Presentiamo un protocollo sperimentale per formare un doppio strato lipidico supportato su substrati solidi senza utilizzare vescicole lipidiche. Si dimostra un metodo di uno stadio per formare un doppio strato lipidico di diossido di silicio e oro così come membrane supportate con dominio colesterolo arricchita per varie applicazioni biologiche.
Al fine di simulare le membrane delle cellule, il doppio strato lipidico supportato (SLB) è una piattaforma interessante che permette nelle indagini vitro dei processi a membrana legati mentre conferendo biocompatibilità e biofunzionalità a substrati solidi. L'adsorbimento spontanea e la rottura di vescicole fosfolipidiche è il metodo più comunemente utilizzato per formare SLB. Tuttavia, in condizioni fisiologiche, la fusione delle vescicole (VF) è limitato ad un solo sottoinsieme di composizioni lipidiche e supporti solidi. Qui, si descrive una procedura generale a fase unica definito il metodo di formazione assistita solvente doppio strato lipidico (SALB) per formare SLB che non richiede vescicole. Il metodo SALB comporta la deposizione di molecole lipidiche su una superficie solida, in presenza di solventi organici miscibili con acqua (ad esempio, isopropanolo) e successiva solventi scambio con soluzione tampone acquosa al fine di innescare la formazione di SLB. La fase solvente scambio continuo consente l'applicazione dellaMetodo in una configurazione a flusso adatto per la formazione di monitoraggio doppio strato e successive modifiche utilizzando una vasta gamma di biosensori superficie sensibile. Il metodo può essere usato SALB per fabbricare SLB su un'ampia gamma di superfici solide idrofili, compresi quelli che sono intrattabili di fusione della vescicola. Inoltre, consente la fabbricazione di SLB composto da composizioni lipidiche, che non possono essere preparate con il metodo fusione delle vescicole. Qui, mettiamo a confronto i risultati ottenuti con i metodi di fusione delle vescicole SALB e convenzionali su due superfici idrofile illustrativo, biossido di silicio e oro. Per ottimizzare le condizioni sperimentali per la preparazione di bistrati alta qualità preparati tramite il metodo SALB, l'effetto di vari parametri, tra cui il tipo di solvente organico nella fase di deposizione, il tasso di cambio solvente e la concentrazione di lipidi è discusso con risoluzione dei problemi . La formazione di membrane supportate contenenti elevate frazioni di colesterolo è anche demonitrattato con il metodo SALB, evidenziando le capacità tecniche della tecnica SALB per una vasta gamma di configurazioni di membrana.
Il solido supportato doppio strato lipidico 1 (SLB) è una piattaforma versatile che conserva le caratteristiche di base di biomembrane quali lo spessore doppio strato, bidimensionale diffusività lipidi, e la possibilità di ospitare biomolecole associate alla membrana. A causa della complessità delle membrane cellulari naturali, questa semplice piattaforma ha dimostrato di funzionare come una piattaforma efficiente per studi in vitro di processi a membrana correlati come la formazione zattera 2, proteina legante 3, virus e particelle simili a virus di legame 4,5 , e la segnalazione a 6 celle. Formata in prossimità di un supporto solido, la piattaforma SLB è compatibile con una serie di misure tecniche di superficie sensibile come la microscopia a riflessione interna totale (TIRF), cristallo di quarzo microbilancia-dissipazione (QCM-D), e spettroscopia di impedenza.
Diversi metodi sono stati sviluppati per la produzione di diversi tipi di SLB, compreso bolla d'ariacrollo 7 e dip-pen nanolitografia 8 per macchie di lipidi submicron dimensioni,-spin coating 9 per gli stack doppio strato e Langmuir-Blodgett (LB) 10 e la fusione delle vescicole (VF) 11 per full-spanning, rivestimenti singolo doppio strato lipidico. Il metodo consiste VF dell'adsorbimento di piccole vescicole unilamellari ad un supporto solido e la successiva rottura spontanea e fusione per formare un doppio strato lipidico continuo. Tuttavia, in condizioni fisiologiche, rottura delle vescicole spontanea è limitata principalmente ai materiali a base di silicio, quali biossido di silicio, vetro, e mica. Inoltre, la rottura delle vescicole non avviene spontaneamente per vescicole lipidiche di composizioni complesse come quelle contenenti alte frazioni di colesterolo o lipidi carichi negativamente. A seconda del sistema, la rottura delle vescicole può essere indotta da ulteriormente adattando le condizioni sperimentali quali temperatura 12, soluzione pH 13, e 14 salinità, shock osmotico 15 </sup> o di pressione 16, o l'aggiunta di ioni bivalenti come Ca2 + 17. In alternativa, la membrana attiva AH peptide può essere introdotto per destabilizzare uno strato di vescicole adsorbite, che porta alla rottura della vescicola e formazione bistrato su una serie di superfici 18-22.
Inoltre, la formazione di doppio strato di successo richiede la preparazione di una popolazione ben controllata di piccole vescicole unilamellari che può richiedere molto tempo e difficile da realizzare per certe composizioni membrana. Pertanto, nonostante la sua elevata efficienza in casi ottimali (ad esempio, dopo ampia congelamento-scongelamento pretrattamento di vescicole 23), l'applicazione generale fusione della vescicola è limitata dalla portata di substrati adatti e composizioni membrana.
Il metodo 24-28 assistita solvente doppio strato lipidico (SALB) è una tecnica di fabbricazione alternativa che non richiede vescicole lipidiche. Il metodo si basa sulla deposizione omolecole lipidiche f SU UN superficie solida, in presenza di un solvente organico miscibile acqua seguita da graduale scambio di questo solvente con una soluzione tampone acquoso al fine di innescare la formazione di SLB. Durante la fase solvente di cambio, la miscela ternaria di lipidi, solvente organico e acqua subisce una transizione di fase serie con crescente frazione acquosa, che porta alla formazione di strutture lamellari di fase nella soluzione di massa e una SLB sul substrato solido. È importante sottolineare che questo percorso autoassemblaggio bypassa la necessità per la rottura delle vescicole, che è di solito il fattore limitante per la trasformazione di vescicole adsorbite in un SLB. Il protocollo è applicabile ad un'ampia varietà di superfici e biossido di silicio, ossido di alluminio, cromo, ossido di indio-stagno, e oro. In questo documento e nel video allegato, un confronto tra la deposizione di lipidi dal SALB e metodi vescicole fusione è presentato. In particolare, l'influenza dei parametri sperimentali, compresa la concentrazione di lipidi, Portata, e la scelta del solvente organico miscibile in acqua, sulla qualità del doppio strato costituito dal metodo SALB sono discussi. Caratterizzazione analitica dei fabbricati SLB è eseguita dal QCM-D, microscopia a fluorescenza, e recupero di fluorescenza dopo photobleaching tecniche (FRAP). Monitoraggio QCM-D è una tecnica di misurazione massa superficiale-sensibile, che, dal momento che il lavoro pionieristico svolto da Keller e Kasemo 29, è stato ampiamente utilizzato per studiare quantitativamente formazione doppio strato. Microscopia a fluorescenza permette l'ispezione della membrana omogeneità e la visualizzazione dei domini di membrana. La tecnica FRAP è uno strumento standard per determinare la mobilità laterale di molecole lipidiche in una SLB, che è una proprietà essenziale delle membrane fluidici.
La prima parte di questo studio prevede l'analisi QCM-D del SALB e metodi di fusione delle vescicole applicata per tentare formazione doppio strato di diossido di silicio e oro. Nella seconda parte,preparazione e caratterizzazione di membrane supportate contenenti una gamma di concentrazioni di colesterolo con il metodo SALB sono dimostrati ei risultati sono confrontati con quelli ottenuti con il metodo di fusione delle vescicole.
In questo lavoro, un protocollo solvente cambio è presentato in cui lipidi in alcool (isopropanolo, etanolo, o n-propanolo) vengono incubati con un supporto solido e quindi l'alcool viene sostituito gradualmente, con una soluzione tampone acquosa al fine di guidare una serie delle transizioni di fase alla fine la produzione di lamellare trifase doppi strati lipidici 24. E 'dimostrato che il metodo consente la produzione di bistrati lipidici supportati su superfici quali oro, che è intrattabile al metodo fusione delle vescicole.
Un intervallo di concentrazione lipidica ottimale (0,1 – 0,5 mg / ml) è stato determinato per la formazione completa in doppio strato formati sperimentali serie testati finora. A concentrazioni di lipidi di sotto di 0,1 mg / ml, discreti, macchie microscopiche di doppi strati formata. D'altra parte, a concentrazioni superiori a 0,1 mg / ml e inferiore a 0,5 mg / ml, un doppio strato completo ed uniforme è formato. A concentrazioni lipidiche sopra di questo range, un doppio strato liquido era ancora formato come verificato mediante analisi FRAP, tuttavia, microscopia a fluorescenza rivela la presenza di strutture lipidiche aggiuntivi superiore del doppio strato. Sorprendentemente, la morfologia di queste strutture lipidiche supplementari, come determinato mediante analisi QCM-D, dipendeva l'alcool che è stato utilizzato durante la fase di incubazione. Nel caso dell'etanolo, relativamente elevate Δ turni F e D Δ assomigliano alla firma QCM-D ottenuto per uno strato vescicole adsorbito. Quando è stato invece utilizzato isopropanolo o n-propanolo, il Δ f era leggermente superiore al valore previsto per un doppio strato (finale Δ f tra -30 a -40 Hz), mentre il Δ D era sensibilmente superiore. Tali risposte QCM-D sono attese per strutture lipidiche estesi (ad esempio, micelle vermiformi) sporgenti verso l'esterno dalla superficie della membrana (come visibile al microscopio a fluorescenza in alcuni casi).
Il tasso di cambio solvente è un altro parametro importante, che può essere critico, especbuona resa quando si utilizzano concentrazioni di lipidi inferiore (ad esempio, 0,1 mg / ml). Rapido scambio solvente bassa concentrazione di lipidi può portare alla formazione di doppi strati incompleti. Nella camera di misura standard utilizzato per le misure QCM-D in questo documento (Q-Sense E4 camera di misura), portata di circa 100 ml / min, sono adatti per la formazione di doppio strato altamente riproducibile completa. Per celle di flusso con altre geometrie e di volume, la portata ottimale può variare e deve essere determinato empiricamente sulla base dei passi suggeriti qui.
Oltre a formare bistrati lipidici supportati su superfici intrattabile a fusione della vescicola, il SALB può essere impiegato per aggirare la necessità di vescicole lipidiche che possono rompersi, aprendo così la porta alla fabbricazione di membrane supportate con composizioni complesse. Come esempio illustrativo composizione, sono stati esaminati miscele lipidiche con un'elevata frazione di colesterolo. Il colesterolo è una componente importante di mammalian membrane cellulari, e la sua frazione possono avvicinarsi 45-50 moli% della composizione dei lipidi di membrana (ad esempio, negli eritrociti). Così, anche un semplice modello di un doppio strato lipidico che rappresenta una membrana cellulare umana dovrebbe includere colesterolo.
Mentre vescicole fusione potrebbe essere usato per fabbricare bistrati lipidici fluidici contenenti solo il 10-15% di colesterolo, il metodo consente SALB formazione di bistrati lipidici fluidici contenenti elevate frazioni di colesterolo (fino a 57% in moli, come quantificato mediante misure QCM-D) 36. Tuttavia, quando il livello di colesterolo è ulteriormente elevata (fino a 63% in moli), domini striati figura 37 sono stati osservati. I domini coesistenti erano liquido, ricordano quelli osservati nella regione β nel diagramma di fase del colesterolo / fosfolipidi monostrato all'interfaccia aria-acqua.
In generale, il metodo SALB è dimostrato di essere un metodo semplice ed efficace per formare bistrati lipidici supportati, in particolare in casi al di là del campo di applicazione del metodo di fusione delle vescicole convenzionale. Finora, la tecnica e la microscopia a fluorescenza QCM-D sono stati utilizzati principalmente per caratterizzare i doppi strati lipidici supportati formati con il metodo SALB. Guardando al futuro, una vasta gamma di misure analitiche tecniche di superficie sensibile, tra cui risonanza plasmonica di superficie (SPR) 38, microscopia a forza atomica (AFM) 39,40, trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa 41, a raggi X 42 e neutroni riflettività 43 può, essere utilizzato per caratterizzare ulteriormente e studiare configurazioni semplici e complesse doppio strato preparano con il metodo SALB. Queste capacità emergenti aprono la porta ad un maggior numero di scienziati che possono esplorare le membrane cellulari artificiali, approfittando di un protocollo sperimentale semplice e robusto.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il sostegno della Fondazione Nazionale delle Ricerche (NRF -NRFF2011-01 e NRF2015NRF-POC0001-19), il Consiglio Nazionale delle Ricerche Medical (NMRC / CBRG / 0005/2012), e Nanyang Technological University di NJC
QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Isopropanol | Sigma | 673773 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
n-propanol | Sigma | 279544 | |
Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
Silicon tubing 1.6mm ID | IBIDI | 10842 | |
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |