Vi presenterer en forsøksprotokoll for å danne en understøttet lipidbilag på faste underlag uten bruk av lipidvesikler. Vi viser en en-trinns metode for å danne en lipid bilag på silisiumdioksyd og gull samt støttede membraner med kolesterol-anriket domene for forskjellige biologiske anvendelser.
For å etterligne cellemembraner, er det ytterste lipid bilaget (SLB) understøttet en attraktiv plattform som muliggjør in vitro undersøkelse av membranrelaterte prosesser samtidig givende biokompatibilitet og biofunctionality til faste substrater. Den spontane adsorpsjon og brudd av fosfolipidvesikler er den mest brukte fremgangsmåten for å danne SLBs. Imidlertid, under fysiologiske betingelser, er vesikkel fusjon (VF) er begrenset til bare et delsett av lipid-blandinger og faste bærere. Her beskriver vi en en-trinns generelle fremgangsmåten som kalles oppløsningsmiddel-assistert lipid bilaget (SalB) dannelse metode for å danne SLBs som ikke krever vesikler. Den SalB Fremgangsmåten omfatter avsetning av lipidmolekyler på en fast overflate i nærvær av med vann blandbare organiske oppløsningsmidler (for eksempel isopropanol), og etterfølgende oppløsningsmiddel-utveksling med vandig bufferoppløsning for å utløse SLB formasjonen. Den kontinuerlige oppløsningsmiddel lingstrinnet muliggjør anvendelse avFremgangsmåten i en gjennomstrømnings-konfigurasjonen er egnet for overvåking av bilagsdannelse og etterfølgende endringer ved hjelp av en lang rekke overflatefølsomme biosensorer. Den SalB Fremgangsmåten kan anvendes til å fremstille SLBs på en lang rekke hydrofile faste overflater, inkludert de som er uløselige i vesikkel-fusjon. I tillegg gjør det fabrikasjon av SLBs sammensatt av lipid-blandinger som ikke kan fremstilles ved hjelp av vesikkel-fusjonsmetoden. Heri vi sammenligner resultatene oppnådd med konvensjonelle SalB og vesikkel-fusjonsmetoder på to illustrerende hydrofile overflater, silisiumdioksid og gull. For å optimalisere de forsøksbetingelser for fremstilling av høykvalitets bilag fremstilt via SalB fremgangsmåte blir effekten av forskjellige parametere, inkludert typen av organisk løsningsmiddel i avsetningstrinnet, frekvensen av løsningsmidlet veksling og lipidkonsentrasjonen diskutert sammen med tips feilsøkings . Dannelse av støttede membraner som inneholder store fraksjoner av kolesterol er også demonertrated med SalB metode, fremhever de tekniske egenskapene til SalB teknikk for et bredt spekter av membran konfigurasjoner.
Det faste støttede lipid bilag 1 (SLB) er en allsidig plattform som bevarer de grunnleggende egenskapene til biomembraner slik som to-lags tykkelse, todimensjonal lipid diffusivitet, og evnen til å være vert for membran-assosiert biomolekyler. På grunn av kompleksiteten av naturlige cellemembraner, har denne enkle plattformen vist seg å fungere som en effektiv plattform for in vitro studier av membran-relaterte prosesser som flåten formasjon 2, proteinbindings 3, virus og viruslignende partikkel-binding 4,5 og cellesignale 6. Dannet i umiddelbar nærhet til en fast bærer, er det SLB plattformen forenlig med en rekke overflatefølsomme målinger teknikker som total indre refleksjon mikroskopi (TIRF), kvartskrystall mikrovekt-spredning (QCM-D), og impedans-spektroskopi.
Flere metoder har blitt utviklet for å fremstille forskjellige typer av SLBs, inkludert luftboblekollaps 7 og dip-penn nanolithography 8 for submikrone store lipid flekker, spin-belegg 9 for bilags stabler og Langmuir-Blodgett (LB) 10 og vesikkelfusjon (VF) 11 for full spenner, enkelt lipidbllag belegg. VF Metoden består av adsorpsjon av små unilamellære vesikler til en fast bærer og påfølgende spontan brudd og sammensmelting for å danne et kontinuerlig lipid bilaget. Imidlertid, under fysiologiske betingelser, spontan vesikkel brudd hovedsakelig er begrenset til silisiumbaserte materialer slik som silisiumdioksyd, glass og glimmer. I tillegg vil vesikkel brudd ikke inntreffe spontant for vesikler av komplekse lipide sammensetninger slik som de som inneholder høye fraksjoner av kolesterol eller negativt ladede lipider. Avhengig av systemet, kan det vesikkel-ruptur induseres ved ytterligere å tilpasse de eksperimentelle forhold som temperatur 12, løsnings-pH 13, og saltholdighet 14, osmotisk sjokk 15 </sopp> eller trykk 16, eller tilsetting av divalente ioner så som Ca 2 + 17. Alternativt kan membranen aktive AH peptidet bli introdusert for å destabilisere et sjikt av adsorberte vesikler, som fører til vesikkel brudd og bilagsdannelse på en rekke overflater 18-22.
Dessuten lykkes bilagsdannelse krever fremstillingen av en godt kontrollert populasjon av små unilamellære vesikler som kan være tidkrevende og vanskelig å oppnå for enkelte membransammensetninger. Derfor, til tross for sin høye effektivitet i optimale tilfeller (for eksempel, etter omfattende fryse-tine-forbehandling av vesikler 23), den generelle anvendelse av vesikkel fusjon er begrenset av omfanget av egnede substrater og membransammensetninger.
Løsningsmidlet-assistert lipid bilaget (SalB) -metoden 24-28 er en alternativ fremstillingsteknikk som ikke krever lipidvesikler. Metoden er basert på avsetning of lipidmolekyler på en fast overflate i nærvær av et vannblandbart organisk løsningsmiddel etterfulgt av gradvis utveksling av dette oppløsningsmiddel med en vandig bufferoppløsning for å utløse SLB dannelse. I løpet av oppløsningsmiddel-lingstrinnet, den ternære blanding av lipider, organisk løsningsmiddel, vann og gjennomgår en rekke faseoverganger med økende vannfraksjon, noe som fører til dannelse av lamellære fase strukturer i bulkløsning og en SLB på det faste substrat. Viktigere, omgår denne selv-sammenstillingen rute behovet for vesikkel brudd, som vanligvis er den begrensende trinnet for omdanning av adsorberte vesikler i en SLB. Protokollen er anvendbar for en rekke overflater, inkludert silisiumdioksyd, aluminiumoksyd, krom, indium tinnoksyd, og gull. I dette papir, og i den tilhørende video, er en sammenligning av lipidavsetning ved SalB og vesikkel-fusjonsfremgangsmåter presentert. Spesielt påvirkning av eksperimentelle parametre, herunder lipidkonsentrasjonen, Strømningshastighet, og valget av vannblandbart organisk oppløsningsmiddel, på kvaliteten av bilaget dannet ved SalB metode er omtalt. Analytisk karakterisering av de fabrikkerte SLBs utføres av QCM-D, fluorescens mikroskopi, og fluorescens restitusjon etter fotobleking (FRAP) teknikker. QCM-D overvåking er en overflatesensitiv massemåling teknikk som siden den banebrytende arbeid utført av Keller og Kasemo 29, har vært mye brukt til å kvantitativt undersøke bilagsdannelse. Fluorescens mikroskopi tillater inspeksjon av membranen homogenitet så vel som den visualiseringen av membrandomener. FRAP teknikken er en standard verktøy for å bestemme den sideveis bevegelighet av lipidmolekyler i en SLB, som er en viktig egenskap ved fluidic membraner.
Den første del av denne studien innebærer QCM-D analyse av SalB og vesikkel-fusjonsmetoder anvendt for å forsøke bilagsdannelse på silisiumdioksid og gull. I den andre delen,fremstillingen og karakteriseringen av støttede membraner inneholdende en rekke kolesterolkonsentrasjoner med SalB fremgangsmåten er vist, og resultatene er sammenlignet med dem oppnådd ved hjelp av vesikkel-fusjonsmetoden.
I dette arbeidet, er et løsningsmiddel-utvekslingsprotokollen presentert hvori lipider i alkohol (isopropanol, etanol, eller n-propanol) ble inkubert med en fast bærer, og deretter alkoholen erstattes gradvis med en vandig bufferoppløsning for å drive en serie av faseoverganger til slutt produsere lamellar-fase lipidbilag 24. Det er vist at fremgangsmåten muliggjør fremstilling av støttede lipidbilag på overflater så som gull, som er problematiske å vesikkel-fusjonsmetoden.
En optimal lipid-konsentrasjon område (0,1 – 0,5 mg / ml) er blitt bestemt for fullstendig bilagsdannelse i standard eksperimentelle formater testet hittil. Ved lipid-konsentrasjoner under 0,1 mg / ml, diskrete, mikroskopiske flekker av bilag dannet. På den annen side, ved konsentrasjoner over 0,1 mg / ml og lavere enn 0,5 mg / ml, blir en fullstendig og ensartet dobbeltlaget dannet. Ved lipid-konsentrasjoner over dette område, ble en to-lags fluid fremdeles utformet som verified av FRAP-analyse viser imidlertid fluorescens mikroskopi nærværet av ekstra lipid strukturer på toppen av bilaget. Påfallende, morfologi av disse ytterligere lipidstrukturer, bestemt ved QCM-D-analyse, var avhengig av den alkohol som ble brukt under inkuberingstrinnet. I tilfelle av etanol, de relativt høye S f og Δ D skift ligne QCM-D signatur som oppnås for en vesikkel adsorbert lag. Når isopropanol eller n-propanol i stedet ble brukt, Δ f var noe høyere enn verdien forventet for et bilag (endelig Δ f mellom -30 -40 for å Hz), mens Δ D var betydelig høyere. Slike QCM-D-reaksjoner ville være forventet i lengre lipidstrukturer (f.eks markliknende miceller) som stikker frem utover fra membranoverflaten (som er synlig ved fluorescensmikroskopi i noen tilfeller).
Frekvensen av løsemiddel utveksling er en annen viktig parameter som kan være kritisk, especially når lavere lipid-konsentrasjoner (for eksempel, 0,1 mg / ml) anvendes. Hurtig utveksling oppløsningsmiddel ved lav lipid-konsentrasjon kan føre til dannelsen av ufullstendige bilag. I standard målekammer som brukes for QCM-D-målinger i dette papiret (Q-Sense E4 målekammer), strømningshastigheter på rundt 100 mL / min, var egnet for svært reproduserbare komplett dobbeltlag formasjon. For flyt celler med andre geometrier og volum, kan den optimale strømningshastigheten varierer og må bestemmes empirisk basert på trappen foreslåtte her.
I tillegg til å danne lipid bilag som støttes på overflater som er uløselige i vesikkel-fusjon kan SalB bli anvendt for å omgå behovet for lipidvesikler som kan brytes, for derved å åpne døren til fremstilling av støttede membraner med komplekse sammensetninger. Som et illustrerende eksempel sammensetningen ble lipid-blandinger med en høy andel av kolesterol undersøkt. Kolesterol er en viktig komponent i mammAlian cellemembraner, og den fraksjon kan nærme seg 45 til 50 mol% av membranen lipid sammensetning (for eksempel i erytrocytter). Således bør til og med en enkel modell av et lipidbilag som representerer en human cellemembran inkluderer kolesterol.
Mens vesikkelfusjon kunne brukes til å fremstille fluidic lipid bilag som kun inneholder 10-15% kolesterol, det SalB Måten muliggjør dannelse av fluidic lipidbilag som inneholder høye fraksjoner av kolesterol (opp til 57 mol%, som kvantifisert ved QCM-D-målinger) 36. Men når nivået av kolesterol ble ytterligere forhøyet (opptil 63 mol%) ble det stripe-formede områder 37 observert. De sameksisterende domener var flytende, som minner om det som ble observert i β området i fasediagrammet for kolesterol / fosfolipider monolag i grensesnittet luft-vann.
Totalt sett er SalB metoden vist seg å være en enkel og effektiv metode for å danne støttes lipid bilag, spesielt in tilfeller utenfor omfanget av den konvensjonelle vesikkel fusjonsmetoden. Hittil har de QCM-D teknikk og fluorescens mikros hovedsak brukt til å karakterisere de støttede lipidbilag dannet ved SalB metoden. Ser frem, et bredt spekter av overflate sensitive analytiske målinger teknikker, inkludert overflate plasmonresonans (SPR) 38, atomic force mikroskopi (AFM) 39,40, Fourier-transform infrarød spektroskopi 41, X-ray 42 og nøytron reflektivitet 43, kan brukes til ytterligere å karakter og studere enkle og komplekse dobbeltlag-konfigurasjoner fremstille ved SalB metoden. Disse nye mulighetene åpne døren til et større antall forskere som kan utforske kunstige cellemembraner ved å dra nytte av en enkel og robust forsøksprotokoll.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 og NRF2015NRF-POC0001-19), National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012), og Nanyang Technological University til NJC
QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Isopropanol | Sigma | 673773 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
n-propanol | Sigma | 279544 | |
Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
Silicon tubing 1.6mm ID | IBIDI | 10842 | |
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |