Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

doi: 10.3791/53073 Published: December 1, 2015

Summary

אנו מציגים פרוטוקול ניסוי ליצירת bilayer שומנים נתמך על מצעים מוצקים ללא שימוש בשלפוחית ​​שומנים. אנו מדגימים שיטת צעד אחד כדי ליצור bilayer שומנים על סיליקון דו חמצני וזהב, כמו גם קרומים נתמכים עם תחום מועשר כולסטרול עבור יישומים ביולוגיים שונים.

Abstract

כדי לחקות קרום תא, bilayer תמך השומנים (SLB) הוא פלטפורמה אטרקטיבית המאפשרת בחקירת מבחנה של תהליכים הקשורים קרום תוך הענקת התאמה ביולוגית וbiofunctionality למצעים מוצקים. הספיחה והקרע הספונטנית של שלפוחית ​​פוספוליפידים הוא השיטה הנפוצה ביותר ליצירת SLBs. עם זאת, בתנאים פיסיולוגיים, איחוי שלפוחית ​​(VF) מוגבל לרק קבוצת משנה של קומפוזיציות שומנים ותומכים מוצקים. כאן אנו מתארים הליך כללי צעד אחד נקרא שיטת היווצרות bilayer שומנים בסיוע ממס (SALB) כדי ליצור SLBs אשר אינו דורש שלפוחית. שיטת SALB כרוכה בתצהיר של מולקולות שומנים על גבי משטח מוצק בנוכחות ממסים מים בליל אורגני (למשל, isopropanol) וממס מטבע הבא עם פתרון חיץ המימי כדי לעורר היווצרות SLB. צעד חילופי הממס הרציף מאפשר יישום שלשיטה בתצורת זרימה דרך מתאימה להיווצרות bilayer ניטור ושינויים שלאחר מכן באמצעות מגוון רחב של חיישני משטח רגיש. שיטת SALB יכולה לשמש כדי לפברק SLBs על מגוון רחב של משטחים מוצקים הידרופילי, כוללים אלה שהם סוררים לאיחוי שלפוחית. בנוסף, היא מאפשרת ייצור של SLBs המורכב מיצירות שומנים שלא יכול להיות מוכן תוך שימוש בשיטת איחוי שלפוחית. בזאת, אנו להשוות את התוצאות שהושגו עם שיטות איחוי שלפוחית ​​SALB וקונבנציונליות על שני משטחים הידרופילי המחשה, דו תחמוצת צורן וזהב. כדי לייעל את תנאי ניסוי להכנת bilayers באיכות גבוהה שהוכנה באמצעות שיטת SALB, את ההשפעה של פרמטרים שונים, כוללים הסוג של ממס אורגני בצעד התצהיר, שערי מטבע ממס, וריכוז השומנים נדונה יחד עם עצות לפתרון בעיות . היווצרות קרום נתמך המכיל שברים גבוהים של כולסטרול היא גם שדיםtrated עם שיטת SALB, המדגיש את היכולות הטכניות של טכניקת SALB למגוון רחב של תצורות קרום.

Introduction

Bilayer הנתמך המוצק השומנים 1 (SLB) הוא פלטפורמה רב-תכליתית המשמרת את המאפיינים הבסיסיים של ביו-ממברנות כגון עובי bilayer, diffusivity שומנים דו-ממדי, ואת היכולת לארח מולקולות ביולוגיות הקשורים קרום. בשל המורכבות של קרום תא טבעי, פלטפורמה פשוטה זה הוכחה לתפקד כפלטפורמה יעילה לבדיקות במבחנה של תהליכים הקשורים להיווצרות קרום כמו רפסודה 2, חלבון מחייבת 3, וירוס והחלקיקים דמויי וירוס מחייבים 4,5 , ותא איתות 6. נוצר בסמיכות לתמיכה מוצקה, פלטפורמת SLB תואמת עם מגוון רחב של טכניקות מדידות משטח רגיש כגון מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות הפנימית (TIRF), microbalance-פיזור קוורץ קריסטל (QCM-D), וספקטרוסקופיה עכבה.

כמה שיטות פותחו כדי לייצר סוגים שונים של SLBs, כוללים בועות אווירהקריסה 7 ולטבול-עט nanolithography 8 לכתמי submicron בגודל שומנים בדם, 9 לערימות bilayer ואנגמיור-באגט (LB) 10 ואיחוי שלפוחית ​​(VF) 11 למלאים פורש, ציפויי bilayer שומנים חד ציפוי ספין. שיטת VF מורכבת מהספיחה של שלפוחית ​​unilamellar הקטנה לתמיכה מוצקה וקרע ספונטני שלאחר מכן והיתוך ליצירת bilayer שומנים רציף. עם זאת, בתנאים פיסיולוגיים, קרע שלפוחית ​​ספונטנית מוגבל בעיקר לחומרים מבוססי סיליקון כגון דו תחמוצת צורן, זכוכית, ויציצו. בנוסף, קרע שלפוחית ​​אינו מתרחש באופן ספונטני לשלפוחית ​​של קומפוזיציות שומנים מורכבות כגון אלה המכילים שברים גבוהים של כולסטרול או שומנים טעונים שלילי. בהתאם למערכת, קרע שלפוחית ​​עלול להיגרם על ידי התאמה נוספת תנאי הניסוי כגון טמפרטורה 12, pH פתרון 13, ומליחות 14, הלם האוסמוטי 15 16, או תוספת של יונים דו ערכיים כגון Ca 2 + 17. לחלופין, פפטיד AH-הקרום פעיל יכול להיות הציג על מנת לערער את יציבות שכבה של שלפוחית ​​adsorbed, שהוביל לקרע שלפוחית ​​והיווצרות bilayer במגוון משטחי 18-22.

יתר על כן, היווצרות bilayer מוצלחת דורשת הכנה של אוכלוסייה מבוקרת היטב של שלפוחית ​​unilamellar הקטנה שיכול להיות זמן רב וקשה להשגה ליצירות קרום מסוימות. לכן, למרות יעילותו הגבוהה במקרים אופטימליים (למשל, לאחר טיפול מקדים להקפיא להפשיר נרחב של שלפוחית ​​23), היישום הכללי של איחוי שלפוחית ​​מוגבל על ידי היקף מצעים מתאימים ויצירות קרום.

שיטת bilayer שומנים בסיוע הממס (SALB) 24-28 היא טכניקת ייצור חלופית שאינו דורשת שלפוחית ​​שומנים. השיטה מבוססת על o התצהירמולקולות שומנים ו על גבי משטח מוצק בנוכחות של ממס אורגני בליל מים ואחרי חילופי הדרגתיים של ממס זה עם פתרון חיץ המימי כדי לעורר היווצרות SLB. במהלך שלב ממס לבורסה, התערובת משולשת של שומנים, ממס אורגני, ומים עובר שלב מעברי סדרה עם הגדלת חלק מים, מה שמוביל להיווצרות של מבני שלב שבשבת בפתרון התפזורת וSLB על המצע המוצק. חשוב לציין, מסלול הרכבה עצמית זו עוקף את הצורך בקרע שלפוחית, שהיא בדרך כלל הצעד המגביל להפיכתו של שלפוחית ​​adsorbed לSLB. הפרוטוקול חל על מגוון רחב של משטחים הכוללים דו תחמוצת צורן, תחמוצת אלומיניום, כרום, תחמוצת אינדיום בדיל, וזהב. במאמר זה ובוידאו המצורף, השוואה של תצהיר שומנים על ידי SALB ושיטות איחוי השלפוחית ​​מוצגת. בפרט, ריכוז שומנים בדם ההשפעה של פרמטרים ניסיוניים, כולל, קצב זרימה, ואת הבחירה של ממס אורגני בליל מים, על איכות bilayer נוצר על ידי שיטת SALB הם דנו. אפיון אנליטי של SLBs המפוברק מבוצע על ידי QCM-D, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, והתאוששות הקרינה לאחר photobleaching טכניקות (FRAP). ניטור QCM-D הוא טכניקת מדידת מסת משטח רגיש ש, מאז עבודתו החלוצית בניצוחו של קלר וKasemo 29, כבר נעשה שימוש נרחב לחקור היווצרות bilayer כמותית. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר בדיקה של הומוגניות קרום, כמו גם להדמיה של תחומים קרום. טכניקת FRAP היא כלי סטנדרטי כדי לקבוע את הניידות לרוחב של מולקולות שומנים בSLB, שהוא רכוש חיוני של קרומי fluidic.

החלק הראשון של מחקר זה כרוך ניתוח QCM-D של SALB ושיטות איחוי שלפוחית ​​מיושם לנסות היווצרות bilayer על סיליקון דו חמצני וזהב. בחלקו השני,ההכנה והאפיון של קרומים נתמכים המכילים מגוון רחב של ריכוזי כולסטרול בשיטת SALB הם הפגינו והתוצאות בהשוואה לאלו שהושגו בשיטת איחוי שלפוחית.

Protocol

1. כינונה של bilayer שומנים הנתמכים על תמיכה מוצקה הידרופילי

  1. הכן פתרונות מניות שומנים של 10 מ"ג / מיליליטר 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (dOPC) ו1 מ"ג / מיליליטר 1,2-dioleoyl- SN N -glycero-3-phosphoethanolamine- - (rhodamine B lissamine sulfonyl) (Rh-PE) על ידי המסת שומנים אבקות בהתאמה (שקל כראוי מראש עם מאזן מסה אנליטיים) בפתרון isopropanol.
  2. לדלל ולערבב את פתרונות המניות ב isopropanol כדי להכין את תערובת שומנים הרצויה בריכוז הסופי. לניסויי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וFRAP, 0.5% WT Rh-PE צריך להיות כלול בתערובת השומנים.
  3. להזריק את תערובת השומנים בisopropanol לערוץ microfluidic עד שהוא מלא.
  4. דגירה את תערובת שומנים על משטח הזכוכית לכ -10 דקות.
  5. בהדרגה להחליף את פתרון שומנים עם פתרון מים או חיץ באמצעות משאבת peristaltic בקצב זרימה נמוכה מאוד(10-50 μl / min). לחלופין, להחליף את תערובת שומנים על ידי pipetting חזר.
  6. יש לשטוף את הערוץ באופן יסודי עם חיץ עודף כדי להסיר את isopropanol השייר.

2. כינונה של ממברנות הנתמכות מועשר כולסטרול

הערה: המשטח המוצק (SiO 2) תומכת באיחוי שלפוחית, אבל הרכב הקרום (כולסטרול גבוה) מעכב איחוי שלפוחית ​​בגלל שלפוחית ​​מועשרת כולסטרול גבוה כיפוף קשיחות 30.

  1. הכן פתרון מניות המכיל שומנים 10 מ"ג / מיליליטר dOPC, 10 מ"ג / מיליליטר כולסטרול, ו1 מ"ג / מיליליטר Rh-PE ידי המסת אבקות בהתאמה הראשונה בisopropanol.
  2. חזור על שלבים 1.2-1.6 באמצעות פתרונות המניות מוכנים בשלב 2.1.

3. ממברנה נזילות Assay

  1. לטבול את שקופיות זכוכית בפתרון נתרן גופרתי dodecyl (SDS) (1%) במשך 10 דקות.
  2. שטוף את השקופיות ביסודיות עם מים ללא יונים ולשטוף שנינותh אתנול.
  3. מכה יבשה שקופיות באמצעות זרם עדין של חנקן.
  4. לחשוף את השקופיות לפלזמת חמצן במשך 30 שניות בכוח גלי רדיו מרבי בתא הפלזמה חמצן.
  5. הסר את ציפוי מגן סרט של חדר microfluidic (איור 1 א) המסחרי תחתית באמצעות פינצטה ולצרף את שקופיות זכוכית על הצד הדביק של החדר (איור 1).
  6. להרכיב את המחברים וצינורות לעמדות כניסה ויציאה של החדר ולמקם את ערוץ microfluidic על הבמה מיקרוסקופ (איור 1 ג).
  7. טופס bilayer שומנים fluorescently שכותרתו נתמכת בערוץ microfluidic [חזור על שלב 1 באמצעות הרכב שומנים הרצוי (למשל, 0.5 מ"ג / מיליליטר dOPC) כולל 0.5% WT Rh-PE בממס אורגני].
  8. אתר את מטוס bilayer עם מטרת טבילת שמן 60X (NA 1.49) כדי ללכוד תמונות.
  9. קח שתי תמונות מראש אקונומיקה, אז תמונה אקונומיקה 301; מ 'נקודה עגולה רחבה עם קרן לייזר mW 532 ננומטר, 100. לפני photobleaching, לחמם את הלייזר עד עוצמתו הפכה יציבה. מייד לאחר photobleaching, ללכוד סדרה של תמונות בכל שנייה 1 למשך 2 דקות כדי לעקוב אחרי ההתאוששות בעוצמת הקרינה במקום מולבן.

Assay כימות 4. כולסטרול

  1. לחשוף את מצופה צורן דו-חמצני גבישי קוורץ שבב החיישן לפלזמת חמצן במשך 30 שניות בכוח גלי רדיו מרבי בתא הפלזמה חמצן. הסר את השבב מהאולם והר השבב בתא המדידה באופן מיידי.
  2. לפני הניסוי, לרכוש ראשון תדירות ופיזור של שבב החיישן באוויר על מנת להבטיח הרכבה נכונה.
    1. למכשיר Q-Sense E1 או E4 QCM-D המסחרי, הפעל את תוכנת Q-רך ולחץ על "רכישה" ובחר "מדידת הגדרות".
    2. בחלון החדש שמופיע, בדוק את 3, 5, 7, 9, 11 ו -13 נימות ולאחר מכן לחץ על מצא והפעל על מנת לבדוק את ספקטרום התהודה. הגדר את הטמפרטורה ב 24 מעלות צלזיוס. אם תדרי תהודה אחד או יותר לא מסכימים עם הערכים הצפויים, לבדוק את שבב ההרכבה מחדש לבצע שלב זה עד שיגיע להסכם.
  3. התחל משאבת peristaltic ולזרום פתרון חיץ (10 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, pH 7.5) לתוך תא המדידה בקצב זרימה של 100 μl / דקה.
  4. בתוכנה, לחץ על "רכישה" ובחר "הפעל מחדש מדידה" על מנת לרשום את אותות פיזור תדר התהודה ואנרגיה. חזור על שלב זה עד תחילת המחקר יציבה מתקבלת עבור משמרות התדירות ופיזור. הערה: צעדים להלן, יהיו משמרות תדירות ופיזור נוספות שניתן להקליט כפונקציה של זמן.
  5. הזרק isopropanol (ללא שומנים) במשך 10 דקות.
  6. להזריק את התערובת של שומנים / כולסטרול dOPC ביחס טוחנת רצוי עם ריכוז מוחלט שומנים של 0.5 מ"ג / מיליליטר בisopropanol במשך 10 דקות.
  7. להזריק חיץ במשך 20 דקות בקצב זרימה של 100 μl / דקה.
  8. הזרק פתרון של 1 מתיל-β-cyclodextrin מ"מ (MβCD) שהוכן במאגר (זרימת 100 μl / min שיעור) עד אות התדר מגיעה לערך יציב.
  9. מדוד את משמרות התדר החיוביות ביחס שנגרמת על ידי צעד טיפול MβCD ולחשב את המסה של שומני כולסטרול וdOPC ידי המרת ערכי Δf צ'ו וΔf dOPC לערכי מסה באמצעות משוואת Sauerbrey [Δm = - (ג / n) × Δf, כאשר C = 17.7 ng / 2 סנטימטר, n: נימה].
  10. לחשב את החלק יחסי השומה של כולסטרול בSLB, תוך לקיחה בחשבון את המשקל המולקולרי של שומנים dOPC (786.1 g / mol) וכולסטרול (386.6 g / mol).

Representative Results

המצאה של bilayers שומנים נתמכים על מצעים הידרופילי.

שיטות היווצרות VF וSALB היו ניסיון על דו תחמוצת צורן וזהב ותהליכי ההיווצרות נוטרו בזמן אמת על ידי טכניקת מדידת QCM-D. אמצעי מכשיר שינויי QCM-D בתדר התהודה Δ) של גביש קוורץ פיזואלקטריים נדנוד על ספיחת מסה על פני השטח של הגביש. בנוסף, מכשיר QCM-D מודד את הפיזור של אנרגיית התנודה כדי לאפיין את תכונות viscoelastic (קשיחות ורך) של adlayer. ניסויי איחוי שלפוחית ​​בוצעו כמתואר 31 בעבר. בקצרה, בסיס הוקם לראשונה לאותות בתדר ופיזור בפתרון חיץ המימי [10 מ"מ טריס, 150 מ"מ NaCl, pH 7.5; (איור 2 א 'וב')]. בשלב הבא, שלפוחית ​​קטנה unilamellar dOPC שומנים באותו החיץ היו בjected בזמן t = 10 דקות (חץ 1) על דו תחמוצת צורן (איור 2 א) וזהב (איור 2). לאיחוי שלפוחית ​​על דו תחמוצת צורן, קינטיקה ספיחה דו-שלבים נצפו עם השינויים אחרונים בפיזור תדר ואנרגיה של -26 (± 1) הרץ ו -0.3 (± 0.2) × 10 - 6, בהתאמה. ערכים אלה עולים בקנה אחד עם הקמתה של bilayer שומנים נתמך 29.

כפי שניתן לראות באיור 2, התוספת של פתרון השלפוחית ​​למשטח הזהב הובילה לירידה בו זמנית ועלייה באותות F וΔ Δ D, בהתאמה, עד הערכים שלהם הגיעו -150 (± 10) הרץ ו( 7.5 ± 2) × 10 - 6, בהתאמה. ערכים אלה מתאימות להיווצרות של שכבת שלפוחית ​​adsorbed. כך, כצפוי, SLB לא נוצר על זהב באמצעות שיטת איחוי שלפוחית.

QCניתוח MD להיווצרות bilayer על סיליקון דו חמצני וזהב בשיטת SALB מוצג באיור 2C ו- D. על דו תחמוצת צורן, משמרות F וΔ Δ D סופיות של -25.6 (± 0.55) הרץ ו -0.4 (± 0.27) × 10 - 6, בהתאמה, הושגו וערכים אלה מצביעים על היווצרות של SLB. טווחים דומים של f וΔ Δ DF Au: -27.3 ± 2.7 הרץ, Δ D Au: 0.48 (± 0.26) × 10 - 6) נצפו על זהב. תוצאות אלו תומכות כי שיטת SALB מאפשרת היווצרות של bilayers שומנים הנתמכים על משטחים המונעים קרע שלפוחית.

השפעה של קצב זרימת ממס חליפין על איכות bilayers שומנים נתמך.

כדי לקבוע את התנאים אופטימליים לייצור של vi bilayers שומנים נתמכים באיכות גבוההשיטת SALB, ההשפעה של ריכוז שומנים בדם, שיעור ממס-חליפין והבחירה של ממס אורגני נבדקה.

איור 3 מציג את השינוי בתדירות QCM-D במהלך השלב הסופי של פרוטוקול SALB, כפי שבוצע על סיליקון דו חמצני בשני שיעורים שונים זרימה (100 ו -600 μl / min) ושני ריכוזי שומנים שונים (0.125 ו 0.5 מ"ג / מיליליטר) .

כאשר שומנים / dOPC מיליליטר 0.5 מ"ג שימשו (איור 3 א), היווצרות bilayer לא הושפעה מקצב הזרימה ושינוי Δf סופי של כ -26 הרץ הושג בשתי הספיקות.

לעומת זאת, כאשר ריכוז שומנים בדם נמוך יותר היה בשימוש, כמות שומנים בדם נספג לאחר חילופי ממס מלאים הושפעה באופן משמעותי על ידי קצב הזרימה (איור 3). בקצב זרימה ממוצע של 100 μl / דקה, היווצרות bilayer הייתה מלאה (Δf סביב -26 הרץ). עם זאת, בקצב זרימה פי 6 גבוה יותר (600 μl / min), bilayer שלם לא נוצר (Δf סביב -17 הרץ). תוצאות אלה מספקות קו מנחה לבחירת תנאי ניסוי הנכונים עבור היווצרות bilayer מוצלחת בשיטת SALB עם isopropanol כממס האורגני של בחירה.

אפיון של bilayers שומנים הנתמכים נוצר מריכוזי שומנים שונים בפתרונות אלכוהול שונים.

ריכוז שומנים בדם הוא פרמטר נוסף שמשפיע על איכות SLBs מתקבלת על ידי שימוש בשיטת SALB. מיקרוסקופ פלואורסצנטי גילה כי, ב0.05 מ"ג / מיליליטר ריכוז שומנים בדם, רק מבנים בודדים, תת-מיקרוסקופיים שומנים נוצרו (איור 4 א). עם עלייה בריכוז שומנים בשימוש בהליך SALB, עוצמת הקרינה של מבני השומנים הפכה הומוגנית יותר. ב0.1 מ"ג / מיליליטר ריכוז שומנים בדם, היו כתמי שומנים מיקרוסקופיים למרות המבנים לא יתפרסו על-פני כל field מבט (איור 4). עם זאת, כאשר 0.25 מ"ג / מיליליטר ריכוז שומנים בדם שימש, bilayer שומנים הומוגנית הוקם (איור 4C). לכן, יש ריכוז שומנים בדם מינימאלי הנדרש כדי ליצור SLB מלא, מלא פורש.

ההשפעה של ריכוז שומנים בדם על התוצאה הסופית של ניסויי SALB נבחנה גם על פני טווח ריכוז שומנים רחב יותר (0.01 עד 5 מ"ג / מיליליטר) ובממסים אורגניים שונים (isopropanol, אתנול, וn-propanol). ו Δ Δ וערכי D המתאימים לשלב הסופי בהליך SALB מוצגים באיור 5.

הגדרנו היווצרות bilayer מבוסס על השינויים אחרונים בפיזור תדר ואנרגיה בין הרץ -25 ו-30 ופחות מ 0.5 x 10 -6, בהתאמה. בהתבסס על קריטריונים אלה, טווח ריכוז שומנים בדם האופטימלי ליצירת bilayer שומנים נתמך היה נחוש להיות בין 0.1 ו 0.5 מ"ג/ מיליליטר בלתי תלוי בעיקר הסוג של ממס אורגני. הסטיות בF Δ נרכש וΔ D משמרות מחוץ לטווח האמור היא בשל נוכחותם של המונים נוספים (למשל, ערימות bilayer), (למשל, שלפוחית, מיצלות כמו תולעת-) את המופע של מורפולוגיות שאינן bilayer, ו הנוכחות של איי bilayer מקוטעים עם מורפולוגיה שלמה על פני המצע.

בעוד הליך SALB להושג bilayers שומנים הנתמכים הוא יחסית חזק, ריכוז השומנים בדם האופטימלי להיווצרות bilayer באיכות גבוהה עשוי לדרוש כוונון בהתאם לתצורת הניסוי הספציפית. בעיקרון, יש לא רק ריכוז שומנים מינימום, אלא גם ריכוז שומנים בדם מרבי הנדרש להיווצרות bilayer אופטימלית באמצעות שיטת SALB. טווח הריכוז האופטימלי תלוי בקצב הזרימה ויכול להיות גם להיות מושפע מהרכב המצע ושומנים בדם. באופן אמפירי, במקרים רבים, יש לנו found שריכוז שומנים בדם של 0.5 מ"ג / מיליליטר וקצב זרימה של 100 μl / דקה היא הסט האופטימלי של תנאים להיווצרות של bilayer שומנים נתמכים הומוגנית. עם זאת, בהתאם לגיאומטריה-האחרונה הרכב שומנים בדם וזרימת תאים אשר משפיע על זרימת הפרופיל באופטימיזציה שער נוסף ממס של ריכוז השומנים בדם עשוי להיות נחוץ. לפיכך, אנו ממליצים על ביצוע ניסויי הטייס SALB באמצעות 0.5 מ"ג / מיליליטר ריכוז שומנים בדם ולהעריך את איכות bilayer באמצעות שיטות מיקרוסקופיה QCM-D או הקרינה. אם bilayers מופיעה שלמה, אז ריכוז השומנים בדם צריך להיות מוגבר במרווחים של 10% עד תוצאות משביעות רצון מושגות. אם bilayer נראה להתקיים עם מבני שומנים נוספים, ולאחר מכן את ריכוז השומנים בדם צריך להיות ירידה במרווחים של 10% עד תוצאות משביעות רצון מושגות.

המצאה של bilayers שומנים נתמכים עם קומפוזיציות שומנים שונות ודשברים כולסטרול ifferent.

בשלב הבא, שיטות SALB וVF הועסקו על מנת ליצור SLBs מועשר כולסטרול. איור 6 מציג תמונות נציג הקרינה (100 × 100 מיקרומטר) של קרומים נתמכים המכיל כולסטרול שהוכנו על ידי שיטת SALB. הקרומים מורכבים של תחומים-נכלל צבע בצורה מעגלי מוקפות שלב רציף המאופיין בבהירות ניאון אחידה. תחומים הכהים גדלו באזור עם עלייה בחלק כולסטרול בתערובת השומנים המבשר. בשלב הבא, מדידות FRAP בוצעו במטרה לבחון את הנזילות של סרטי bilayer השומנים. מדידות FRAP גילו התאוששות הקרינה כמעט מוחלטת בשלב שמסביב, המציינת את הניידות לרוחב של שומנים ובכך היווצרות של bilayer שומנים יחיד. מאז מחיצות Rh-PE מעדיף לשלב נוזל, תחומים הכהים ככל הנראה מורכבים ממבנים מועשרים כולסטרול צפופים. לשם השוואה, הייצור של bilayers dOPC / חול בשיטת VF גם ניסה. DOPC שלפוחית ​​עם הגדלת שברים כולסטרול (10 - 40% מול) הוכנו על ידי שיטת שחול שלפוחית. השומנים Rh-PE (0.5% WT) שימשו כתווית ניאון להדמיה. איור 7 מראה תמונות נציג הקרינה (100 × 100 מיקרומטר) של מבנים שנוצרו בדגירה של מצעי זכוכית עם שלפוחית ​​המכיל כולסטרול. ניתוח FRAP הראה את היווצרות bilayer שומנים fluidic באמצעות שלפוחית ​​המכילה 20% מול חול או פחות. עם זאת, דוגמאות שהוכנו על ידי שימוש בשלפוחית ​​עם שברים כולסטרול גבוהים לא הציג התאוששות, המעידה על הנוכחות של adsorbed אבל שלפוחית ​​unruptured.

חלק קטן של כולסטרול אשר התאגד סופו של דבר לbilayers השומנים הנתמכים היה לכמת כפונקציה של שבריר הכולסטרול שנכללה בשפת המבשרתערובת id בממס אורגני בשיטת SALB או בשלפוחית ​​בתמיסה מימית בשיטת VF. שימוש בטכניקת QCM-D, היווצרות bilayer הייתה פיקוח ולאחר מכן MβCD נוסף כדי לחלץ במיוחד חול מbilayers השומנים הנתמכים 32. אובדן המסה בשל הסרת הכולסטרול הוביל לירידה בערכו המוחלט של שינוי התדר (| F Δ |) הקשורים לSLB. משמרות התדר החיוביות ביחס נגרמות על ידי צעד טיפול MβCD מוצגות באיור 8 א. חלק השומה של כולסטרול חושבו על בסיס שינוי התדר, כפי שהוצג באיור 8 ב.

חלק הכולסטרול שולב bilayers שומנים הנתמכים שהוכן על ידי שיטת SALB היה כמעט באופן ליניארי פרופורציונאלי לתוכן הכולסטרול בתערובת השומנים המבשר. מעניין לציין, כי חלק הכולסטרול בbilayers שהוכן על ידי שיטת VF (שלפוחית ​​המכילה עד20 mol% חול) היו נמוכים באופן משמעותי מזה המופיע בשלפוחית ​​המבשרת. למעשה, החלק הגבוה ביותר של כולסטרול המתקבל בשיטת VF היה רק ​​כ -10% mol.

תצפית של מבנה פס באזור דו-קיום β-שני-השלב של כולסטרול-פוספוליפידים נתמכים bilayers שומנים.

ניסויים בוצעו SALB נוסף באמצעות תערובת שומנים בחלק גבוה יותר של כולסטרול. כאשר 4: 6 תערובת של dOPC וכולסטרול היה בשימוש, demixing הדרגתי של שלב נוזלי אחיד לשני שלבי coexisting דמיין כתחומים בצורת פס בהירים על רקע כהה (לא כולל צבעים) נצפה (איור 9). הוא קבע כי Rh-PE נשלל מתחומים עשירים בכולסטרול 33, ולכן תחומים הכהים הבולטים שהופיעו כרקע הם אזורים מועשרים כולסטרול. ההיווצרות של תחומים בהירים בגודל מיקרון על רקע כהה בהייחלק GH כולסטרול (> 50% mol) עולה בקנה אחד עם אזור β בתרשים שלב monolayer של כולסטרול / פוספוליפידים תערובות 34,35. יתר על כן, ההיווצרות של תחומים פס, שנובעים ממתח קו חלש, מצביעה על כך שהתערובת היא ליד נקודה קריטית miscibility.

איור 1
איור 1. תא microfluidic להיווצרות SALB בתצורה מתאימה למיקרוסקופיה epifluorescence. זכוכית coverslip המצורף על הצד הדביק של החדר () תא microfluidic מסחרי, (ב), התקנה מלאה על בעל מיקרוסקופ עם צינור המחובר ל( C) יציאות כניסה ויציאה של החדר, ו( ד) משאבת Peristaltic משמשות לשליטה על שער חליפי ממס. שומנים המומסים בisopropanol מוזרקים לתוך chamb המדידהאה בעזרת משאבת peristaltic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
ניתוח איור 2. QCM-D של ניסויי איחוי השלפוחית ​​וSALB על מצעי סיליקון דו חמצני וזהב. תדירות QCM-D (Δf, כחול) ופיזור (ΔD, אדום) תגובות לנימה השלישית (n = 3) נרשמו כ פונקציה של זמן במהלך ספיחת שומנים על (A ו- C) צורן דו-חמצני, (B ו- D) זהב. פנלים וב להציג את שיטת איחוי שלפוחית. שלפוחית ​​השומנים dOPC הוזרקה בזמן t = 10 דקות (חץ 1). ג הפנלים וד מתאים לשיטת היווצרות SALB. חצים מצביעים על ההזרקה של חיץ (1), isopropanol (2), תערובת שומנים [0.5 מ"ג / מיליליטר שומנים dOPC בisopropanol; (3)] ​​וחובבחילופי אה (4). העקומה המקווקו בלוח ב 'מתאימה לניסוי שליטה בי השומנים לא מוזרקים. הערכים הסופיים של Δf וΔD לכל משטח שצוינו. השרטוטים להראות מוצע מבני שומנים התאספו כמשתמעים ממשמרות תדירות ופיזור הסופיות. מעובד מתוך התייחסות 24 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. השפעתו של שער חליפין על-ממס תהליך היווצרות SALB. משמרות QCM-D תדר (Δf) המתאים לשלב הסופי (ראה 4 חץ באיור 2 ג) בשיטת SALB נמדדו על סיליקון דו חמצני בשני שיעורים שונים חליפין, 100 ו -600 μl / דקה, u לשיר () 0.5 מ"ג / מיליליטר ושומני dOPC (ב) 0.125 מ"ג / מיליליטר ב isopropanol. ערכי Δf הסופיים גם צוינו, בהשוואה לקו בסיס המדידה בפתרון חיץ המימי. מעובד מתוך התייחסות 24 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. סף של ריכוז שומנים לגיבוש SALB שלם מיקרוסקופיה epifluorescence של שכבות שומנים על סיליקון דו חמצני שהוכן על ידי SALB באמצעות () 0.05 מ"ג / מיליליטר.; (ב) 0.1 מ"ג / מיליליטר; ו- (ג) 0.25 מ"ג / מיליליטר ריכוז שומנים בדם. מעובד מתוך התייחסות 26 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה."Target =" _ /files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
השפעת 5. איור של ריכוז שומנים בדם וממס אורגני על היווצרות bilayer שומנים נתמכת על ידי שיטת SALB. השינויים האחרונים בQCM-D תדר () ופיזור (ב) אנרגיה לניסויי SALB שימוש בממסים אורגניים שונים, כפונקציה של שומנים בדם ריכוז. הקווים הירוקים המקווקו מתאים למשמרות תדירות ופיזור הצפויות לbilayer מלא (-30 הרץ <Δf <הרץ -25 וΔD <1 x 10 -6). מעובד מתוך התייחסות 26 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זהדמות.

איור 6
איור 6. התאוששות הקרינה לאחר photobleaching ניתוח של bilayers שומנים הנתמכים עם שברים שונים של כולסטרול שהוכנו על ידי שיטת SALB על מצע זכוכית. micrographs (AE) הקרינה של bilayers מוכנה באמצעות שברים כולסטרול שונים בתערובת המבשר. תמונות נרשמו מייד (למעלה) ודקות 1 (באמצע) אחרי photobleaching. הכתם הכהה במרכז התמונה מתאים לאזור photobleached. הברים בקנה מידה הם 20 מיקרומטר. היסטוגרמות שטח פנים של תחומים-נכלל צבע בודדים בתוך מדגם זה מוצגות גם (בחלק תחתון). מעובד מתוך התייחסות 36 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. ניתוח FRAP של bilayers נתמכת המכיל כולסטרול שהוכנה על ידי שיטת איחוי שלפוחית. micrographs פלואורסצנטי (AD) של bilayers מוכנה באמצעות שברים שונים כולסטרול (10 עד 40% mol), בשלפוחית ​​המבשרת. תמונות נרשמו מייד (למעלה) ודקות 1 (תחתונה) לאחר photobleaching. הכתם הכהה במרכז התמונה מתאים לאזור photobleached. הברים בקנה מידה הם 20 מיקרומטר. מעובד מתוך התייחסות 36 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8
איור 8. Quantification של שבריר הכולסטרול בbilayers שומנים נתמך. השינוי החיובי QCM-D התדירות על זריקה של 1 מ"מ MβCD על bilayers שומנים נתמכים עם שברים שונים שומה של כולסטרול בתערובת המבשר (בין 0 ל 50% mol) (). אחוזים שומה של הכולסטרול המדולדל מbilayers שהוכנה על ידי SALB ושיטות איחוי שלפוחית ​​כפונקציה של שבריר הכולסטרול בתערובות המבשרת או שלפוחית ​​(B). מעובד מתוך התייחסות 36 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9
אבולוציה איור 9. זמן תלויה של מיקרו הקרינה בbilayer נתמך של dOPC / חול (4: 6 conta יחס טוחנתining 0.5% Rhodamine-PE) שהוכנו על ידי שיטת SALB. שלב אחיד בהדרגה שלב מפריד לאזור הדו-קיום נוזל נוזל על חילופי ממס מלאים. מעובד מתוך התייחסות 37 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

בעבודה זו, פרוטוקול ממס מטבע מוצג בי שומנים באלכוהול (isopropanol, אתנול, או n-propanol) מודגרת עם תמיכה מוצקה ולאחר מכן האלכוהול מוחלף בהדרגה עם פתרון חיץ המימי כדי לנהוג בסדרה מעברי שלב ייצור סופו של דבר bilayers שומנים שבשבת-שלב 24. הוא הראה כי השיטה מאפשרת ייצור של bilayers שומנים הנתמכים על משטחים כגון זהב, שהוא בלתי פתיר לשיטת איחוי שלפוחית.

טווח ריכוז שומנים בדם אופטימלי (0.1-0.5 מ"ג / מיליליטר) נקבע להיווצרות bilayer מלאה בפורמטים סטנדרטיים ניסיוניים נבדקו עד כה. בריכוזים שומנים בדם מתחת 0.1 מ"ג / מיליליטר, תיקונים בדידים, מיקרוסקופיים של bilayers נוצר. מצד השני, בריכוזים מעל 0.1 מ"ג / מ"ל ​​ונמוך מ -0.5 מ"ג / מיליליטר, bilayer מלא והאחיד נוצר. בריכוזים שומנים מעל לטווח זה, bilayer נוזל עדיין נוצר כverifiאד על ידי ניתוח FRAP, עם זאת, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה הנוכחות של מבני שומנים נוספים בחלק העליון של bilayer. באופן מפתיע, את המורפולוגיה של מבני שומנים נוספים אלה, כפי שנקבע על ידי ניתוח QCM-D, הייתה תלויה באלכוהול שהיה בשימוש בשלב הדגירה. במקרה של אתנול, משמרות F וΔ Δ D גבוהות יחסית דומות חתימת QCM-D המתקבלת לשכבת שלפוחית ​​adsorbed. כאשר isopropanol או n-propanol שימשה במקום, ו Δ היה מעט גבוה יותר מהערך הצפוי לbilayer Δ סופי בין -30 ל -40 הרץ), ואילו Δ D היה ניכר גבוה יותר. תגובות QCM-D כזה יהיו צפויים למבנים מורחבים שומנים (למשל, מיצלות כמו תולעת-) הבולטים החוצה ממשטח הקרום (כגלוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחלק ממקרים).

שער חליפי ממס הוא פרמטר חשוב נוסף שיכול להיות קריטי, especially כאשר ריכוזים נמוכים יותר שומנים (למשל, 0.1 מ"ג / מיליליטר) משמשים. חילופי ממס מהירים בריכוז שומנים בדם נמוך יכולים להוביל להיווצרות של bilayers שלמה. בתא המדידה הסטנדרטי המשמש למדידות QCM-D במאמר זה (קאמרי מדידת Q-Sense E4), ספיקות של כ -100 μl / דקה, היו מתאימים להיווצרות bilayer מלאה מאוד לשחזור. לתאי זרימה בגיאומטריות ונפח אחרים, קצב הזרימה האופטימלי עשוי להשתנות וחייב באופן אמפירי ייקבע על פי הצעדים הציעו במסמך זה.

בנוסף ליצירת bilayers שומנים נתמך על משטחים שהם סוררים לאיחוי שלפוחית, יכול להיות מועסק SALB לעקוף את הצורך בשלפוחית ​​שומנים שיכולים להיקרע, ובכך לפתוח את הדלת לייצור של ממברנות נתמכות עם קומפוזיציות מורכבות. כדוגמה להמחשת הרכב, תערובות שומנים בחלק גבוה של כולסטרול נבדקו. כולסטרול הוא מרכיב חשוב של mammעליאן קרום תא, והחלק שלה יכולים להתקרב 45-50% mol של הרכב השומנים קרום (למשל, באריתרוציטים). לכן, גם מודל פשוט של bilayer שומנים המייצגים קרום תא אנושי צריך לכלול כולסטרול.

בעוד איחוי שלפוחית ​​יכול לשמש כדי לפברק bilayers השומנים fluidic מכיל כולסטרול רק 10-15%, שיטת SALB מאפשרת היווצרות של bilayers השומנים fluidic מכיל שברים גבוהים של כולסטרול (עד 57% mol, כלכמת ידי מדידות QCM-D) 36. עם זאת, כאשר רמת הכולסטרול הייתה גבוהה עוד יותר (עד 63% mol), תחומים פס-צורה נצפו 37. תחומים קיימים השותף היו נוזליים, מזכיר אלו שנצפו באזור β בתרשים השלב של monolayer כולסטרול / פוספוליפידים בממשק אוויר מים.

בסך הכל, שיטת SALB מוצג להיות גישה פשוטה ויעילה ליצירת bilayers שומנים נתמך, במיוחד אנימקרי n מעבר להיקף של שיטת איחוי שלפוחית ​​הקונבנציונלית. עד כה, מיקרוסקופיה הטכניקה וקרינת QCM-D שימשה בעיקר כדי לאפיין את bilayers השומנים הנתמכים נוצרים על ידי שיטת SALB. במבט קדימה, במגוון רחב של טכניקות מדידות אנליטיות משטח רגיש, כוללים תהודת plasmon פני השטח (SPR) 38, במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 39,40, פורייה-להפוך ספקטרוסקופיה אינפרא אדום 41, רנטגן 42 ורפלקטיביות ניטרונים 43 יכול, לשמש כדי להמשיך ולאפיין וללמוד תצורות bilayer פשוטות ומורכבות להכין בשיטת SALB. יכולות אלה מתפתחים לפתוח את הדלת למספר גדול יותר של מדענים שיכולים לחקור קרום תא מלאכותי על ידי ניצול של פרוטוקול ניסוי פשוט וחזק.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות תמיכה מהקרן הלאומית למחקר (NRF -NRFF2011-01 וNRF2015NRF-POC0001-19), המועצה למחקר הרפואי הלאומי (NMRC / CBRG / 0005/2012), והאוניברסיטה הטכנולוגית נניאנג לNJC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QCM-D silicon dioxide-coated substrates QSense AB,  Sweden
QCM-D gold-coated substrates QSense AB,  Sweden
Q-Sense E4 module QSense AB,  Sweden
Plasma Cleaner, PDC-32G Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) Avanti Polar Lipids 810150P
cholesterol Avanti Polar Lipids 700000P
Methyl-β-cyclodextrin Sigma  C4555
Isopropanol Sigma  673773
Ethanol Sigma  459844
n-propanol Sigma  279544
Sticky-Slide I 0.1 Luer IBIDI 81128
Male elbow 1/8” Cole-Parmer 30505-70
Silicon tubing 1.6 mm ID IBIDI 10842
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm IBIDI 10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump Ismatec
Sodium dodecyl sulfate Sigma  71725

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sackmann, E. Supported membranes: Scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
  2. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry. Science. 313, 1948-1951 (2006).
  3. Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy. Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).
  4. Bally, M., et al. Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers. Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).
  5. Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis. Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).
  6. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication. Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.
  7. Mager, M. D., Melosh, N. A. Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse. Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).
  8. Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns. Small. 3, 71-75 (2007).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).
  11. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers. Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).
  12. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).
  13. Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  14. Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration. Thin Solid Films. 495-4246 (2006).
  15. Stanglmaier, S., et al. Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).
  16. Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports. Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).
  17. Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material. Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).
  18. Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2. Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).
  19. Hardy, G. J., et al. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).
  20. Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica. European Biophysics Journal. 1-10 (2014).
  21. Coutable, A., et al. Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression. Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).
  22. Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers. The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).
  23. Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment. Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).
  24. Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold. Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).
  25. Hohner, A., David, M., Rädlera, J. Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces. Biointerphases. 5, 1-8 (2010).
  26. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes. Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).
  27. Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation. Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. (2015).
  28. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer. Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  29. Keller, C., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
  30. Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).
  31. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).
  32. Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).
  33. Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer. Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).
  34. Okonogi, T., McConnell, H. Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers. Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).
  35. McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. Condensed complexes of cholesterol and phospholipids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).
  36. Tabaei, S. R., et al. Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly. Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).
  37. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes. Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).
  38. Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1195-11267 (1994).
  39. Yuan, C., Johnston, L. Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies. Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).
  40. Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).
  41. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).
  42. Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity. Physical Review Letters. 94, 238104 (2005).
  43. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).
ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).More

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter