Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

غشاء حيوي تلفيق من المذيبات بمساعدة الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة

doi: 10.3791/53073 Published: December 1, 2015

Summary

نقدم بروتوكول تجريبي لتشكيل طبقة ثنائية الدهون معتمدة على ركائز متينة دون استخدام حويصلات الدهنية. ونحن لشرح طريقة خطوة واحدة لتشكيل طبقة ثنائية المادة الدهنية على ثاني أكسيد السيليكون، والذهب، وكذلك الأغشية مدعمة مجال التخصيب الكولسترول للتطبيقات البيولوجية المختلفة.

Abstract

من أجل تقليد أغشية الخلايا، طبقة ثنائية المادة الدهنية المدعومة (SLB) هو منصة جذابة والتي تمكن في تحقيق المختبر من العمليات المتعلقة غشاء بينما منح توافق مع الحياة وbiofunctionality على ركائز متينة. الامتزاز عفوية وتمزق الحويصلات فوسفورية هو الأسلوب الأكثر شيوعا لتشكيل SLBs. ومع ذلك، في ظل الظروف الفسيولوجية، والانصهار الحويصلة (VF) يقتصر على مجموعة فرعية فقط من المؤلفات الدهون والدعم الصلبة. هنا، نحن تصف الإجراء العام من خطوة واحدة تسمى بمساعدة مذيب الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة تشكيل من أجل تشكيل SLBs التي لا تتطلب الحويصلات. الأسلوب ينطوي على SALB ترسب جزيئات الدهون على سطح صلب في وجود المذيبات قابلة للامتزاج المياه العضوية (على سبيل المثال، الأيزوبروبانول) واللاحقة مذيب التبادل مع حل العازلة مائي من أجل إطلاق عملية تشكيل SLB. الخطوة الصرف المذيبات مستمرة تتيح تطبيقالأسلوب في تكوين التدفق من خلال مناسبة لتشكيل طبقة ثنائية الرصد والتعديلات اللاحقة باستخدام مجموعة واسعة من أجهزة الاستشعار الحساسة للسطح. طريقة SALB يمكن استخدامها لصنع SLBs على مجموعة واسعة من السطوح الصلبة للماء، بما في ذلك تلك التي هي مستعصية على الانصهار الحويصلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن تصنيع SLBs تتألف من تركيبة الدهون التي لا يمكن إعدادها باستخدام أسلوب الانصهار الحويصلة. هنا، نحن مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها مع SALB والتقليدية طرق الانصهار الحويصلة على سطحين ماء توضيحية، وثاني أكسيد السيليكون والذهب. لتحسين ظروف تجريبية لإعداد طبقات ثنائية جودة عالية أعدت من خلال طريقة SALB، وناقش تأثير عوامل مختلفة، بما في ذلك نوع من المذيبات العضوية في خطوة الترسيب، وسعر الصرف المذيبات، وتركيز الدهون مع نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها . تشكيل الأغشية بدعم تحتوي على كسور عالية من الكوليسترول هو أيضا الشياطينtrated مع أسلوب SALB، وتسليط الضوء على القدرات التقنية للتقنية SALB لمجموعة واسعة من التشكيلات الغشاء.

Introduction

والصلبة المدعومة من الدهون طبقة ثنائية 1 (SLB) هي عبارة عن منصة متعددة الاستخدامات التي تحافظ على الخصائص الأساسية للbiomembranes مثل سمك طبقة ثنائية، الانتشارية الدهون ثنائي الأبعاد، والقدرة على استضافة الجزيئات الحيوية المرتبطة الغشاء. نظرا لتعقيد أغشية الخلايا الطبيعية، وقد أظهرت هذه المنصة بسيطة لتعمل بمثابة منصة فعالة لفي الدراسات المختبرية من العمليات المتعلقة غشاء مثل تشكيل طوف 2، 3 بروتين ملزمة، وفيروس يشبه فيروس الجسيمات ملزمة 4،5 ويشير خلية 6. شكلت على مقربة من دعم قوي، ومنصة SLB متوافق مع مجموعة من القياسات تقنيات حساسة للسطح مثل الكلي المجهر التأمل الداخلي (TIRF)، الكوارتز الكريستال توازن دقيق تبديد (QCM-D)، ومقاومة التحليل الطيفي.

وقد وضعت عدة طرق لإنتاج أنواع مختلفة من SLBs، بما في ذلك فقاعة الهواءانهيار 7 وتراجع من ركلة جزاء طباعة حجرية نانوية 8 لبقع الدهون-submicron الحجم، 9 لرزمة طبقة ثنائية وانجميور-بلودجيت (LB) 10 والانصهار الحويصلة (VF) 11 مقابل الممتدة الكامل، واحدة الطلاء الدهون طبقة ثنائية طلاء زيادة ونقصان. وتتكون الطريقة VF من امتصاص الحويصلات unilamellar صغيرة إلى دعم قوي وتمزق عفوي لاحق والانصهار لتشكيل الدهون طبقة ثنائية مستمرة. ومع ذلك، في ظل الظروف الفسيولوجية، حويصلة عفوية تمزق يقتصر أساسا على المواد القائمة على السيليكون مثل ثاني أكسيد السيليكون، والزجاج، والميكا. وبالإضافة إلى ذلك، لا تحدث حويصلة تمزق عفوي في الحويصلات من المؤلفات الدهون المعقدة مثل تلك التي تحتوي على كسور عالية من الكوليسترول أو الدهون سالبة الشحنة. اعتمادا على النظام، قد يكون ذلك حافزا الحويصلة تمزق عن طريق زيادة الخياطة الظروف التجريبية مثل درجة الحرارة 12، 13 درجة الحموضة الحل، والملوحة 14، صدمة التناضحي 15 16، أو إضافة أيونات ثنائي التكافؤ مثل الكالسيوم 2+ 17. بدلا من ذلك، يمكن عرض غشاء نشط ه الببتيد من أجل زعزعة استقرار طبقة من الحويصلات كثف، مما أدى إلى تمزق الحويصلة وتشكيل طبقة ثنائية بشأن مجموعة من السطوح 18-22.

وعلاوة على ذلك، تشكيل طبقة ثنائية الناجح يتطلب إعداد السكان تسيطر عليها بشكل جيد من الحويصلات unilamellar الصغيرة التي يمكن أن يكون مضيعة للوقت وصعب التحقيق في بعض التراكيب الغشاء. لذلك، على الرغم من كفاءتها العالية في الحالات المثلى (على سبيل المثال، بعد واسعة المعالجة تجميد أذاب حويصلات 23)، التطبيق العام لحويصلة الانصهار محدودة بسبب نطاق ركائز مناسبة والتراكيب الغشاء.

طريقة بمساعدة مذيب الدهون طبقة ثنائية (SALB) 24-28 هو أسلوب تلفيق البديلة التي لا تتطلب الحويصلات الدهنية. وتستند هذه الطريقة على ترسب سجزيئات الدهون و على سطح صلب في وجود المذيبات العضوية غير قابلة للامتزاج المياه تليها الصرف التدريجي من هذه المذيبات مع حل العازلة مائي من أجل إطلاق عملية تشكيل SLB. خلال الخطوة المذيبات الصرف، وخليط ثلاثي الدهون، المذيبات العضوية، والماء يخضع لمرحلة سلسلة التحولات مع زيادة نسبة المياه، الأمر الذي يؤدي إلى تشكيل هياكل المرحلة رقائقي في حل الجزء الأكبر وSLB على الركيزة الصلبة. الأهم من ذلك، هذا الطريق التجميع الذاتي يتجاوز الحاجة لتمزق الحويصلة، التي عادة ما تكون الخطوة تحد للتحول من الحويصلات كثف إلى SLB. بروتوكول ينطبق على طائفة واسعة من الأسطح بما في ذلك غاز ثاني أكسيد السيليكون، وأكسيد الألومنيوم، الكروم، أكسيد القصدير الإنديوم، والذهب. في هذه الورقة والفيديو المصاحب، وقدم مقارنة بين ترسب الدهون التي SALB وطرق الانصهار الحويصلة. على وجه الخصوص، وتأثير المعلمات التجريبية، بما في ذلك تركيز الدهون، وتناقش معدل التدفق، واختيار من المياه المذيبات العضوية غير قابلة للامتزاج، على نوعية طبقة ثنائية شكلتها طريقة SALB. يتم تنفيذ توصيف تحليلي للSLBs ملفقة من قبل QCM-D، مضان المجهر، والانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) التقنيات. رصد QCM-D هو كتلة تقنية قياس حساسة للسطح الذي، منذ العمل الرائد الذي أجراه كيلر وKasemo 29، وقد استخدمت على نطاق واسع لتحقيق كميا تشكيل طبقة ثنائية. يسمح مضان المجهر التفتيش من التجانس غشاء فضلا عن التصور المجالات الغشاء. تقنية FRAP هي أداة موحدة لتحديد التنقل الجانبي من جزيئات الدهون في SLB، وهي خاصية أساسية من الأغشية الموائعية.

الجزء الأول من هذه الدراسة تتضمن تحليل QCM-D من SALB والحويصلة طرق الانصهار تطبيقها على محاولة تشكيل طبقة ثنائية على ثاني أكسيد السيليكون والذهب. في الجزء الثاني،وأظهرت إعداد وتوصيف الأغشية دعم تحتوي على مجموعة من تركيزات الكوليسترول مع أسلوب SALB وتتم مقارنة النتائج مع تلك التي تم الحصول عليها عن طريق أسلوب الانصهار الحويصلة.

Protocol

1. تشكيل المدعومة الدهن طبقة ثنائية على دعم الصلبة للماء

  1. إعداد الحلول الأسهم الدهون من 10 ملغ / مل 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DOPC) و 1 ملغ / مل 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (lissamine رودامين B السلفونيل) (ره-PE) عن طريق إذابة مساحيق الدهون منها (وزنه بشكل مناسب مقدما مع توازن الكتلة التحليلي) في حل الأيسوبروبانول.
  2. تمييع وخلط الحلول الأسهم في الأيسوبروبانول من أجل إعداد خليط الدهن المطلوب في التركيز النهائي. للفحص المجهري مضان وFRAP التجارب، 0.5٪ بالوزن ره-PE ينبغي أن تدرج في خليط الدهون.
  3. حقن خليط الدهن في الأيسوبروبانول في قناة ميكروفلويديك حتى يمتلئ.
  4. احتضان خليط الدهن على السطح الزجاجي لمدة 10 دقيقة.
  5. تحل تدريجيا محل حل الدهن بمحلول الماء أو العازلة باستخدام مضخة تحوي في معدل تدفق منخفض جدا(10-50 ميكرولتر / دقيقة). بدلا من ذلك، تحل محل خليط الدهن من قبل pipetting المتكررة.
  6. شطف القناة تماما مع العازلة الزائد من أجل إزالة الأيسوبروبانول المتبقية.

2. تشكيل التخصيب نسبة الكولسترول في الدم المعتمدة الأغشية

ملاحظة: سطح صلب (شافي 2) يدعم الانصهار الحويصلة، ولكن تكوين الغشاء (ارتفاع الكوليسترول في الدم) يمنع الانصهار الحويصلة بسبب حويصلات التخصيب الكولسترول وارتفاع الانحناء صلابة 30.

  1. يعد حل الأسهم التي تحتوي على 10 ملغ / مل DOPC الدهون، و 10 ملغ / مل الكولسترول، و1 ملغ / مل ره-PE عن طريق إذابة أولا مساحيق منها في الأيزوبروبانول.
  2. كرر الخطوات من 1،2-1،6 باستخدام حلول الأوراق المالية على استعداد في الخطوة 2.1.

3. غشاء سيولة الفحص

  1. تزج الشريحة الزجاجية في الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) حل (1٪) لمدة 10 دقيقة.
  2. تغسل الشرائح جيدا بالماء منزوع الأيونات وشطف الطرافةح الإيثانول.
  3. ضربة الجافة الشرائح باستخدام تيار لطيف من النيتروجين.
  4. كشف الشرائح إلى البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية على أقصى قدر من قوة الترددات الراديوية في غرفة الأوكسجين البلازما.
  5. إزالة طلاء طبقة واقية من قعر التجاري غرفة ميكروفلويديك (الشكل 1A) باستخدام الملقط وإرفاق شريحة زجاجية على الجانب زجة من الغرفة (الشكل 1B).
  6. تجميع الوصلات والأنابيب في مواقف مدخل ومخرج من الغرفة ووضع قناة ميكروفلويديك على المسرح المجهر (الشكل 1C).
  7. تشكيل طبقة ثنائية الدهون fluorescently المسمى معتمدة في قناة ميكروفلويديك [كرر الخطوة 1 باستخدام تكوين الدهون المطلوب (على سبيل المثال، 0.5 ملغ / مل DOPC) بما في ذلك 0.5٪ بالوزن ره-PE في المذيبات العضوية].
  8. تحديد موقع الطائرة طبقة ثنائية مع الهدف الغمر النفط 60X (NA 1.49) من أجل التقاط الصور.
  9. اتخاذ صورتين قبل التبييض، ثم الصور التبييض 301؛ م بقعة دائرية واسعة مع 532 نانومتر، و 100 ميغاواط شعاع الليزر. قبل photobleaching من، الاحماء ليزر حتى أصبح شدته مستقر. مباشرة بعد photobleaching من، التقاط سلسلة من الصور كل 1 ثانية لمدة 2 دقيقة من أجل متابعة الانتعاش في كثافة مضان في البقعة المبيضة.

4. الكولسترول الكمي الفحص

  1. فضح المغلفة ثاني أكسيد السليكون رقاقة الاستشعار الكوارتز الكريستال لالبلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية على أقصى قدر من قوة الترددات الراديوية في غرفة الأوكسجين البلازما. إزالة شريحة من الغرفة وجبل فورا الشريحة في غرفة القياس.
  2. قبل التجربة، الحصول على أول وتيرة وتبديد للرقاقة الاستشعار في الهواء من أجل ضمان التركيب الصحيح.
    1. لQ-تحسس E1 أو E4 QCM-D أداة التجاري، تشغيل البرنامج Q-لينة وانقر على "شراء" وحدد "قياس الإعداد".
    2. في النافذة الجديدة التي تظهر، والتحقق من 3، 5، 7و 9 و 11 و 13 إيحاءات ثم انقر فوق البحث وتشغيل من أجل التحقق من أطياف الرنين. ضبط درجة الحرارة على 24 ° C. إذا واحد أو أكثر ترددات الرنين لا يتفق مع القيم المتوقعة، والتحقق من شريحة متزايدة وإعادة تنفيذ هذه الخطوة، حتى يتم التوصل إلى اتفاق.
  3. بدء ضخ تحوي وتتدفق حل العازلة (10 ملي تريس، 150 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) في غرفة القياس بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة.
  4. في البرنامج، انقر فوق "شراء" وحدد "إعادة القياس" من أجل تسجيل تردد صدى والطاقة إشارات تبديد. كرر هذه الخطوة حتى يتم الحصول على خط الأساس مستقرة للتردد وتبديد التحولات. ملاحظة: للحصول على خطوات الآخرة، سيكون هناك تردد وتبديد التحولات الإضافية التي يمكن تسجيلها بوصفها وظيفة من الزمن.
  5. حقن الأيزوبروبانول (بدون دهن) لمدة 10 دقيقة.
  6. حقن خليط من DOPC الدهون / الكولسترول فينسبة المولي المطلوب مع تركيز الدهون الكلي 0.5 ملغ / مل في الأيزوبروبانول لمدة 10 دقيقة.
  7. حقن عازلة لمدة 20 دقيقة بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة.
  8. حقن محلول 1 ملي الميثيل β-سيكلودكسترين (MβCD) التي أعدت في المخزن (معدل التدفق 100 ميكرولتر / دقيقة) حتى إشارة التردد تصل قيمة مستقرة.
  9. قياس التحولات تردد الإيجابية النسبية التي يسببها الخطوة العلاج MβCD وحساب كتلة الكوليسترول وDOPC الدهون عن طريق تحويل Δf تشو وΔf DOPC القيم إلى القيم الجماعية باستخدام المعادلة سوربري [Δm = - (C / N) × Δf، حيث C = 17.7 نانوغرام / سم ن: يغلب].
  10. حساب الكسر المولي الكوليسترول في SLB، مع الأخذ بعين الاعتبار الأوزان الجزيئية للDOPC الدهون (786.1 جم / مول) والكولسترول (386.6 جم / مول).

Representative Results

تلفيق من طبقات ثنائية الدهون معتمدة على ركائز ماء.

وقد حاول طرق تشكيل VF وSALB على ثاني أكسيد السيليكون والذهب وعمليات تكوين تم رصدها في الوقت الحقيقي من خلال تقنية قياس QCM-D. وQCM-D تدابير أداة التغييرات في تردد صدى (Δ و) من بلورة الكوارتز كهرضغطية تتأرجح على امتصاص الشامل على سطح البلورة. بالإضافة إلى ذلك، أداة QCM-D يقيس تبديد الطاقة التذبذب من أجل توصيف الخصائص اللزجة (الصلابة والنعومة) من adlayer. وأجريت التجارب الانصهار الحويصلة كما هو موضح سابقا 31. لفترة وجيزة، تم إنشاء خط الأساس الأول لإشارات التردد وتبديد في حل العازلة مائي [10 ملي تريس، 150 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5. (الشكل 2A و B)]. بعد ذلك، كانت unilamellar الحويصلات الدهنية DOPC صغيرة في نفس عازلة فيjected في ر = 10 دقيقة (السهم 1) على ثاني أكسيد السيليكون (الشكل 2A) والذهب (الشكل 2B). لالانصهار الحويصلة على ثاني أكسيد السيليكون، لوحظت من خطوتين حركية امتزاز مع التغييرات الأخيرة في وتيرة والطاقة تبديد -26 (± 1) هرتز و 0.3 (± 0.2) × 10-6، على التوالي. هذه القيم تتفق مع تشكيل طبقة ثنائية الدهون بدعم 29.

كما هو مبين في الشكل 2B، أدت إضافة محلول الحويصلة إلى السطح الذهب إلى انخفاض في وقت واحد والزيادة في إشارات و وΔ Δ على التوالي، حتى بلغت قيمها -150 (± 10) هرتز و (7.5 ± 2) × 10-6، على التوالي. هذه القيم تتوافق مع تشكيل طبقة الحويصلة كثف. وهكذا، كما هو متوقع، لم يكن شكلت SLB على الذهب عن طريق أسلوب الانصهار الحويصلة.

QCيتم تقديم تحليل MD لتشكيل طبقة ثنائية على ثاني أكسيد السيليكون والذهب من خلال طريقة SALB في الشكل 2C وD. على ثاني أكسيد السيليكون، والتحولات و وΔ Δ D النهائية من -25.6 (± 0.55) هرتز و 0.4 (± 0.27) × 10-6، على التوالي، تحققت وهذه القيم تشير تشكيل SLB. وقد لوحظت على الذهب - نطاقات مماثلة Δ F وΔ D (6 0.48 (± 0.26) × 10 Δ و الاتحاد الافريقي:: -27.3 ± 2.7 هرتز، Δ D الاتحاد الافريقي). هذه النتائج تدعم أن طريقة SALB يمكن تشكيل طبقات ثنائية الدهون معتمدة على الأسطح التي تمنع تمزق الحويصلة.

تأثير معدل تدفق المذيبات الصرف على نوعية طبقات ثنائية الدهون المعتمدة.

لتحديد الظروف المثلى لتصنيع ذات جودة عالية مدعومة طبقات ثنائية الدهون السادسعلى طريقة SALB، تم فحص تأثير تركيز الدهون، نسبة المذيب الصرف واختيار المذيبات العضوية.

ويبين الشكل 3 تغير في وتيرة QCM-D خلال الخطوة النهائية للبروتوكول SALB، كما أجريت على ثاني أكسيد السيليكون على اثنين من أسعار مختلفة تدفق (100 و 600 ميكرولتر / دقيقة) واثنين من تركيزات الدهون المختلفة (0.125 و 0.5 ملغ / مل) .

عندما تم استخدام 0.5 ملغ / مل DOPC الدهون (الشكل 3A)، لم يتأثر تشكيل طبقة ثنائية وفقا لمعدل التدفق والتحول Δf النهائي حول -26 هرتز تم الحصول عليها في كل من معدلات التدفق.

على النقيض من ذلك، عندما استخدمت تركيز الدهون أقل، وكمية الدهون كثف بعد تبادل المذيبات الكامل تأثر بشكل كبير من معدل التدفق (الشكل 3B). بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة، وتشكيل طبقة ثنائية كاملة (Δf حول -26 هرتز). ومع ذلك، بمعدل تدفق أعلى 6 أضعاف (600 ميكرولتر / دقيقة)، لم تتشكل طبقة ثنائية كاملة (Δf حول -17 هرتز). وتوفر هذه النتائج توجيهي لاختيار الظروف التجريبية المناسبة لتشكيل طبقة ثنائية ناجحة باستخدام طريقة SALB مع الأيزوبروبانول مثل المذيبات العضوية في الاختيار.

توصيف طبقات ثنائية الدهون بدعم تشكلت من تركيزات الدهون المختلفة في مجال حلول الكحول المختلفة.

تركيز الدهون هو مقياس آخر أن يؤثر على نوعية SLBs التي تم الحصول عليها باستخدام أسلوب SALB. وكشف مضان المجهر أنه في 0.05 ملغ / مل تركيز الدهون، تشكلت فقط معزولة، وهياكل الدهون شبه مجهرية (الشكل 4A). مع زيادة تركيز الدهون المستخدمة في إجراء SALB، أصبحت كثافة مضان من هياكل الدهون أكثر تجانسا. عند 0.1 ملغ / مل تركيز الدهون، كانت هناك بقع الدهون المجهرية على الرغم من أن الهياكل لم تمتد عبر كامل ودرع نظر (الشكل 4B). ومع ذلك، عندما استخدمت 0،25 ملغ / مل تركيز الدهون، تم تشكيل لدهن طبقة ثنائية متجانسة (الشكل 4C). ولذلك، هناك تركيز الدهون الحد الأدنى المطلوب لتشكيل كامل، والتي تمتد كامل SLB.

تمت دراسة تأثير تركيز الدهون على النتيجة النهائية للتجارب SALB أيضا على أوسع نطاق تركيز الدهون (0،01 حتي 5 ملغ / مل) والمذيبات العضوية المختلفة (الأيزوبروبانول، والإيثانول، وN-بروبانول). وتعرض و Δ Δ D والقيم المقابلة إلى الخطوة النهائية في إجراء SALB في الشكل 5.

حددنا تشكيل طبقة ثنائية على أساس التغيرات الأخيرة في التردد والطاقة تبديد بين -25 و -30 هرتز وأقل من 0.5 × 10 -6 على التوالي. وبناء على هذه المعايير، فإن الأمثل نطاق تركيز الدهون لتشكيل وتحديد طبقة ثنائية الدهون بدعم ما بين 0.1 و 0.5 ملغ/ مل مستقلة إلى حد كبير من هذا النوع من المذيبات العضوية. الانحرافات في و Δ المكتسبة وΔ D التحولات خارج النطاق المذكور ويرجع ذلك إلى وجود كتلة إضافية (على سبيل المثال، أكوام طبقة ثنائية)، وقوع الأشكال التضاريسية غير طبقة ثنائية (على سبيل المثال، الحويصلات، مثل دودة المذيلات)، و وجود الجزر طبقة ثنائية مجزأة مع التشكل غير مكتمل عبر الركيزة.

في حين أن إجراء SALB إلى الحصول على طبقات ثنائية الدهون بدعم قوي نسبيا، وتركيز الدهون الأمثل لتشكيل طبقة ثنائية ذات جودة عالية قد تتطلب ضبط اعتمادا على تكوين تجريبي معين. أساسا، ليس هناك سوى تركيز الدهون الحد الأدنى ولكن أيضا تركيز الدهون الحد الأقصى المطلوبة لتشكيل طبقة ثنائية الأمثل من خلال طريقة SALB. مجموعة تركيز الأمثل يعتمد على معدل التدفق ويمكن أيضا أن تتأثر الركيزة والدهون التكوين. تجريبيا، في كثير من الحالات، ونحن قد Fس اوند أن تركيز الدهون من 0،5 ملغ / مل ومعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة هي مجموعة من الظروف الأمثل لتشكيل متجانسة دعم طبقة ثنائية المادة الدهنية. ومع ذلك، اعتمادا على تكوين الدهون وخلايا تدفق الهندسة-وهذه الأخيرة التي تؤثر على تدفق البيانات الشخصية أثناء المذيبات الصرف مزيد من التحسين من تركيز الدهون قد تكون ضرورية. وبالتالي، فإننا نوصي إجراء التجارب الرائدة SALB باستخدام 0.5 ملغ / مل تركيز الدهون وتقييم جودة طبقة ثنائية باستخدام تقنيات المجهر QCM-D أو مضان. في حالة ظهور طبقات ثنائية غير مكتملة، ثم ينبغي زيادة تركيز الدهون في 10٪ زيادات حتى يتم تحقيق نتائج مرضية. إذا ظهرت طبقة ثنائية التعايش مع هياكل الدهون إضافية، ثم يجب أن انخفض تركيز الدهون في 10٪ زيادات حتى يتم تحقيق نتائج مرضية.

تلفيق من طبقات ثنائية الدهون معتمدة مع مختلف مكونات الدهون ودالكسور الكولسترول ifferent.

بعد ذلك، تم توظيف الأساليب SALB وVF من أجل تشكيل SLBs التخصيب الكولسترول الشكل 6 يوضح الصور مضان التمثيلية (100 × 100 ميكرون) من الأغشية التي تحتوي على الكوليسترول بدعم من طريقة SALB إعداد. تتكون أغشية نطاقات استبعاد الصبغة على شكل دائري محاط مرحلة مستمرة تتميز سطوع الفلورسنت موحد. ارتفعت المجالات المظلمة في المنطقة مع زيادة الكولسترول جزء في خليط السلائف الدهون. بعد ذلك، تم إجراء القياسات FRAP من أجل فحص سيولة من الأفلام الدهون طبقة ثنائية. كشفت القياسات FRAP الانتعاش مضان شبه كامل في المرحلة المحيطة، مما يدل على التنقل الجانبي من الدهون، وبالتالي تشكيل طبقة ثنائية الدهن واحدة. منذ أقسام الصحة الإنجابية PE تفضيلي في مرحلة السوائل، والمجالات الداكنة على الأرجح تتألف من الهياكل التخصيب الكولسترول الكثيفة. وعلى سبيل المقارنة، وحاول أيضا تصنيع طبقات ثنائية DOPC / تشول باستخدام طريقة VF. DOPC حويصلات مع زيادة كسور الكولسترول (10-40 مول٪) تم بواسطة طريقة قذف الحويصلة إعدادها. وقد استخدم RH-PE الدهون (0.5٪ بالوزن) كتسمية الفلورسنت للتصوير الشكل 7 يبين الصور مضان التمثيلية (100 × 100 ميكرون) من الهياكل التي تم إنشاؤها على حضانة ركائز الزجاج مع الحويصلات المحتوية على الكولسترول. وأظهر تحليل FRAP تشكيل طبقة ثنائية الدهون الموائعية باستخدام الحويصلات التي تحتوي على 20٪ مول تشول أو أقل. ومع ذلك، باستخدام الحويصلات مع ارتفاع الكوليسترول في الدم كسور لم تظهر الانتعاش، مما يدل على وجود كثف لكن الحويصلات unruptured عينات أعدت.

وكان كميا جزء من الكوليسترول التي تأسست في النهاية إلى طبقات ثنائية الدهون بدعم بوصفها وظيفة من الكسر الكولسترول التي أدرجت في الشفة السلائفخليط معرف في المذيبات العضوية في طريقة SALB أو في الحويصلات في محلول مائي في طريقة VF. باستخدام تقنية QCM-D، تم رصد تشكيل طبقة ثنائية ثم أضيفت MβCD من أجل انتزاع تحديدا تشول من طبقات ثنائية الدهون بدعم 32. خسارة جماعية بسبب إزالة الكوليسترول أدى إلى انخفاض في القيمة المطلقة للتحول التردد (| Δ و |) المرتبطة SLB. وتظهر التحولات تردد الإيجابية النسبية الناجمة عن خطوة العلاج MβCD في الشكل 8A. وقد حسبت الكسر المولي الكولسترول استنادا إلى التحول تردد، كما هو مبين في الشكل 8B.

وكان جزء الكولسترول إدراجها في طبقات ثنائية الدهون التي تدعمها طريقة SALB أعد تقريبا يتناسب خطيا إلى محتويات الكولسترول في خليط السلائف الدهون. ومن المثير للاهتمام، وجزء الكولسترول في طبقات ثنائية من خلال طريقة VF إعداد (حويصلات تحتوي على ما يصل إلىوكانت 20 مول تشول٪) أقل بكثير من تلك الواردة في الحويصلات السلائف. في الواقع، كان أعلى نسبة الكوليسترول التي حصل عليها طريقة VF فقط حوالي 10٪ مول.

مراقبة الشريط العلوي في β-مرحلتين المنطقة التعايش بين الكولسترول فسفوليبيد أيد طبقات ثنائية الدهون.

وأجريت التجارب SALB باستخدام مزيد من خليط الدهون مع نسبة أعلى من الكولسترول. عندما 4: تم استخدام خليط 6 من DOPC والكوليسترول، وdemixing التدريجي من مرحلة السائلة موحدة إلى مرحلتين التعايش تصور كما المجالات على شكل شريط مشرقة في الظلام الخلفية (باستثناء صبغة) لوحظ (الشكل 9). ثبت أن الصحة الإنجابية PE يتم استبعاد من المجالات الغنية بالكوليسترول 33، وبالتالي المجالات السوداء الغالبة التي ظهرت كخلفية هي المناطق التخصيب الكولسترول. تشكيل المجالات ميكرون الحجم مشرق على خلفية داكنة في مرحباGH جزء الكولسترول (> 50٪ مول) يتسق مع المنطقة بيتا في الرسم البياني مرحلة أحادي الطبقة من الكوليسترول / الدهون الفوسفاتية مخاليط 34،35. وعلاوة على ذلك، وتشكيل المجالات شريط، التي تنشأ من ضعف خط التوتر، إلى أن يصبح الخليط بالقرب من نقطة حرجة امتزاج.

الشكل 1
الشكل 1. غرفة الميكروية لتشكيل SALB في تكوين مناسبة لالمجهري epifluorescence. (A) غرفة ميكروفلويديك التجارية، (B) ساترة الزجاج تعلق على الجانب اللاصق للغرفة، (C) الإعداد الكامل على حامل المجهر مع أنابيب متصلة إلى مدخل ومخرج الموانئ من الغرفة، و (D) مضخة تحوي المستخدمة للسيطرة على سعر الصرف المذيبات. يتم حقن الدهون الذائبة في الأيسوبروبانول في تعمدت قياسإيه بمساعدة مضخة تحوي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. تحليل QCM-D الانصهار الحويصلة وSALB تجارب على ثاني أكسيد السيليكون والذهب ركائز. تردد QCM-D (Δf، أزرق) وتبديد (ΔD والأحمر) استجابات لليغلب الثالث (ن = 3) وسجلت على أنها وظيفة من الوقت خلال امتصاص الدهون على (A و C) ثاني أكسيد السيليكون، (B و D) الذهب. لوحات أ و ب يقدم طريقة الانصهار الحويصلة. تم حقن DOPC الحويصلات الدهنية في ر = 10 دقيقة (السهم 1). لوحات جيم ودال تتوافق مع طريقة تشكيل SALB. السهام تشير إلى حقن العازلة (1)، الأيزوبروبانول (2)، مزيج الدهن [0.5 ملغ / مل DOPC الدهون في الأيزوبروبانول. (3)] ​​وبرتقاليتبادل إيه (4). منحنى متقطع في لوحة B يناظر تجربة السيطرة التي لم تحقن الدهون. يتم تحديد القيم النهائية للΔf وΔD لكل السطح. وتشير الخطط والهياكل الدهون تجميعها المقترحة كما يستدل من وتيرة وتبديد التحولات النهائية. مقتبس من إشارة 24 وتستخدم بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تأثير سعر الصرف على المذيبات عملية تشكيل SALB. تم قياس QCM-D التحولات تردد (Δf) الموافق الخطوة النهائية (انظر السهم 4 في الشكل 2C) في طريقة SALB على ثاني أكسيد السيليكون على اثنين من أسعار صرف مختلفة و 100 و 600 ميكرولتر / دقيقة، ش الغناء (A) 0.5 ملغ / مل و (B) 0.125 ملغ / مل DOPC الدهون في الأيزوبروبانول. يتم تحديد القيم Δf النهائية أيضا، بالمقارنة مع خط الأساس قياس في حل العازلة مائي. مقتبس من إشارة 24 وتستخدم بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. عتبة الدهن تركيز لاستكمال SALB تشكيل المجهر epifluorescence من طبقات الدهون على ثاني أكسيد السيليكون التي كتبها SALB إعدادها باستخدام (A) 0.05 ملغ / مل؛ (B) 0.1 ملغ / مل. و (C) 0.25 ملغ / مل تركيز الدهون. مقتبس من إشارة 26 وتستخدم بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. تأثير تركيز الدهون والمذيبات العضوية على دعم تشكيل طبقة ثنائية الدهن بواسطة طريقة SALB. إن التغيرات الأخيرة في QCM-D (A) تردد و (B) تبديد الطاقة للتجارب SALB باستخدام المحاليل العضوية المختلفة، بوصفها وظيفة من الدهون تركيز. الخطوط الخضراء المتقطعة تتوافق مع وتيرة وتبديد التحولات المتوقعة للطبقة ثنائية كاملة (-30 هرتز <Δf <-25 هرتز وΔD <1 × 10 -6). مقتبس من إشارة 26 وتستخدم بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذه فايجوري.

الشكل (6)
الرقم 6. مضان الانتعاش بعد photobleaching من تحليل طبقات ثنائية الدهون معتمدة مع الكسور من الكوليسترول من خلال طريقة SALB على ركيزة الزجاج أعد متفاوتة. الميكروسكوب (AE) الإسفار من طبقات ثنائية أعدت باستخدام مختلف أجزاء الكولسترول في خليط السلائف. وسجلت الصور على الفور (أعلى) و 1 دقيقة (وسط) بعد photobleaching من. البقعة المظلمة في وسط الصورة يناظر المنطقة photobleached. أشرطة مقياس هي 20 ميكرون. وتعرض رسوم بيانية مساحة نطاقات استبعاد الصبغة الفردية داخل كل عينة أيضا (القاع). مقتبس من إشارة 36 وتستخدم بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. تحليل FRAP من طبقات ثنائية تحتوي على الكولسترول بدعم من طريقة الانصهار الحويصلة إعدادها. الميكروسكوب (AD) الإسفار من طبقات ثنائية أعدت باستخدام مختلف أجزاء الكولسترول (10-40 مول٪)، في الحويصلات السلائف. وسجلت الصور على الفور (أعلى) و 1 دقيقة (أسفل) بعد photobleaching من. البقعة المظلمة في وسط الصورة يناظر المنطقة photobleached. أشرطة مقياس هي 20 ميكرون. مقتبس من إشارة 36 وتستخدم بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الرقم 8. تشوantification الكولسترول الكسر في طبقات ثنائية الدهون المعتمدة. (A) وQCM-D تردد تحولا إيجابيا على حقن 1 ملم MβCD على طبقات ثنائية الدهون مدعمة متفاوتة الكسور الخلد الكوليسترول في خليط السلائف (بين 0 و 50٪ مول). (B) الخلد في المئة من الكوليسترول المنضب من طبقات ثنائية من قبل SALB وطرق الانصهار الحويصلة أعدت بوصفها وظيفة من الكسر الكوليسترول في خليط من السلائف أو الحويصلات. مقتبس من إشارة 36 وتستخدم بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9
الرقم 9. الزمان تطور تعتمد مضان المجهرية في طبقة ثنائية معتمد من DOPC / تشول (4: 6 المولي نسبة حساب المشتركining 0.5٪ الرودامين-PE) من خلال طريقة إعداد SALB. مرحلة موحدة تدريجيا مرحلة تفصل في منطقة التعايش بين السوائل عند تبادل المذيبات كاملة. مقتبس من إشارة 37 وتستخدم بإذن من الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذا العمل، وقدم بروتوكول المذيبات الصرف فيها نسبة الدهون في الكحول (الأيزوبروبانول، والإيثانول، أو ن-بروبانول) يتم تحضين مع دعم قوي ثم يتم استبدال الكحول تدريجيا مع حل العازلة مائي من أجل دفع سلسلة والانتقال من مرحلة إنتاج في نهاية المطاف رقائقي المرحلة طبقات ثنائية الدهون 24. وتبين أن طريقة يمكن تصنيع طبقات ثنائية الدهون معتمدة على الأسطح مثل الذهب، وهو مستعصية إلى أسلوب الانصهار الحويصلة.

وقد تم تحديد - (0،5 ملغ / مل 0.1) لتشكيل طبقة ثنائية الكامل في صيغ تجريبية القياسية اختبار حتى الآن أمثل مجموعة تركيز الدهون. بتركيزات الدهون أقل من 0.1 ملغ / مل، منفصلة، ​​بقع مجهرية من طبقات ثنائية تشكيلها. من ناحية أخرى، بتركيزات فوق 0.1 ملغ / مل، وأقل من 0.5 ملغ / مل، وشكلت طبقة ثنائية كاملة وموحدة. بتركيزات الدهون فوق هذا النطاق، وطبقة ثنائية السائل لا يزال كما شكلت verifiإد عن طريق تحليل FRAP، ومع ذلك، يكشف مضان المجهر وجود هياكل الدهون إضافية على أعلى من طبقة ثنائية. لافت للنظر، والتشكل من هذه الهياكل الدهون إضافية، على النحو الذي يحدده التحليل QCM-D، يتوقف على الكحول التي تم استخدامها أثناء الخطوة الحضانة. في حالة الإيثانول، والتحولات عالية نسبيا و وΔ Δ D تشبه التوقيع QCM-D تم الحصول عليها طبقة الحويصلة كثف. عندما استخدمت الأيسوبروبانول أو N-بروبانول بدلا من ذلك، كانت و Δ أعلى قليلا من القيمة المتوقعة لطبقة ثنائية Δ النهائية بين -30 إلى -40 هرتز)، في حين كان Δ D أعلى بشكل ملحوظ. يتوقع مثل هذه الردود QCM-D لهياكل الدهون طويلة (على سبيل المثال، المذيلات تشبه دودة) جاحظ الخارج من سطح غشاء (كما مرئية بواسطة المجهر مضان في بعض الحالات).

سعر الصرف المذيبات هو معلمة هامة أخرى والتي يمكن أن تكون حاسمة، especially عندما يتم استخدام أقل تركيز الدهون (على سبيل المثال، 0.1 ملغ / مل). صرف المذيبات السريع في تركيز منخفض الدهون يمكن أن يؤدي إلى تشكيل طبقات ثنائية غير مكتملة. في غرفة القياس المعيارية المستخدمة لقياس QCM-D في هذه الورقة (Q-تحسس E4 قياس الغرفة)، ومعدلات تدفق نحو 100 ميكرولتر / دقيقة، وكانت مناسبة لتشكيل طبقة ثنائية كاملة تكرار للغاية. لتدفق الخلايا مع هندستها وحجم أخرى، قد معدل التدفق الأمثل تختلف ويجب أن تحدد تجريبيا يعتمد على الخطوات المقترحة في هذه الوثيقة.

بالإضافة إلى تشكيل طبقات ثنائية الدهون معتمدة على الأسطح التي هي مستعصية على الانصهار الحويصلة، وSALB يمكن استخدامها للتحايل على الحاجة إلى الحويصلات الدهنية التي يمكن أن تمزق، وبالتالي فتح الباب لتصنيع الأغشية معتمدة مع تركيبة معقدة. كمثال توضيحي التكوين، تم فحص خليط من الدهون مع جزء كبير من الكولسترول. الكولسترول هو عنصر هام من mammعليان أغشية الخلايا، والكسر يمكن الاقتراب 45-50 مول٪ من تكوين الدهون غشاء (على سبيل المثال، في الكريات الحمراء). وبالتالي، يجب حتى نموذج بسيط من طبقة ثنائية الدهون يمثل غشاء الخلية البشرية تشمل الكوليسترول في الدم.

في حين الانصهار الحويصلة يمكن استخدامها لصنع طبقات ثنائية الدهون الموائعية تحتوي على 10-15٪ فقط الكوليسترول في الدم، وطريقة SALB يمكن تشكيل طبقات ثنائية الدهون الموائعية تحتوي على كسور عالية من الكوليسترول (ما يصل الى 57٪ مول، كما كميا بواسطة القياسات QCM-D) 36. ومع ذلك، عندما تم رفع مستوى الكولسترول كذلك (إلى 63٪ مول)، وقد لوحظت المجالات شريط شكل 37. وكانت نطاقات تتعايش السائل، تذكرنا تلك التي لوحظت في المنطقة β في الرسم البياني مرحلة من مراحل أحادي الطبقة الكوليسترول / الدهون الفوسفاتية في واجهة بين الهواء والماء.

عموما، يتم عرض طريقة SALB أن تكون مقاربة بسيطة وفعالة لتشكيل طبقات ثنائية الدهون المعتمدة، وخصوصا طحالات ن خارج نطاق التقليدية طريقة الانصهار الحويصلة. حتى الآن، تم استخدام QCM-D تقنية ومضان المجهر أساسا لوصف طبقات ثنائية الدهون بدعم شكلتها طريقة SALB. نتطلع، مجموعة واسعة من القياسات التحليلية تقنيات حساسة للسطح، بما في ذلك الرنين مأكل السطح (SPR) 38، قوة المجهر الذري (AFM) 39،40، فورييه تحويل مطياف الأشعة تحت الحمراء 41، والأشعة X 42 والنيوترون انعكاسية 43 يمكن، استخدامها لمزيد من تميز ودراسة تكوينات طبقة ثنائية بسيطة ومعقدة تعد من طريقة SALB. هذه القدرات الناشئة تفتح الباب أمام عدد أكبر من العلماء الذين يمكن استكشاف أغشية الخلايا الاصطناعية من خلال الاستفادة من بروتوكول تجريبي بسيط وقوي.

Acknowledgments

الكتاب نود أن نعترف بدعم من مؤسسة البحوث الوطنية (جبهة الخلاص الوطني -NRFF2011-01 وNRF2015NRF-POC0001-19)، المجلس الوطني للبحوث الطبية (NMRC / CBRG / 0005/2012)، وجامعة نانيانغ التكنولوجية لNJC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QCM-D silicon dioxide-coated substrates QSense AB,  Sweden
QCM-D gold-coated substrates QSense AB,  Sweden
Q-Sense E4 module QSense AB,  Sweden
Plasma Cleaner, PDC-32G Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) Avanti Polar Lipids 810150P
cholesterol Avanti Polar Lipids 700000P
Methyl-β-cyclodextrin Sigma  C4555
Isopropanol Sigma  673773
Ethanol Sigma  459844
n-propanol Sigma  279544
Sticky-Slide I 0.1 Luer IBIDI 81128
Male elbow 1/8” Cole-Parmer 30505-70
Silicon tubing 1.6 mm ID IBIDI 10842
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm IBIDI 10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump Ismatec
Sodium dodecyl sulfate Sigma  71725

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sackmann, E. Supported membranes: Scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
  2. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry. Science. 313, 1948-1951 (2006).
  3. Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy. Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).
  4. Bally, M., et al. Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers. Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).
  5. Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis. Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).
  6. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication. Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.
  7. Mager, M. D., Melosh, N. A. Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse. Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).
  8. Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns. Small. 3, 71-75 (2007).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).
  11. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers. Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).
  12. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).
  13. Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  14. Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration. Thin Solid Films. 495-4246 (2006).
  15. Stanglmaier, S., et al. Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).
  16. Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports. Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).
  17. Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material. Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).
  18. Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2. Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).
  19. Hardy, G. J., et al. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).
  20. Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica. European Biophysics Journal. 1-10 (2014).
  21. Coutable, A., et al. Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression. Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).
  22. Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers. The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).
  23. Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment. Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).
  24. Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold. Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).
  25. Hohner, A., David, M., Rädlera, J. Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces. Biointerphases. 5, 1-8 (2010).
  26. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes. Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).
  27. Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation. Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. (2015).
  28. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer. Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  29. Keller, C., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
  30. Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).
  31. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).
  32. Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).
  33. Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer. Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).
  34. Okonogi, T., McConnell, H. Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers. Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).
  35. McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. Condensed complexes of cholesterol and phospholipids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).
  36. Tabaei, S. R., et al. Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly. Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).
  37. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes. Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).
  38. Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1195-11267 (1994).
  39. Yuan, C., Johnston, L. Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies. Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).
  40. Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).
  41. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).
  42. Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity. Physical Review Letters. 94, 238104 (2005).
  43. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).
غشاء حيوي تلفيق من المذيبات بمساعدة الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).More

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter