我们提出了一个试验性协议,形成对固体基质支持的脂质双层不使用脂质囊。我们展示了一个一步法,以形成具有各种生物应用胆固醇富集域上的二氧化硅和金脂质双层以及支持膜。
为了模仿细胞膜,所支持的脂质双层(SLB)是一个有吸引力的平台使在膜相关过程的体外调查而赋予的生物相容性和生物功能,以固体基质。磷脂小泡的自发吸附和破裂是最常用的方法来形成的SLBs。然而,在生理条件下,囊泡融合(VF)被限制在脂质组合物和固体载体的一个子集。这里,我们描述为了形成SLBs的,它不需要囊泡一个称为溶剂辅助脂质双层(SALB)的形成方法的一个步骤的一般方法。所述SALB方法以触发SLB形成包括脂质分子上的沉积,在水混溶的有机溶剂(例如,异丙醇)中,用缓冲水溶液后续溶剂交换的存在下的固体表面。连续的溶剂交换步骤使应用程序的方法在适合于监视双层形成和使用范围广泛的表面敏感的生物传感器进一步修改的流通配置。所述SALB方法可被用于制造SLBs的就广泛亲水固体表面,包括那些棘手到囊泡融合的。此外,它使SLBs的脂质组合物的构成不能使用的囊泡融合方法制备的制造。在此,我们比较有两个说明性的亲水性的表面,二氧化硅和黄金SALB和常规囊泡融合方法得到的结果。为了优化实验条件用于制备经由SALB方法制备高品质双层,各种参数,包括有机溶剂在沉积步骤的类型,溶剂交换的速率,和脂质浓度的效果连同故障排除提示讨论。含胆固醇高的分数支持膜的形成也是魔鬼trated与SALB方法,突出SALB技术的技术能力,适用范围广的膜配置。
固体支持的脂质双层1(SLB)是一种多功能的平台,其保留生物膜的基本特性,如双层厚度,二维脂质扩散率,和主机膜相关的生物分子的能力。由于天然细胞膜的复杂性,这个简单的平台已经显示用作用于体外研究膜相关的处理的诸如筏形成2,蛋白质的高效平台结合3,病毒和病毒样颗粒的结合4,5-和细胞信号6。形成在靠近固体支持物,所述SLB平台是与一系列的表面敏感的测量技术相容如全内反射显微镜(TIRF),石英晶体微天平耗散(QCM-D)和阻抗谱。
几种方法已经被开发,以生产不同类型的SLBs的,包括气泡崩7和蘸笔纳米光刻8为亚微米尺寸的脂质斑点,旋涂为双层堆叠和LB膜(LB)10和囊泡融合(VF)11,用于全跨越,单脂质双层涂层9。在VF方法包括小单层囊泡吸附到固体支持物和随后的自发破裂和熔化,形成连续的脂质双层。然而,在生理条件下,自发囊泡破裂主要限于硅系材料,如二氧化硅,玻璃,和云母。此外,泡囊破裂不会发生自发为复合脂质组合物的囊泡,例如含有胆甾醇或带负电荷的脂质的高级分。根据不同的系统,囊泡破裂可通过进一步剪裁实验条件,如温度12,溶液的pH值13,和盐度14,渗透压休克15被诱导</s向上>或压力16,或添加二价离子如钙离子的17,另外,在膜的活性AH肽可以破坏的层吸附囊泡被引入,导致小泡破裂和双层形成在一系列表面18-22。
此外,成功的双层形成需要制备的小单层囊泡,可以是耗时且难以实现的某些膜的组合物良好控制的人口。因此,尽管其高效率的最佳情况下(例如,后囊23的广泛冻融预处理),囊泡融合的一般应用由合适的底物和膜组合物的范围的限制。
的溶剂辅助脂质双层(SALB)方法24-28是一种替代的制造技术,它不需要的脂质囊泡。该方法是基于沉积Ô˚F脂质分子上在与水混溶的有机溶剂后用此溶剂与以触发SLB形成缓冲水溶液逐渐交换的存在下的固体表面。在溶剂交换步骤,脂质,有机溶剂的三元混合物,和水进行一系列相变而增加水部分,这导致层状相的结构在本体溶液的形成和SLB固体基材上。重要的是,该自组装的路线绕过需要囊泡破裂,这通常是用于吸附囊泡转变成一个SLB限制步骤。该协议是适用于多种表面,包括二氧化硅,氧化铝,铬,铟锡氧化物,和金的。在本文和在所附的视频,脂质沉积由SALB和囊泡融合方法进行了比较,提出。特别是,实验参数的影响,包括脂浓度,流量,和水混溶性有机溶剂的选择,由所述SALB法形成的双层的质量进行了讨论。所制造的SLBs的分析表征由QCM-D,荧光显微镜,荧光漂白恢复(FRAP)技术之后进行。 QCM-D监测是,由于由Keller和Kasemo 29进行的开创性工作,已被广泛用于定量研究双层形成一个表面感光质量测量的技术。荧光显微镜允许膜均一性的检查以及膜结构域的可视化。的FRAP技术是一个标准的工具,以确定在SLB,这是流体膜的一个重要性质脂质分子的横向流动。
该研究的第一部分涉及SALB应用到试图对二氧化硅和金双层形成的QCM-D分析和囊泡融合的方法。在第二部分中,的制备方法和含有一个范围胆固醇浓度与SALB方法的支持膜表征演示了,结果与那些由囊泡融合方法获得了比较。
在这项工作中,溶剂交换协议被提出,其中脂类在醇(异丙醇,乙醇或正丙醇)温育与固体载体上,然后将醇逐渐取代用含水缓冲溶液中,以驱动一系列相变的最终生产层状相脂质双层24。它表明,该方法使得能够支持的脂质双层的制造在表面上,例如金,它是顽固性的囊泡融合方法。
最佳的脂质浓度范围(0.1 – 0.5毫克/毫升)已被确定为完整双层形成在标准实验格式测试迄今。在低于0.1毫克/毫升,离散的,微观双层的补丁血脂浓度而形成的。另一方面,在浓度高于0.1毫克/毫升和低于0.5毫克/毫升,一个完整而均匀的双层形成。在高于该范围血脂浓度,流体双层仍形成为的核查通过FRAP分析编,但是,荧光显微镜揭示的额外脂质结构上该双层的顶部的存在。引人注目的是,这些附加的脂质结构的形态,如由QCM-D分析确定,取决于在其上在培养步骤中使用的醇。在乙醇的情况下,相对高的Δf和Δð移类似于用于吸附囊泡层得到的QCM-D签名。当异丙醇或正丙醇代替所使用的,Δτf为比预期的双层(-30至-40赫兹最终ΔF)的值略高,而ΔD为相当高的。这样的QCM-D响应将预期用于扩展脂质结构(例如,蠕虫状胶束)从膜表面向外突出(如通过在某些情况下,荧光显微镜可见)。
溶剂交换的速率可以是临界的另一个重要参数,ESPECially当低血脂浓度( 例如,0.1毫克/毫升)使用。在低浓度的脂质快速溶剂交换可导致不完全的双层的形成。在用于本文的QCM-D测量(Q-感E4测量室),约100微升/分钟的流速的标准测量室,均适宜高度可重复的完整双层形成。对于流细胞与其他的几何形状和体积,最佳流速可以变化,并且基于本文提出的步骤必须根据经验确定。
除了形成支持的脂质双层上的表面是难治到囊泡融合,所述SALB可以被用来规避需要脂质囊泡可破裂,从而打开门支持膜具有复杂的组合物的制造。作为说明性实例组合物,与胆甾醇的高分数的脂质的混合物进行了研究。胆固醇是mamm的重要组成部分阿莲细胞膜,它的分数可能接近45-50%(摩尔)的膜脂组成(如红细胞)。因此,脂质双层的代表人体细胞膜即使一个简单的模型应该包括胆固醇。
而小泡的融合可以用于制造仅含有10-15%的胆固醇的流体脂质双层,该SALB方法能够形成含胆固醇的高分数的流体脂质双层(高达57%(摩尔),作为量化的QCM-D测量)36。但是,当胆甾醇的水平进一步升高(最多63摩尔%),条纹形状结构域观察到37。共存的结构域是液体,使人联想起在空气 – 水界面中的β区观察到胆固醇/磷脂单层的相图。
总体而言,SALB方法证明是一种简单而有效的方法,以形成支持的脂质双层,尤其是我n个个案超出常规的囊泡融合方法的范围。迄今为止,QCM-D技术和荧光显微镜主要用来表征由SALB方法形成的支持的脂质双层。展望未来,范围广泛的表面敏感分析测量技术,包括表面等离子共振(SPR)38,原子力显微镜(AFM)39,40,傅立叶变换红外光谱41,X射线42和中子反射率43,可以可用于进一步表征和研究简单和复杂的双层结构准备由SALB方法。这些新兴的功能,打开大门,更多的科学家谁可以采取一个简单而强大的实验方案的优势,探索人工细胞膜。
The authors have nothing to disclose.
作者们希望从国家研究基金会(NRF -NRFF2011-01和NRF2015NRF-POC0001-19),国家医学研究理事会(NMRC / CBRG / 0005/2012),和南洋理工大学NJC感谢支持
QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Isopropanol | Sigma | 673773 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
n-propanol | Sigma | 279544 | |
Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
Silicon tubing 1.6mm ID | IBIDI | 10842 | |
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |