, hvilket er en væsentlig egenskab ved fluide membraner.
Den første del af denne undersøgelse indebærer QCM-D analyse af Salb og vesikelfusion metoder anvendes til at forsøge dobbeltlagsformation på siliciumdioxid og guld. I den anden del,fremstilling og karakterisering af understøttede membraner indeholdende en række kolesterol koncentration i Salb metoden er påvist, og resultaterne sammenlignes med dem, der opnås ved vesikelfusion metode.
I dette arbejde, er en opløsningsmiddelfri udvekslingsprotokol præsenteret i hvilken lipider i alkohol (isopropanol, ethanol eller n-propanol) inkuberes med en fast bærer og derefter alkoholen gradvist erstattet med en vandig pufferopløsning med henblik på at drive en række faseovergange sidst producerer lamellar fase lipiddobbeltlag 24. Det er vist, at fremgangsmåden muliggør fremstilling af understøttede lipiddobbeltlag på overflader, såsom guld, som er intraktabel til vesikelfusion metode.
En optimal lipid koncentrationsområde (0,1 – 0,5 mg / ml) er blevet bestemt til fuldstændig dobbeltlagsformation i standardeksperimentelle testet hidtil formater. Ved lipid koncentrationer under 0,1 mg / ml, adskilte, mikroskopiske pletter af dobbeltlag dannet. På den anden side, ved koncentrationer over 0,1 mg / ml og lavere end 0,5 mg / ml, er en fuldstændig og ensartet dobbeltlag dannet. Ved lipidkoncentrationer over dette område, blev en flydende dobbeltlag stadig udformet som verifikationed af FRAP analyse imidlertid fluorescensmikroskopi afslører tilstedeværelsen af yderligere lipid strukturer på toppen af dobbeltlaget. Påfaldende, morfologien af disse yderligere lipidstrukturer, som bestemt ved QCM-D-analyse, afhang af alkohol, som blev anvendt under inkubationstrinnet. I tilfælde af ethanol, de relativt høje A f og Δ D skift ligne QCM-D signatur opnået for en adsorberet vesikel lag. Når isopropanol eller n-propanol i stedet anvendt, Δ f var lidt højere end værdien forventet for et dobbeltlag (endelig Δ f mellem -30 til -40 Hz), mens Δ D var mærkbart højere. Sådanne QCM-D reaktioner ville forventes for udvidede lipidstrukturer (f.eks ormelignende miceller), der rager udad fra membranens overflade (så synlig ved fluorescensmikroskopi i nogle tilfælde).
Hastigheden for udskiftning af opløsningsmiddel er en anden vigtig parameter, som kan være kritisk, especially når lavere lipidkoncentrationer (f.eks 0,1 mg / ml) anvendes. Hurtig udveksling opløsningsmiddel ved lav lipidkoncentration kan føre til dannelse af ufuldstændige dobbeltlag. I standard målekammeret bruges til QCM-D målinger i dette papir (Q-Sense E4 måling Afdeling) strømningshastigheder af omkring 100 ul / min, var egnet til meget reproducerbar komplet dobbeltlagsformation. For flow celler med andre geometrier og volumen, kan det optimale flow varierer og skal bestemmes empirisk baseret på de skridt foreslåede heri.
Ud over dannelse af understøttede lipiddobbeltlag på overflader, der er uløselige med vesikelfusion kan Salb anvendes til at omgå behovet for lipidvesikler, som kan gå i stykker og dermed åbne døren til fremstilling af understøttede membraner med komplekse sammensætninger. Som et illustrativt eksempel sammensætning, blev lipid blandinger med en høj fraktion af kolesterol undersøgt. Kolesterol er en vigtig bestanddel af MammAlian cellemembraner, og dens fraktion kan nærme 45-50 mol-% af membranen lipidsammensætning (fx i erytrocytter). Således bør selv en simpel model af et lipiddobbeltlag, der repræsenterer en human celle membran omfatter cholesterol.
Mens vesikelfusion kunne anvendes til at fremstille fluide lipiddobbeltlag, der kun indeholder 10-15% kolesterol, Salb muliggør fremgangsmåden dannelsen af fluide lipiddobbeltlag indeholdende høje fraktioner af cholesterol (op til 57 mol%, som kvantificeret ved QCM-D målinger) 36. Men når niveauet af kolesterol blev yderligere forhøjet (op til 63 mol%), blev stribe-shape domæner observeret 37. De sameksisterende domæner var væske, der minder om dem, der observeres i β-regionen i fasediagrammet af kolesterol / phospholipider monolag ved luft-vand-grænsefladen.
Samlet set er Salb metoden vist sig at være en enkel og effektiv metode til dannelse af understøttede lipiddobbeltlag, især in sager uden for rammerne af den traditionelle vesikel fusion metoden. Hidtil er der QCM-D teknik og fluorescens mikroskopi hovedsageligt anvendes til at karakterisere de understøttede lipiddobbeltlag dannet ved Salb metode. Fremadrettet en bred vifte af overfladeaktive følsomme analytiske målinger teknikker, herunder overflade (SPR) 38, atomic force mikroskopi (AFM) 39,40, Fourier-transform infrarød spektroskopi 41, X-ray 42 og neutron refleksivitet 43, kan anvendes til yderligere at karakterisere og studere simple og komplekse dobbeltlag konfigurationer Fremstilles ved metoden Salb. Disse nye kapaciteter åbner døren til et større antal forskere, der kan udforske kunstige cellemembraner ved at udnytte en enkel og robust forsøgsprotokol.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 og NRF2015NRF-POC0001-19), National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012), og Nanyang Technological University til NJC
QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Isopropanol | Sigma | 673773 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
n-propanol | Sigma | 279544 | |
Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
Silicon tubing 1.6mm ID | IBIDI | 10842 | |
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |