אנו מציגים פרוטוקול ניסוי ליצירת bilayer שומנים נתמך על מצעים מוצקים ללא שימוש בשלפוחית שומנים. אנו מדגימים שיטת צעד אחד כדי ליצור bilayer שומנים על סיליקון דו חמצני וזהב, כמו גם קרומים נתמכים עם תחום מועשר כולסטרול עבור יישומים ביולוגיים שונים.
כדי לחקות קרום תא, bilayer תמך השומנים (SLB) הוא פלטפורמה אטרקטיבית המאפשרת בחקירת מבחנה של תהליכים הקשורים קרום תוך הענקת התאמה ביולוגית וbiofunctionality למצעים מוצקים. הספיחה והקרע הספונטנית של שלפוחית פוספוליפידים הוא השיטה הנפוצה ביותר ליצירת SLBs. עם זאת, בתנאים פיסיולוגיים, איחוי שלפוחית (VF) מוגבל לרק קבוצת משנה של קומפוזיציות שומנים ותומכים מוצקים. כאן אנו מתארים הליך כללי צעד אחד נקרא שיטת היווצרות bilayer שומנים בסיוע ממס (SALB) כדי ליצור SLBs אשר אינו דורש שלפוחית. שיטת SALB כרוכה בתצהיר של מולקולות שומנים על גבי משטח מוצק בנוכחות ממסים מים בליל אורגני (למשל, isopropanol) וממס מטבע הבא עם פתרון חיץ המימי כדי לעורר היווצרות SLB. צעד חילופי הממס הרציף מאפשר יישום שלשיטה בתצורת זרימה דרך מתאימה להיווצרות bilayer ניטור ושינויים שלאחר מכן באמצעות מגוון רחב של חיישני משטח רגיש. שיטת SALB יכולה לשמש כדי לפברק SLBs על מגוון רחב של משטחים מוצקים הידרופילי, כוללים אלה שהם סוררים לאיחוי שלפוחית. בנוסף, היא מאפשרת ייצור של SLBs המורכב מיצירות שומנים שלא יכול להיות מוכן תוך שימוש בשיטת איחוי שלפוחית. בזאת, אנו להשוות את התוצאות שהושגו עם שיטות איחוי שלפוחית SALB וקונבנציונליות על שני משטחים הידרופילי המחשה, דו תחמוצת צורן וזהב. כדי לייעל את תנאי ניסוי להכנת bilayers באיכות גבוהה שהוכנה באמצעות שיטת SALB, את ההשפעה של פרמטרים שונים, כוללים הסוג של ממס אורגני בצעד התצהיר, שערי מטבע ממס, וריכוז השומנים נדונה יחד עם עצות לפתרון בעיות . היווצרות קרום נתמך המכיל שברים גבוהים של כולסטרול היא גם שדיםtrated עם שיטת SALB, המדגיש את היכולות הטכניות של טכניקת SALB למגוון רחב של תצורות קרום.
Bilayer הנתמך המוצק השומנים 1 (SLB) הוא פלטפורמה רב-תכליתית המשמרת את המאפיינים הבסיסיים של ביו-ממברנות כגון עובי bilayer, diffusivity שומנים דו-ממדי, ואת היכולת לארח מולקולות ביולוגיות הקשורים קרום. בשל המורכבות של קרום תא טבעי, פלטפורמה פשוטה זה הוכחה לתפקד כפלטפורמה יעילה לבדיקות במבחנה של תהליכים הקשורים להיווצרות קרום כמו רפסודה 2, חלבון מחייבת 3, וירוס והחלקיקים דמויי וירוס מחייבים 4,5 , ותא איתות 6. נוצר בסמיכות לתמיכה מוצקה, פלטפורמת SLB תואמת עם מגוון רחב של טכניקות מדידות משטח רגיש כגון מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות הפנימית (TIRF), microbalance-פיזור קוורץ קריסטל (QCM-D), וספקטרוסקופיה עכבה.
כמה שיטות פותחו כדי לייצר סוגים שונים של SLBs, כוללים בועות אווירהקריסה 7 ולטבול-עט nanolithography 8 לכתמי submicron בגודל שומנים בדם, 9 לערימות bilayer ואנגמיור-באגט (LB) 10 ואיחוי שלפוחית (VF) 11 למלאים פורש, ציפויי bilayer שומנים חד ציפוי ספין. שיטת VF מורכבת מהספיחה של שלפוחית unilamellar הקטנה לתמיכה מוצקה וקרע ספונטני שלאחר מכן והיתוך ליצירת bilayer שומנים רציף. עם זאת, בתנאים פיסיולוגיים, קרע שלפוחית ספונטנית מוגבל בעיקר לחומרים מבוססי סיליקון כגון דו תחמוצת צורן, זכוכית, ויציצו. בנוסף, קרע שלפוחית אינו מתרחש באופן ספונטני לשלפוחית של קומפוזיציות שומנים מורכבות כגון אלה המכילים שברים גבוהים של כולסטרול או שומנים טעונים שלילי. בהתאם למערכת, קרע שלפוחית עלול להיגרם על ידי התאמה נוספת תנאי הניסוי כגון טמפרטורה 12, pH פתרון 13, ומליחות 14, הלם האוסמוטי 15 </sעד> או לחץ 16, או תוספת של יונים דו ערכיים כגון Ca 2 + 17. לחלופין, פפטיד AH-הקרום פעיל יכול להיות הציג על מנת לערער את יציבות שכבה של שלפוחית adsorbed, שהוביל לקרע שלפוחית והיווצרות bilayer במגוון משטחי 18-22.
יתר על כן, היווצרות bilayer מוצלחת דורשת הכנה של אוכלוסייה מבוקרת היטב של שלפוחית unilamellar הקטנה שיכול להיות זמן רב וקשה להשגה ליצירות קרום מסוימות. לכן, למרות יעילותו הגבוהה במקרים אופטימליים (למשל, לאחר טיפול מקדים להקפיא להפשיר נרחב של שלפוחית 23), היישום הכללי של איחוי שלפוחית מוגבל על ידי היקף מצעים מתאימים ויצירות קרום.
שיטת bilayer שומנים בסיוע הממס (SALB) 24-28 היא טכניקת ייצור חלופית שאינו דורשת שלפוחית שומנים. השיטה מבוססת על o התצהירמולקולות שומנים ו על גבי משטח מוצק בנוכחות של ממס אורגני בליל מים ואחרי חילופי הדרגתיים של ממס זה עם פתרון חיץ המימי כדי לעורר היווצרות SLB. במהלך שלב ממס לבורסה, התערובת משולשת של שומנים, ממס אורגני, ומים עובר שלב מעברי סדרה עם הגדלת חלק מים, מה שמוביל להיווצרות של מבני שלב שבשבת בפתרון התפזורת וSLB על המצע המוצק. חשוב לציין, מסלול הרכבה עצמית זו עוקף את הצורך בקרע שלפוחית, שהיא בדרך כלל הצעד המגביל להפיכתו של שלפוחית adsorbed לSLB. הפרוטוקול חל על מגוון רחב של משטחים הכוללים דו תחמוצת צורן, תחמוצת אלומיניום, כרום, תחמוצת אינדיום בדיל, וזהב. במאמר זה ובוידאו המצורף, השוואה של תצהיר שומנים על ידי SALB ושיטות איחוי השלפוחית מוצגת. בפרט, ריכוז שומנים בדם ההשפעה של פרמטרים ניסיוניים, כולל, קצב זרימה, ואת הבחירה של ממס אורגני בליל מים, על איכות bilayer נוצר על ידי שיטת SALB הם דנו. אפיון אנליטי של SLBs המפוברק מבוצע על ידי QCM-D, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, והתאוששות הקרינה לאחר photobleaching טכניקות (FRAP). ניטור QCM-D הוא טכניקת מדידת מסת משטח רגיש ש, מאז עבודתו החלוצית בניצוחו של קלר וKasemo 29, כבר נעשה שימוש נרחב לחקור היווצרות bilayer כמותית. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר בדיקה של הומוגניות קרום, כמו גם להדמיה של תחומים קרום. טכניקת FRAP היא כלי סטנדרטי כדי לקבוע את הניידות לרוחב של מולקולות שומנים בSLB, שהוא רכוש חיוני של קרומי fluidic.
החלק הראשון של מחקר זה כרוך ניתוח QCM-D של SALB ושיטות איחוי שלפוחית מיושם לנסות היווצרות bilayer על סיליקון דו חמצני וזהב. בחלקו השני,ההכנה והאפיון של קרומים נתמכים המכילים מגוון רחב של ריכוזי כולסטרול בשיטת SALB הם הפגינו והתוצאות בהשוואה לאלו שהושגו בשיטת איחוי שלפוחית.
בעבודה זו, פרוטוקול ממס מטבע מוצג בי שומנים באלכוהול (isopropanol, אתנול, או n-propanol) מודגרת עם תמיכה מוצקה ולאחר מכן האלכוהול מוחלף בהדרגה עם פתרון חיץ המימי כדי לנהוג בסדרה מעברי שלב ייצור סופו של דבר bilayers שומנים שבשבת-שלב 24. הוא הראה כי השיטה מאפשרת ייצור של bilayers שומנים הנתמכים על משטחים כגון זהב, שהוא בלתי פתיר לשיטת איחוי שלפוחית.
טווח ריכוז שומנים בדם אופטימלי (0.1-0.5 מ"ג / מיליליטר) נקבע להיווצרות bilayer מלאה בפורמטים סטנדרטיים ניסיוניים נבדקו עד כה. בריכוזים שומנים בדם מתחת 0.1 מ"ג / מיליליטר, תיקונים בדידים, מיקרוסקופיים של bilayers נוצר. מצד השני, בריכוזים מעל 0.1 מ"ג / מ"ל ונמוך מ -0.5 מ"ג / מיליליטר, bilayer מלא והאחיד נוצר. בריכוזים שומנים מעל לטווח זה, bilayer נוזל עדיין נוצר כverifiאד על ידי ניתוח FRAP, עם זאת, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה הנוכחות של מבני שומנים נוספים בחלק העליון של bilayer. באופן מפתיע, את המורפולוגיה של מבני שומנים נוספים אלה, כפי שנקבע על ידי ניתוח QCM-D, הייתה תלויה באלכוהול שהיה בשימוש בשלב הדגירה. במקרה של אתנול, משמרות F וΔ Δ D גבוהות יחסית דומות חתימת QCM-D המתקבלת לשכבת שלפוחית adsorbed. כאשר isopropanol או n-propanol שימשה במקום, ו Δ היה מעט גבוה יותר מהערך הצפוי לbilayer (ו Δ סופי בין -30 ל -40 הרץ), ואילו Δ D היה ניכר גבוה יותר. תגובות QCM-D כזה יהיו צפויים למבנים מורחבים שומנים (למשל, מיצלות כמו תולעת-) הבולטים החוצה ממשטח הקרום (כגלוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחלק ממקרים).
שער חליפי ממס הוא פרמטר חשוב נוסף שיכול להיות קריטי, especially כאשר ריכוזים נמוכים יותר שומנים (למשל, 0.1 מ"ג / מיליליטר) משמשים. חילופי ממס מהירים בריכוז שומנים בדם נמוך יכולים להוביל להיווצרות של bilayers שלמה. בתא המדידה הסטנדרטי המשמש למדידות QCM-D במאמר זה (קאמרי מדידת Q-Sense E4), ספיקות של כ -100 μl / דקה, היו מתאימים להיווצרות bilayer מלאה מאוד לשחזור. לתאי זרימה בגיאומטריות ונפח אחרים, קצב הזרימה האופטימלי עשוי להשתנות וחייב באופן אמפירי ייקבע על פי הצעדים הציעו במסמך זה.
בנוסף ליצירת bilayers שומנים נתמך על משטחים שהם סוררים לאיחוי שלפוחית, יכול להיות מועסק SALB לעקוף את הצורך בשלפוחית שומנים שיכולים להיקרע, ובכך לפתוח את הדלת לייצור של ממברנות נתמכות עם קומפוזיציות מורכבות. כדוגמה להמחשת הרכב, תערובות שומנים בחלק גבוה של כולסטרול נבדקו. כולסטרול הוא מרכיב חשוב של mammעליאן קרום תא, והחלק שלה יכולים להתקרב 45-50% mol של הרכב השומנים קרום (למשל, באריתרוציטים). לכן, גם מודל פשוט של bilayer שומנים המייצגים קרום תא אנושי צריך לכלול כולסטרול.
בעוד איחוי שלפוחית יכול לשמש כדי לפברק bilayers השומנים fluidic מכיל כולסטרול רק 10-15%, שיטת SALB מאפשרת היווצרות של bilayers השומנים fluidic מכיל שברים גבוהים של כולסטרול (עד 57% mol, כלכמת ידי מדידות QCM-D) 36. עם זאת, כאשר רמת הכולסטרול הייתה גבוהה עוד יותר (עד 63% mol), תחומים פס-צורה נצפו 37. תחומים קיימים השותף היו נוזליים, מזכיר אלו שנצפו באזור β בתרשים השלב של monolayer כולסטרול / פוספוליפידים בממשק אוויר מים.
בסך הכל, שיטת SALB מוצג להיות גישה פשוטה ויעילה ליצירת bilayers שומנים נתמך, במיוחד אנימקרי n מעבר להיקף של שיטת איחוי שלפוחית הקונבנציונלית. עד כה, מיקרוסקופיה הטכניקה וקרינת QCM-D שימשה בעיקר כדי לאפיין את bilayers השומנים הנתמכים נוצרים על ידי שיטת SALB. במבט קדימה, במגוון רחב של טכניקות מדידות אנליטיות משטח רגיש, כוללים תהודת plasmon פני השטח (SPR) 38, במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 39,40, פורייה-להפוך ספקטרוסקופיה אינפרא אדום 41, רנטגן 42 ורפלקטיביות ניטרונים 43 יכול, לשמש כדי להמשיך ולאפיין וללמוד תצורות bilayer פשוטות ומורכבות להכין בשיטת SALB. יכולות אלה מתפתחים לפתוח את הדלת למספר גדול יותר של מדענים שיכולים לחקור קרום תא מלאכותי על ידי ניצול של פרוטוקול ניסוי פשוט וחזק.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות תמיכה מהקרן הלאומית למחקר (NRF -NRFF2011-01 וNRF2015NRF-POC0001-19), המועצה למחקר הרפואי הלאומי (NMRC / CBRG / 0005/2012), והאוניברסיטה הטכנולוגית נניאנג לNJC
QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Isopropanol | Sigma | 673773 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
n-propanol | Sigma | 279544 | |
Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
Silicon tubing 1.6mm ID | IBIDI | 10842 | |
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |