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Bioengineering

विलायक की सहायता लिपिड bilayer (SALB) विधि द्वारा Biomembrane निर्माण

doi: 10.3791/53073 Published: December 1, 2015

Summary

हम लिपिड vesicles का उपयोग किए बिना ठोस substrates पर एक समर्थित लिपिड दो परतों का निर्माण करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। हम विभिन्न जैविक अनुप्रयोगों के लिए कोलेस्ट्रॉल समृद्ध डोमेन के साथ एक लिपिड सिलिकॉन डाइऑक्साइड और सोने पर दो परतों का निर्माण करने के साथ ही समर्थित झिल्ली के लिए फार्म का एक एक कदम विधि का प्रदर्शन।

Abstract

कोशिका झिल्ली की नकल करने के लिए, समर्थित लिपिड bilayer (SLB) ठोस substrates के लिए biocompatibility और biofunctionality प्रदान करते हुए झिल्ली से संबंधित प्रक्रियाओं के इन विट्रो जांच में सक्षम बनाता है जो एक आकर्षक मंच है। फॉस्फोलिपिड पुटिकाओं की सहज सोखना और टूटना SLBs फार्म के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है। हालांकि, शारीरिक शर्तों के तहत, पुटिका संलयन (एफ) लिपिड रचनाओं और ठोस समर्थन का केवल एक उप तक सीमित है। यहाँ, हम पुटिकाओं की आवश्यकता नहीं है, जो SLBs फार्म के क्रम में विलायक की सहायता लिपिड bilayer (SALB) गठन विधि कहा जाता है एक एक कदम सामान्य प्रक्रिया का वर्णन है। SALB विधि SLB गठन को गति प्रदान करने के लिए पानी-मिश्रणीय कार्बनिक सॉल्वैंट्स (जैसे, isopropanol) और जलीय बफर समाधान के साथ बाद में विलायक विनिमय की उपस्थिति में एक ठोस सतह पर लिपिड अणु के बयान भी शामिल है। निरंतर विलायक विनिमय कदम के आवेदन सक्षम बनाता हैनिगरानी बाईलेयर गठन और सतह के प्रति संवेदनशील biosensors के एक विस्तृत रेंज का उपयोग बाद में परिवर्तन के लिए उपयुक्त एक प्रवाह के माध्यम से विन्यास में विधि। SALB विधि पुटिका संलयन के लिए असभ्य हैं, जो उन सहित हाइड्रोफिलिक ठोस सतहों की एक विस्तृत श्रृंखला पर SLBs निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, यह पुटिका संलयन विधि का उपयोग कर तैयार नहीं किया जा सकता है, जो लिपिड रचनाओं की रचना SLBs के निर्माण में सक्षम बनाता है। इस के साथ साथ, हम दो उदाहरण हाइड्रोफिलिक सतहों, सिलिकॉन डाइऑक्साइड और सोने पर SALB और पारंपरिक पुटिका संलयन तरीकों के साथ प्राप्त परिणामों की तुलना करें। SALB विधि के माध्यम से उच्च गुणवत्ता तैयार bilayers की तैयारी के लिए प्रयोगात्मक शर्तों का अनुकूलन करने के लिए, बयान कदम में कार्बनिक विलायक के प्रकार, विलायक विनिमय की दर, और लिपिड एकाग्रता सहित विभिन्न मापदंडों के प्रभाव समस्या निवारण सुझावों के साथ साथ चर्चा की है । कोलेस्ट्रॉल के उच्च अंशों युक्त समर्थित झिल्ली का गठन भी राक्षसों हैझिल्ली विन्यास की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए SALB तकनीक की तकनीकी क्षमताओं पर प्रकाश डाला, SALB विधि के साथ trated।

Introduction

ठोस समर्थित लिपिड bilayer 1 (SLB) इस तरह की दोहरी परत मोटाई, दो आयामी लिपिड diffusivity, और झिल्ली जुड़े biomolecules की मेजबानी करने की क्षमता के रूप में biomembranes की बुनियादी विशेषताओं को बरकरार रखता है, जो एक बहुमुखी मंच है। कारण प्राकृतिक कोशिका झिल्ली की जटिलता के कारण, इस सरल मंच 3, वायरस और वायरस की तरह कण 4,5 बाध्यकारी बाध्यकारी ऐसे बेड़ा गठन 2, प्रोटीन के रूप में झिल्ली से संबंधित प्रक्रियाओं के इन विट्रो अध्ययन के लिए एक कुशल मंच के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया है , और सेल 6 संकेत। एक ठोस समर्थन करने के लिए करीब निकटता में स्थापित, SLB मंच ऐसे कुल आंतरिक प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (TIRF), क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance-अपव्यय (QCM-डी), और प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में सतह के प्रति संवेदनशील माप तकनीक की एक सीमा के साथ संगत है।

कई तरीकों एयर बबल सहित SLBs के विभिन्न प्रकार के निर्माण करने के लिए विकसित किया गया हैsubmicron आकार लिपिड स्पॉट ढहने 7 और डुबकी-कलम नैनोलिथोग्राफी 8, स्पिन कोटिंग बाईलेयर के ढेर और Langmuir-Blodgett (पौंड) 10 और पूर्ण फैले, एकल लिपिड bilayer कोटिंग्स के लिए पुटिका संलयन (एफ) 11 के लिए 9। वी एफ विधि एक सतत लिपिड दो परतों का निर्माण करने के लिए एक ठोस समर्थन और बाद में सहज टूटना और फ्यूजन करने के लिए छोटे unilamellar पुटिकाओं की सोखना के होते हैं। हालांकि, शारीरिक शर्तों के तहत, सहज पुटिका टूटना मुख्य रूप से ऐसे सिलिकॉन डाइऑक्साइड, ग्लास, और अभ्रक के रूप में सिलिकॉन आधारित सामग्री तक सीमित है। इसके अलावा, पुटिका टूटना ऐसे कोलेस्ट्रॉल या नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड की उच्च अंशों युक्त उन के रूप में जटिल लिपिड रचनाओं की पुटिकाओं के लिए अनायास नहीं होती है। सिस्टम पर निर्भर करता है, पुटिका टूटना आगे इस तरह तापमान 12, समाधान पीएच 13, और लवणता 14, आसमाटिक सदमे के रूप में 15 प्रयोगात्मक शर्तों सिलाई द्वारा प्रेरित किया जा सकता है 16, या इस तरह के सीए 2 के रूप में द्विसंयोजक आयनों के अलावा अप> या 17। वैकल्पिक रूप से, झिल्ली सक्रिय एएच पेप्टाइड की एक श्रृंखला पर पुटिका टूटना और bilayer गठन के लिए अग्रणी, adsorbed पुटिकाओं की एक परत को अस्थिर करने के क्रम में पेश किया जा सकता 18-22 सतहों।

इसके अलावा, सफल बाईलेयर गठन समय लगता है और कुछ झिल्ली रचनाओं के लिए प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है कि छोटे unilamellar पुटिकाओं की एक अच्छी तरह से नियंत्रित आबादी की तैयारी की आवश्यकता है। इसलिए, इष्टतम मामलों में अपनी उच्च दक्षता के बावजूद (जैसे, पुटिकाओं 23 के व्यापक फ्रीज पिघलना pretreatment के बाद), पुटिका संलयन के सामान्य आवेदन उपयुक्त substrates और झिल्ली रचनाओं के दायरे तक सीमित है।

विलायक की सहायता लिपिड bilayer (SALB) विधि 24-28 लिपिड vesicles की आवश्यकता नहीं है, जो एक विकल्प के निर्माण तकनीक है। विधि बयान ओ पर आधारित हैSLB गठन को गति प्रदान करने के क्रम में एक जलीय बफर समाधान के साथ इस विलायक के क्रमिक विनिमय के बाद एक पानी मिश्रणीय कार्बनिक विलायक की उपस्थिति में एक ठोस सतह पर च लिपिड अणु। विलायक विनिमय कदम, लिपिड, कार्बनिक विलायक के त्रिगुट मिश्रण है, और पानी के दौरान थोक समाधान में परतदार चरण संरचनाओं के गठन और ठोस सब्सट्रेट पर एक SLB की ओर जाता है जो पानी के अंश को बढ़ाने के साथ एक श्रृंखला के चरण में बदलाव आए। महत्वपूर्ण बात है, यह आत्म विधानसभा मार्ग आम तौर पर एक SLB में adsorbed पुटिकाओं के परिवर्तन के लिए कदम सीमित है जो पुटिका टूटना, के लिए की जरूरत को नजरअंदाज। प्रोटोकॉल सिलिकॉन डाइऑक्साइड, एल्यूमीनियम ऑक्साइड, क्रोम, इंडियम टिन ऑक्साइड, और सोने सहित सतहों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है। इस पत्र में और साथ वीडियो में, SALB और पुटिका संलयन तरीकों से लिपिड बयान की तुलना में प्रस्तुत किया है। विशेष रूप से, प्रयोगात्मक मापदंडों के प्रभाव, सहित लिपिड एकाग्रता, प्रवाह की दर, और SALB विधि द्वारा गठित दो परतों का निर्माण की गुणवत्ता पर पानी मिश्रणीय कार्बनिक विलायक के चुनाव, चर्चा कर रहे हैं। गढ़े SLBs का विश्लेषणात्मक लक्षण वर्णन (FRAP) तकनीक photobleaching के बाद QCM-डी, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और प्रतिदीप्ति वसूली द्वारा किया जाता है। QCM-डी निगरानी केलर और Kasemo 29 द्वारा आयोजित अग्रणी काम के बाद से, बड़े पैमाने पर मात्रात्मक बाईलेयर गठन जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जो एक सतह के प्रति संवेदनशील बड़े पैमाने पर माप तकनीक है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी झिल्ली एकरूपता का निरीक्षण करने के साथ ही झिल्ली डोमेन के दृश्य के लिए परमिट। FRAP तकनीक fluidic झिल्ली का एक आवश्यक संपत्ति है, जो एक SLB में लिपिड अणु के पार्श्व गतिशीलता निर्धारित करने के लिए एक मानक उपकरण है।

इस अध्ययन के पहले भाग सिलिकॉन डाइऑक्साइड और सोने पर बाईलेयर गठन का प्रयास करने के लिए लागू SALB की QCM-डी विश्लेषण और पुटिका संलयन तरीकों शामिल है। दूसरे भाग में,तैयारी और SALB विधि के साथ कोलेस्ट्रॉल सांद्रता का एक सीमा से युक्त समर्थित झिल्ली के लक्षण वर्णन प्रदर्शन कर रहे हैं और परिणाम पुटिका संलयन विधि द्वारा प्राप्त उन लोगों के साथ तुलना कर रहे हैं।

Protocol

एक हाइड्रोफिलिक ठोस समर्थन पर समर्थित लिपिड bilayer 1. गठन

  1. 10 मिलीग्राम / एमएल 1,2-dioleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine के लिपिड शेयर समाधान तैयार (DOPC) और 1 मिलीग्राम / एमएल 1,2-dioleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine- एन - (lissamine rhodamine बी संबंधित लिपिड पाउडर भंग द्वारा Sulfonyl) (आरएच पीई) (उचित isopropanol के समाधान में एक विश्लेषणात्मक जन संतुलन) के साथ पहले से तौला।
  2. पतला और अंतिम एकाग्रता में वांछित लिपिड मिश्रण तैयार करने के क्रम में isopropanol में स्टॉक समाधान मिश्रण। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और FRAP प्रयोगों के लिए, 0.5% wt आरएच पीई लिपिड मिश्रण में शामिल किया जाना चाहिए।
  3. यह भर जाता है जब तक microfluidic चैनल में isopropanol में लिपिड मिश्रण इंजेक्षन।
  4. लगभग 10 मिनट के लिए कांच की सतह पर लिपिड मिश्रण सेते हैं।
  5. धीरे-धीरे एक बहुत कम प्रवाह दर पर एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर पानी या बफर समाधान के साथ लिपिड समाधान की जगह(10-50 μl / मिनट)। वैकल्पिक रूप से, बार-बार pipetting द्वारा लिपिड मिश्रण की जगह।
  6. अवशिष्ट isopropanol हटाने के लिए आदेश में अतिरिक्त बफर के साथ अच्छी तरह से चैनल कुल्ला।

कोलेस्ट्रॉल समृद्ध समर्थित झिल्ली के 2. गठन

नोट: ठोस सतह (2 Sio) पुटिका संलयन का समर्थन करता है, लेकिन कोलेस्ट्रॉल समृद्ध पुटिकाओं उच्च कठोरता 30 झुकने है क्योंकि झिल्ली रचना (उच्च कोलेस्ट्रॉल) पुटिका संलयन को रोकता है।

  1. पहले isopropanol में संबंधित पाउडर भंग द्वारा 10 मिलीग्राम / एमएल DOPC लिपिड, 10 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल, और 1 मिलीग्राम / एमएल आरएच पीई युक्त एक शेयर समाधान तैयार है।
  2. दोहराएँ कदम 2.1 में तैयार शेयर समाधान का उपयोग 1.2-1.6 कदम।

3. झिल्ली तरलता परख

  1. 10 मिनट के लिए सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) समाधान (1%) में कांच स्लाइड विसर्जित कर दिया।
  2. विआयनीकृत पानी से अच्छी तरह स्लाइड्स धो लें और बुद्धि कुल्लाज इथेनॉल।
  3. झटका-सूखी नाइट्रोजन की एक सौम्य धारा का उपयोग कर स्लाइड।
  4. ऑक्सीजन प्लाज्मा चैम्बर में अधिकतम रेडियोफ्रीक्वेंसी बिजली पर 30 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के लिए स्लाइड बेनकाब।
  5. अथाह वाणिज्यिक microfluidic कक्ष (चित्रा 1 ए) के सुरक्षात्मक फिल्म कोटिंग एक चिमटी का उपयोग कर निकालें और कक्ष (चित्रा 1 बी) के चिपचिपा पक्ष पर कांच स्लाइड देते हैं।
  6. चैम्बर के इनलेट और आउटलेट की स्थिति में कनेक्टर्स और ट्यूबिंग इकट्ठा और खुर्दबीन मंच (चित्रा 1 सी) पर microfluidic चैनल जगह है।
  7. Microfluidic चैनल में एक fluorescently लेबल समर्थित लिपिड दो परतों का निर्माण [वांछित लिपिड रचना का उपयोग कर दोहराने कदम 1 (उदाहरण के लिए, 0.5 मिलीग्राम / एमएल DOPC) 0.5% wt आरएच पीई कार्बनिक विलायक में सहित]।
  8. छवियों पर कब्जा करने के क्रम में एक 60x तेल विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.49) के साथ bilayer विमान का पता लगा।
  9. दो पूर्व ब्लीच छवियों लो, तो एक 30 तस्वीर ब्लीच1, एक 532 एनएम, 100 मेगावाट लेजर बीम के साथ विस्तृत परिपत्र मौके हूँ। इसकी तीव्रता स्थिर हो गया है, जब तक photobleaching से पहले, लेजर गर्म। इसके तत्काल बाद photobleaching, प्रक्षालित मौके पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में वसूली का पालन करने के क्रम में 2 मिनट के लिए हर 1 सेकंड छवियों की एक श्रृंखला पर कब्जा।

4. कोलेस्ट्रॉल की मात्रा परख

  1. ऑक्सीजन प्लाज्मा चैम्बर में अधिकतम रेडियोफ्रीक्वेंसी बिजली पर 30 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा सिलिकॉन डाइऑक्साइड लेपित क्वार्ट्ज क्रिस्टल सेंसर चिप को बेनकाब। चैम्बर से चिप निकालें और तुरंत माप कक्ष में चिप माउंट।
  2. प्रयोग से पहले, पहले उचित बढ़ते सुनिश्चित करने के लिए हवा में सेंसर चिप की आवृत्ति और अपव्यय हासिल।
    1. वाणिज्यिक क्यू नब्ज ई 1 या इ 4 QCM-डी साधन के लिए, क्यू शीतल सॉफ्टवेयर प्रोग्राम चलाने के लिए और "अधिग्रहण" क्लिक करें और "सेटअप मापन" का चयन करें।
    2. प्रतीत होता है, जो नई विंडो में, 3, 5, 7 की जांच, 9, 11 और 13 मकसद और फिर पता है और प्रतिध्वनि स्पेक्ट्रा की जाँच करने के क्रम में चलाएँ क्लिक करें। 24 में तापमान सेट सी। एक या एक से अधिक प्रतिध्वनि आवृत्तियों की उम्मीद मूल्यों के साथ सहमत नहीं हैं, तो बढ़ते चिप की जाँच करें और एक समझौते पर पहुँच गया है जब तक इस कदम को फिर से प्रदर्शन करते हैं।
  3. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप शुरू और 100 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर माप के चेंबर में बफर समाधान (10 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, पीएच 7.5) प्रवाह।
  4. सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में, "अधिग्रहण" क्लिक करें और अनुनाद आवृत्ति और ऊर्जा का अपव्यय संकेतों को दर्ज करने के क्रम में "पुनः प्रारंभ मापन" का चयन करें। एक स्थिर आधारभूत आवृत्ति और अपव्यय बदलाव के लिए प्राप्त की है जब तक इस चरण को दोहराएँ। नोट: समय के एक समारोह के रूप में दर्ज किया जा सकता है, जो अतिरिक्त आवृत्ति और अपव्यय पारियों हो जाएगा इसके बाद चरणों के लिए।
  5. 10 मिनट के लिए (लिपिड के बिना) isopropanol इंजेक्षन।
  6. पर DOPC लिपिड / कोलेस्ट्रॉल का मिश्रण इंजेक्षन10 मिनट के लिए isopropanol में 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर की कुल लिपिड एकाग्रता के साथ वांछित दाढ़ अनुपात।
  7. 100 μl / मिनट के प्रवाह की दर पर 20 मिनट के लिए बफर इंजेक्षन।
  8. बफर (दर 100 μl / मिनट प्रवाह) आवृत्ति संकेत एक स्थिर मूल्य तक पहुँच जाता है, जब तक में तैयार किया 1 मिमी मिथाइल-β-cyclodextrin (MβCD) का एक समाधान इंजेक्षन।
  9. MβCD उपचार कदम के कारण होता है कि रिश्तेदार सकारात्मक आवृत्ति पारियों उपाय और [Δm = Sauerbrey समीकरण का उपयोग करके बड़े पैमाने पर मूल्यों के Δf चो और Δf DOPC मूल्यों परिवर्तित करके कोलेस्ट्रॉल और DOPC लिपिड के द्रव्यमान की गणना - (सी / एन) × Δf, जहां सी = 17.7 एनजी / 2 सेमी, N: जगा है]।
  10. खाते में DOPC लिपिड (786.1 ग्राम / मोल) और कोलेस्ट्रॉल (386.6 ग्राम / मोल) की आणविक भार ले जा रही है, SLB में कोलेस्ट्रॉल की तिल अंश की गणना।

Representative Results

हाइड्रोफिलिक substrates पर समर्थित लिपिड bilayers का निर्माण।

VF और SALB गठन के तरीकों सिलिकॉन डाइऑक्साइड और सोने और QCM-डी माप तकनीक द्वारा वास्तविक समय में निगरानी की गई गठन की प्रक्रिया पर प्रयास किया गया था। क्रिस्टल की सतह पर बड़े पैमाने पर सोखना पर एक oscillating पीजोइलेक्ट्रिक क्वार्ट्ज क्रिस्टल के अनुनाद आवृत्ति (Δ एफ) में QCM-डी साधन उपायों परिवर्तन। इसके अलावा, QCM-डी साधन adlayer के viscoelastic गुण (कठोरता और कोमलता) को चिह्नित करने के क्रम में दोलन ऊर्जा के अपव्यय को मापता है। पहले से 31 के रूप में वर्णित पुटिका संलयन प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया। संक्षेप में, एक आधारभूत पहले जलीय बफर समाधान [10 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, पीएच 7.5 में आवृत्ति और अपव्यय संकेतों के लिए स्थापित किया गया था; (2A चित्रा और बी)]। इसके बाद, एक ही बफर में छोटे unilamellar DOPC लिपिड पुटिकाओं में थेसिलिकॉन डाइऑक्साइड (2A चित्रा) और सोने पर टी = 10 मिनट पर jected (1 तीर) (चित्रा 2 बी)। क्रमश: 6, - सिलिकॉन डाइऑक्साइड पर पुटिका संलयन के लिए, दो कदम सोखना कैनेटीक्स आवृत्ति और ऊर्जा -26 (± 1) हर्ट्ज के अपव्यय और 0.3 में अंतिम परिवर्तन (0.2 ±) 10 × के साथ मनाया गया। इन मूल्यों को एक समर्थित लिपिड bilayer 29 के गठन के साथ संगत कर रहे हैं।

चित्रा 2 बी में दिखाया गया है उनके मूल्यों हर्ट्ज (10 ±) -150 पर पहुंच गया और जब तक, सोने की सतह के लिए पुटिका समाधान के अलावा, क्रमशः Δ एफ और Δ डी का संकेत है, में एक साथ कमी और वृद्धि करने के लिए नेतृत्व (7.5 ± 2) क्रमश: 10-6 ×। इन मूल्यों को एक adsorbed पुटिका परत के गठन के अनुरूप हैं। इस प्रकार, उम्मीद के रूप में, एक SLB पुटिका संलयन विधि के माध्यम से सोने पर नहीं बनाई गई थी।

क्यूसीSALB विधि द्वारा सिलिकॉन डाइऑक्साइड और सोने पर बाईलेयर गठन के लिए एमडी विश्लेषण चित्रा -2 सी और डी में प्रस्तुत किया है। 6, क्रमश: प्राप्त किया गया और इन मूल्यों को एक SLB के गठन का संकेत मिलता है - सिलिकॉन डाइऑक्साइड, -25.6 (0.55 ±) के अंतिम Δ एफ और Δ डी पारियों हर्ट्ज और (0.27 ±) 0.4 पर 10 ×। Δ एफ और Δ डी के इसी पर्वतमाला (Δ Au: -27.3 ± 2.7 हर्ट्ज, Δ डी Au: 0.48 (0.26 ±) × 10-6) सोने पर मनाया गया। इन परिणामों के SALB विधि पुटिका टूटना रोकने के लिए जो सतहों पर समर्थित लिपिड bilayers के गठन के लिए सक्षम बनाता है कि समर्थन करते हैं।

समर्थित लिपिड bilayers की गुणवत्ता पर विलायक विनिमय प्रवाह की दर का प्रभाव।

उच्च गुणवत्ता समर्थित लिपिड bilayers छठी के निर्माण के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिएएक SALB विधि, लिपिड एकाग्रता, विलायक विनिमय दर और कार्बनिक विलायक के चुनाव के प्रभाव की जांच की गई।

दो अलग अलग प्रवाह दरों (100 और 600 μl / मिनट) और दो ​​अलग अलग लिपिड सांद्रता (0.125 और 0.5 मिलीग्राम / एमएल) में सिलिकॉन डाइऑक्साइड पर प्रदर्शन के रूप में चित्रा 3, SALB प्रोटोकॉल के अंतिम चरण के दौरान QCM-डी आवृत्ति में परिवर्तन को दर्शाता है ।

0.5 मिलीग्राम / एमएल DOPC लिपिड (चित्रा 3) का इस्तेमाल किया गया था, जब बाईलेयर गठन प्रवाह दर और दोनों प्रवाह दरों पर प्राप्त किया गया था के बारे में -26 हर्ट्ज की एक अंतिम Δf पारी से प्रभावित नहीं था।

इसके विपरीत, एक कम लिपिड एकाग्रता इस्तेमाल किया गया था, जब पूरा विलायक विनिमय के बाद adsorbed लिपिड की मात्रा काफी प्रवाह की दर (3B चित्रा) से प्रभावित था। 100 μl / मिनट की एक औसत प्रवाह दर पर, बाईलेयर गठन (-26 हर्ट्ज के आसपास Δf) पूरा हो गया था। हालांकि, एक 6 गुना उच्च प्रवाह की दर पर (600 μl / मिनट), एक पूरा बाईलेयर -17 हर्ट्ज के आसपास (Δf) का गठन नहीं किया गया था। इन परिणामों के पसंद के कार्बनिक विलायक के रूप में isopropanol साथ SALB विधि का प्रयोग सफल बाईलेयर गठन के लिए सही प्रयोगात्मक शर्तों को चुनने के लिए एक दिशानिर्देश प्रदान करते हैं।

विभिन्न शराब समाधान में अलग लिपिड सांद्रता से गठित समर्थित लिपिड bilayers की विशेषता।

लिपिड एकाग्रता SALB विधि का उपयोग करके प्राप्त SLBs की गुणवत्ता को प्रभावित करता है कि एक और पैरामीटर है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 0.05 मिलीग्राम / एमएल लिपिड एकाग्रता में, केवल अलग-थलग, उप सूक्ष्म लिपिड संरचनाओं (चित्रा -4 ए) का गठन किया गया, कि पता चला। SALB प्रक्रिया में इस्तेमाल किया लिपिड एकाग्रता में वृद्धि के साथ, लिपिड संरचनाओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता अधिक समरूप बन गया। संरचनाओं पूरे च में विस्तार नहीं किया था, हालांकि 0.1 मिलीग्राम / एमएल लिपिड एकाग्रता में सूक्ष्म लिपिड पैच रहे थेदेखने के ield (चित्रा 4 बी)। 0.25 मिलीग्राम / एमएल लिपिड एकाग्रता इस्तेमाल किया गया था हालांकि, जब एक समरूप लिपिड bilayer (चित्रा 4C) का गठन किया गया था। इसलिए, एक पूर्ण, पूर्ण फैले SLB बनाने के लिए आवश्यक एक न्यूनतम लिपिड एकाग्रता है।

SALB प्रयोगों के अंतिम परिणाम पर लिपिड एकाग्रता का प्रभाव भी एक व्यापक लिपिड एकाग्रता रेंज (0.01 5 मिलीग्राम / एमएल) और विभिन्न कार्बनिक सॉल्वैंट्स में (isopropanol, इथेनॉल, और एन propanol) पर जांच की गई थी। Δ एफ और SALB प्रक्रिया में अंतिम चरण के लिए इसी Δ डी मूल्यों चित्रा 5 में प्रस्तुत कर रहे हैं।

हम क्रमशः -25 और -30 हर्ट्ज और कम से कम 0.5 x 10 -6 के बीच आवृत्ति और ऊर्जा का अपव्यय में अंतिम परिवर्तन के आधार पर बाईलेयर गठन को परिभाषित किया। इन मानदंडों के आधार पर, इष्टतम लिपिड एकाग्रता रेंज एक समर्थित लिपिड bilayer 0.1 और 0.5 मिलीग्राम के बीच होने के लिए निर्धारित किया गया था, के लिए फार्म का/ एमएल कार्बनिक विलायक के प्रकार का काफी हद तक स्वतंत्र। अधिग्रहण किया Δ एफ और Δ डी में विचलन के बाहर ऊपर उल्लिखित रेंज के बदलाव अतिरिक्त द्रव्यमान (जैसे, बाईलेयर ढेर), गैर बाईलेयर morphologies की घटना (जैसे, पुटिकाओं, कीड़ा की तरह मिसेलस) की उपस्थिति की वजह से है, और सब्सट्रेट भर अधूरा आकृति विज्ञान के साथ खंडित बाईलेयर द्वीपों की उपस्थिति।

प्राप्त समर्थित लिपिड bilayers को SALB प्रक्रिया अपेक्षाकृत मजबूत है, उच्च गुणवत्ता वाले बाईलेयर गठन के लिए इष्टतम लिपिड एकाग्रता विशिष्ट प्रयोगात्मक विन्यास पर निर्भर करता है ट्यूनिंग आवश्यकता हो सकती है। असल में, एक न्यूनतम लिपिड एकाग्रता लेकिन यह भी SALB विधि के माध्यम से इष्टतम बाईलेयर गठन के लिए आवश्यक एक अधिकतम लिपिड एकाग्रता न केवल वहाँ है। इष्टतम एकाग्रता रेंज प्रवाह की दर पर निर्भर करता है और यह भी सब्सट्रेट और लिपिड रचना से प्रभावित हो जा सकता है। अनुभव से, कई मामलों में, हम एफ हैound 0.5 मिलीग्राम / एमएल और 100 μl के प्रवाह की दर की एक लिपिड एकाग्रता कि / मिनट एक समरूप समर्थित लिपिड bilayer के गठन के लिए शर्तों का इष्टतम सेट है। हालांकि, लिपिड रचना और प्रवाह सेल ज्यामिति-उत्तरार्द्ध पर निर्भर करता है जो की आवश्यक हो सकता है लिपिड एकाग्रता की विलायक एक्सचेंज आगे अनुकूलन के दौरान प्रवाह प्रोफ़ाइल को प्रभावित करता है। इस प्रकार, हम QCM-डी या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग कर दो परतों का निर्माण गुणवत्ता के एक 0.5 मिलीग्राम / एमएल लिपिड एकाग्रता का उपयोग करने और आकलन पायलट SALB प्रयोगों प्रदर्शन सलाह देते हैं। Bilayers अधूरा दिखाई देते हैं संतोषजनक परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब तक, तब लिपिड एकाग्रता 10% वेतन वृद्धि में वृद्धि की जानी चाहिए। बाईलेयर अतिरिक्त लिपिड संरचनाओं के साथ सह अस्तित्व के लिए प्रकट होता है संतोषजनक परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब तक, तब लिपिड एकाग्रता 10% वेतन वृद्धि में कमी आनी चाहिए।

विभिन्न लिपिड रचनाओं और घ के साथ समर्थित लिपिड bilayers का निर्माणifferent कोलेस्ट्रॉल अंशों।

इसके बाद, SALB और VF तरीकों कोलेस्ट्रॉल समृद्ध SLBs फार्म के क्रम में कार्यरत थे। 6 SALB विधि द्वारा तैयार कोलेस्ट्रॉल युक्त समर्थित झिल्ली के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों (100 × 100 माइक्रोन) से पता चलता है। झिल्ली वर्दी फ्लोरोसेंट चमक द्वारा विशेषता एक सतत चरण से घिरे परिपत्र आकार का डाई बहिष्कृत डोमेन से मिलकर बनता है। अंधेरे डोमेन के अग्रदूत लिपिड मिश्रण में कोलेस्ट्रॉल अंश में वृद्धि के साथ क्षेत्र में वृद्धि हुई है। इसके बाद, FRAP माप लिपिड bilayer फिल्मों की तरलता की जांच करने के क्रम में प्रदर्शन किया गया। FRAP माप पार्श्व लिपिड की गतिशीलता और एक भी लिपिड bilayer के इस प्रकार के गठन का संकेत है, आसपास के चरण में लगभग पूरा प्रतिदीप्ति वसूली का पता चला। अधिमान्यतया द्रव चरण में आरएच पीई विभाजन के बाद से, अंधेरे डोमेन के सबसे अधिक संभावना घने कोलेस्ट्रॉल समृद्ध संरचनाओं से बना रहे हैं। तुलना के लिए, वी एफ विधि का उपयोग DOPC / चोल bilayers का निर्माण भी प्रयास किया गया था। पुटिका बाहर निकालना विधि द्वारा तैयार किया गया है - (40 मोल% 10) DOPC कोलेस्ट्रॉल अंशों में वृद्धि के साथ vesicles। आरएच पीई लिपिड (0.5% WT) इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट लेबल के रूप में इस्तेमाल किया गया था। 7 कोलेस्ट्रॉल युक्त पुटिकाओं के साथ कांच substrates के ऊष्मायन पर बनाया संरचनाओं के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों (100 × 100 माइक्रोन) से पता चलता है। FRAP विश्लेषण 20 मोल% चोल या उससे कम है कि निहित पुटिकाओं का उपयोग कर एक fluidic लिपिड bilayer के गठन दिखाया। हालांकि, नमूने adsorbed लेकिन unruptured पुटिकाओं की उपस्थिति का संकेत वसूली प्रदर्शन नहीं किया उच्च कोलेस्ट्रॉल भिन्न के साथ पुटिकाओं का उपयोग करके तैयार किया।

अंततः समर्थित लिपिड bilayers में शामिल किया गया था, जो कोलेस्ट्रॉल के अंश का अग्रदूत होंठ में शामिल किया गया था, जो कोलेस्ट्रॉल अंश के एक समारोह के रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था,SALB विधि में या VF विधि में जलीय घोल में पुटिकाओं में कार्बनिक विलायक में आईडी मिश्रण। QCM-डी तकनीक का उपयोग करना, बाईलेयर गठन नजर रखी थी और उसके बाद MβCD विशेष रूप से समर्थित लिपिड bilayers 32 से चोल निकालने के क्रम में जोड़ा गया है। SLB के साथ जुड़े (| | Δ एफ) की वजह से कोलेस्ट्रॉल को हटाने के लिए बड़े पैमाने पर नुकसान आवृत्ति परिवर्तन के निरपेक्ष मूल्य में कमी करने के लिए नेतृत्व किया। MβCD उपचार कदम की वजह से रिश्तेदार सकारात्मक आवृत्ति पारियों चित्रा 8A में दिखाए जाते हैं। चित्रा 8B के रूप में पेश कोलेस्ट्रॉल की तिल अंश, आवृत्ति पारी के आधार पर गणना की गई।

SALB विधि द्वारा तैयार समर्थित लिपिड bilayers में शामिल कोलेस्ट्रॉल अंश अग्रदूत लिपिड मिश्रण में कोलेस्ट्रॉल सामग्री के लिए लगभग रेखीय समानुपाती था। दिलचस्प है, वी एफ विधि द्वारा तैयार bilayers में कोलेस्ट्रॉल अंश (पुटिकाओं करने के लिए ऊपर से युक्त20 मोल% चोल) अग्रदूत पुटिकाओं में निहित है कि तुलना में काफी कम था। वास्तव में, वी एफ विधि द्वारा प्राप्त कोलेस्ट्रॉल के उच्चतम अंश के बारे में केवल 10 मोल% थी।

कोलेस्ट्रॉल फॉस्फोलिपिड की β-दो चरण सह-अस्तित्व क्षेत्र में धारी अधिरचना का अवलोकन लिपिड bilayers का समर्थन किया।

SALB प्रयोगों आगे कोलेस्ट्रॉल का एक भी उच्च अंश के साथ एक लिपिड मिश्रण का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। 4: जब DOPC और कोलेस्ट्रॉल के 6 मिश्रण का इस्तेमाल किया गया था, दो coexisting चरणों में एक समान तरल चरण के एक क्रमिक demixing एक अंधेरी (डाई को छोड़कर) की पृष्ठभूमि पर उज्ज्वल पट्टी के आकार का डोमेन के रूप में कल्पना की चित्रा (9) मनाया गया। यह आरएच पीई कोलेस्ट्रॉल युक्त डोमेन के 33, और इसलिए पृष्ठभूमि के रूप में दिखाई दिया जो प्रबल अंधेरे डोमेन से कोलेस्ट्रॉल समृद्ध क्षेत्रों के हैं बाहर रखा गया है कि स्थापित है। पर एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर माइक्रोन आकार उज्ज्वल डोमेन के गठन हायजीएच कोलेस्ट्रॉल अंश (> 50 मोल%) कोलेस्ट्रॉल / फॉस्फोलिपिड मिश्रण 34,35 के monolayer चरण आरेख में β क्षेत्र के अनुरूप है। इसके अलावा, एक कमजोर लाइन तनाव से पैदा होती है जो धारी डोमेन के गठन के मिश्रण एक miscibility महत्वपूर्ण बिंदु के पास है कि पता चलता है।

चित्र 1
Epifluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए एक उपयुक्त विन्यास में SALB गठन के लिए चित्रा 1. Microfluidic चैम्बर। (ए) ऑफिस microfluidic चैम्बर, (बी) के चैम्बर के चिपकने वाला पक्ष पर संलग्न गिलास coverslip, (सी) में जुड़ा ट्यूबिंग के साथ एक खुर्दबीन धारक पर पूरा सेटअप चैम्बर के इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों, और (डी) क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप विलायक विनिमय की दर को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Isopropanol में भंग लिपिड माप chamb में इंजेक्ट कर रहे हैंएर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप की सहायता के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
सिलिकॉन डाइऑक्साइड और सोने substrates पर पुटिका संलयन और SALB प्रयोगों की चित्रा 2. QCM-डी विश्लेषण। QCM-डी आवृत्ति (Δf, नीला) और अपव्यय तीसरे overtone के लिए (ΔD, लाल) प्रतिक्रियाएं (एन = 3) एक के रूप में दर्ज किया गया लिपिड पर सोखना (ए और सी) सिलिकॉन डाइऑक्साइड, (बी और डी) सोने के दौरान समय का कार्य करते हैं। पैनलों ए और बी पुटिका संलयन तरीका मौजूद है। DOPC लिपिड पुटिकाओं (1 तीर) टी = 10 मिनट में इंजेक्ट किया गया। पैनलों सी और डी SALB गठन विधि के अनुरूप हैं। तीर बफर (1), isopropanol isopropanol में (2), लिपिड मिश्रण [0.5 मिलीग्राम / एमएल DOPC लिपिड के इंजेक्शन से संकेत मिलता है; (3)] ​​और शौकीनएर एक्सचेंज (4)। पैनल बी में धराशायी वक्र लिपिड इंजेक्शन नहीं दिया गया था, जिसमें एक नियंत्रण प्रयोग से मेल खाती है। प्रत्येक सतह के लिए Δf और ΔD का अंतिम संस्कार निर्दिष्ट कर रहे हैं। अंतिम आवृत्ति और अपव्यय पारियों से inferred के रूप में योजनाबद्ध प्रस्तावित इकट्ठे लिपिड संरचनाओं दिखा। संदर्भ 24 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
SALB गठन की प्रक्रिया पर विलायक विनिमय दर के 3. प्रभाव चित्रा। SALB विधि में QCM-डी आवृत्ति पाली (Δf) अंतिम चरण के लिए इसी (चित्रा -2 सी में तीर 4 देखें) दो अलग अलग विनिमय दरों, 100 और 600 μl / मिनट, यू में सिलिकॉन डाइऑक्साइड पर मापा गया गाना (ए) 0.5 मिलीग्राम / एमएल और isopropanol में (बी) 0.125 मिलीग्राम / एमएल DOPC लिपिड। जलीय बफर समाधान में माप आधारभूत की तुलना में अंतिम Δf मूल्यों को भी निर्दिष्ट कर रहे हैं। संदर्भ 24 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
पूरा SALB गठन के लिए लिपिड एकाग्रता की चित्रा 4. दहलीज (ए) 0.05 मिलीग्राम / एमएल का उपयोग कर SALB द्वारा तैयार सिलिकॉन डाइऑक्साइड पर लिपिड परतों के Epifluorescence माइक्रोस्कोपी। (बी) के 0.1 मिलीग्राम / एमएल; और (सी) 0.25 मिलीग्राम / एमएल लिपिड एकाग्रता। संदर्भ 26 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया।/files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
SALB विधि द्वारा लिपिड एकाग्रता और समर्थित लिपिड bilayer गठन पर कार्बनिक विलायक के चित्रा 5. प्रभाव। QCM-डी में अंतिम परिवर्तन (ए) आवृत्ति और लिपिड के एक समारोह के रूप में विभिन्न कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग SALB प्रयोगों के लिए (बी) ऊर्जा का अपव्यय, एकाग्रता। धराशायी हरे रंग की लाइनों एक पूरा बाईलेयर (-30 हर्ट्ज <Δf <-25 हर्ट्ज और ΔD <1 एक्स 10 -6) के लिए उम्मीद की आवृत्ति और अपव्यय पारियों के अनुरूप हैं। संदर्भ 26 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। इस फाई का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंGure।

चित्रा 6
एक गिलास सब्सट्रेट पर SALB विधि द्वारा तैयार कोलेस्ट्रॉल के भागों के साथ अलग समर्थित लिपिड bilayers के विश्लेषण के बाद photobleaching चित्रा 6 प्रतिदीप्ति वसूली। Bilayers की (एई) प्रतिदीप्ति micrographs अग्रदूत मिश्रण में विभिन्न कोलेस्ट्रॉल अंशों का उपयोग कर तैयार। छवियाँ photobleaching के तुरंत बाद (ऊपर) और 1 मिनट (मध्य) दर्ज किया गया। छवि केन्द्र में अंधेरे स्थान photobleached क्षेत्र से मेल खाती है। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन हैं। प्रत्येक नमूने के भीतर अलग-अलग डाई बहिष्कृत डोमेन की सतह क्षेत्र histograms भी (नीचे) प्रस्तुत कर रहे हैं। संदर्भ 36 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
पुटिका संलयन विधि द्वारा तैयार कोलेस्ट्रॉल युक्त समर्थित bilayers 7. FRAP विश्लेषण चित्रा। Bilayers की (ई) प्रतिदीप्ति micrographs अग्रदूत पुटिकाओं में, विभिन्न कोलेस्ट्रॉल भिन्न (10 से 40 मोल%) का उपयोग कर तैयार। छवियाँ photobleaching के तुरंत बाद (ऊपर) और 1 मिनट (नीचे) दर्ज किया गया। छवि केन्द्र में अंधेरे स्थान photobleached क्षेत्र से मेल खाती है। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन हैं। संदर्भ 36 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
8 चित्रा क्यूसमर्थित लिपिड bilayers में कोलेस्ट्रॉल अंश का antification। (ए) (0 और 50 मोल% के बीच) अग्रदूत मिश्रण में कोलेस्ट्रॉल की तिल अंशों के साथ अलग समर्थित लिपिड bilayers पर 1 मिमी MβCD के इंजेक्शन पर सकारात्मक QCM-डी आवृत्ति परिवर्तन। (बी) के अग्रदूत मिश्रण या पुटिकाओं में कोलेस्ट्रॉल अंश के रूप में एक समारोह SALB और पुटिका संलयन तरीकों से तैयार bilayers से समाप्त कोलेस्ट्रॉल का तिल प्रतिशत। संदर्भ 36 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
6 दाढ़ अनुपात conta: DOPC / चोल (4 के एक समर्थित bilayer में प्रतिदीप्ति microstructure की 9 चित्रा समय आधारित विकासSALB विधि द्वारा तैयार 0.5% Rhodamine पीई) ining। एक समान चरण धीरे-धीरे चरण पूरा विलायक विनिमय पर एक तरल-तरल सह-अस्तित्व के क्षेत्र में अलग करती है। संदर्भ 37 से अनुकूलित और अमेरिकन केमिकल सोसायटी की अनुमति के साथ इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस काम में, एक विलायक विनिमय प्रोटोकॉल एक ठोस समर्थन के साथ incubated हैं शराब (isopropanol, इथेनॉल, या एन-propanol) में जो लिपिड में प्रस्तुत किया जाता है और फिर शराब एक श्रृंखला ड्राइव करने के क्रम में एक जलीय बफर समाधान के साथ धीरे-धीरे बदल दिया जाता है संक्रमण चरण के अंत में परतदार चरण लिपिड bilayers 24 का निर्माण किया। यह विधि ऐसे पुटिका संलयन विधि को असभ्य है, जो सोने के रूप में सतहों पर समर्थित लिपिड bilayers के निर्माण के लिए सक्षम बनाता है कि दिखाया गया है।

एक इष्टतम लिपिड एकाग्रता रेंज (0.1-0.5 मिलीग्राम / एमएल) इस प्रकार अब तक का परीक्षण मानक प्रयोगात्मक प्रारूपों में पूरा बाईलेयर गठन के लिए निर्धारित किया गया है। Bilayers की 0.1 मिलीग्राम / एमएल, असतत, सूक्ष्म पैच नीचे लिपिड सांद्रता में गठन किया था। दूसरी ओर, 0.1 मिलीग्राम / एमएल ऊपर सांद्रता और कम से कम से कम 0.5 मिलीग्राम / एमएल, एक पूर्ण और वर्दी बाईलेयर का गठन किया है। इस सीमा से ऊपर लिपिड सांद्रता में, एक तरल पदार्थ की दोहरी परत अभी भी verifi के रूप में गठन किया गया थाFRAP विश्लेषण द्वारा एड, तथापि, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी bilayer के शीर्ष पर अतिरिक्त लिपिड संरचनाओं की उपस्थिति का पता चलता है। QCM-डी विश्लेषण द्वारा निर्धारित के रूप में आश्चर्यजनक, इन अतिरिक्त लिपिड संरचनाओं की आकृति विज्ञान, ऊष्मायन चरण के दौरान इस्तेमाल किया गया था, जिसमें शराब पर निर्भर करता था। इथेनॉल के मामले में अपेक्षाकृत उच्च Δ एफ और Δ डी पारियों एक adsorbed पुटिका परत के लिए प्राप्त QCM-डी हस्ताक्षर जैसे लगते हैं। Isopropanol या एन-propanol बजाय इस्तेमाल किया गया था जब Δ डी appreciably अधिक था, जबकि Δ एफ, एक bilayer (-30 हर्ट्ज -40 के बीच अंतिम Δ एफ) के लिए उम्मीद मूल्य की तुलना में थोड़ा अधिक था। इस तरह के QCM-डी प्रतिक्रियाएं (कुछ मामलों में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई के रूप में) झिल्ली सतह से बाहर की ओर फैला हुआ बढ़ाया लिपिड संरचनाओं (जैसे, कीड़ा की तरह मिसेलस) के लिए उम्मीद होगी।

विलायक विनिमय की दर espec, महत्वपूर्ण हो सकता है, जो एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर हैकम लिपिड सांद्रता (जैसे, 0.1 मिलीग्राम / एमएल) का इस्तेमाल किया जाता है ially जब। कम लिपिड एकाग्रता में रैपिड विलायक विनिमय अधूरा bilayers के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इस पत्र में QCM-डी माप (क्यू नब्ज इ 4 माप कक्ष), करीब 100 μl / मिनट के प्रवाह की दर के लिए इस्तेमाल मानक माप कक्ष में, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पूरा बाईलेयर गठन के लिए उपयुक्त थे। अन्य geometries और मात्रा के साथ प्रवाह कोशिकाओं के लिए, इष्टतम प्रवाह की दर अलग-अलग हो सकते हैं और अनुभव से इस के साथ साथ सुझाव कदम के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए।

पुटिका संलयन के लिए असभ्य हैं, जो सतहों पर समर्थित लिपिड bilayers फार्म के अलावा, SALB जिससे परिसर रचनाओं के साथ समर्थित झिल्ली का निर्माण करने के लिए दरवाजा खोलने, टूटना सकते हैं जो लिपिड पुटिकाओं के लिए की जरूरत को नाकाम करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। एक उदाहरण उदाहरण संरचना के रूप में, कोलेस्ट्रॉल की एक उच्च अंश के साथ लिपिड मिश्रण की जांच की गई। कोलेस्ट्रॉल mamm का एक महत्वपूर्ण घटक हैAlian कोशिका झिल्ली, और उसके अंश (एरिथ्रोसाइट्स में, उदाहरण के लिए) झिल्ली लिपिड रचना की 45-50% mol रुख कर सकते हैं। इस प्रकार, एक मानव कोशिका झिल्ली का प्रतिनिधित्व एक लिपिड bilayer की भी एक साधारण मॉडल कोलेस्ट्रॉल को शामिल करना चाहिए।

पुटिका संलयन केवल 10-15% कोलेस्ट्रॉल युक्त fluidic लिपिड bilayers निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि 36 (QCM-डी माप द्वारा मात्रा के रूप में, 57 मोल% तक), SALB विधि कोलेस्ट्रॉल के उच्च अंशों युक्त fluidic लिपिड bilayers के गठन के लिए सक्षम बनाता है। कोलेस्ट्रॉल के स्तर को आगे (63 मोल% तक) ऊपर उठाया गया था हालांकि, जब धारी आकार डोमेन के 37 मनाया गया। सह मौजूदा डोमेन के हवा-पानी इंटरफेस में कोलेस्ट्रॉल / फॉस्फोलिपिड monolayer के चरण आरेख में β क्षेत्र में मनाया उन की याद ताजा तरल थे।

कुल मिलाकर, SALB विधि मैं विशेष रूप से, समर्थित लिपिड bilayers फार्म के लिए एक सरल और कुशल दृष्टिकोण होना दिखाया गया हैपारंपरिक पुटिका संलयन विधि के दायरे से परे एन के मामले हैं। इस प्रकार अब तक, QCM-डी तकनीक और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी मुख्य रूप से SALB विधि द्वारा गठित समर्थित लिपिड bilayers चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। आगे देख रहे हैं, सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) 38, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 39,40 सहित सतह के प्रति संवेदनशील विश्लेषणात्मक माप तकनीक, का एक व्यापक रेंज, अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी 41 फूरियर बदलना, एक्स-रे 42 और न्यूट्रॉन परावर्तन 43, कर सकते हैं आगे विशेषताएँ और सरल और जटिल बाईलेयर विन्यास SALB विधि द्वारा तैयार अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। ये उभरते क्षमताओं को एक सरल और मजबूत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का लाभ लेने से कृत्रिम कोशिका झिल्ली तलाश कर सकते हैं, जो वैज्ञानिकों की एक बड़ी संख्या के लिए दरवाजा खुला।

Acknowledgments

लेखकों NJC करने के लिए नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ -NRFF2011-01 और NRF2015NRF-POC0001-19), राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NMRC / CBRG / / 2012 0005), और नानयांग प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय से समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QCM-D silicon dioxide-coated substrates QSense AB,  Sweden
QCM-D gold-coated substrates QSense AB,  Sweden
Q-Sense E4 module QSense AB,  Sweden
Plasma Cleaner, PDC-32G Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) Avanti Polar Lipids 810150P
cholesterol Avanti Polar Lipids 700000P
Methyl-β-cyclodextrin Sigma  C4555
Isopropanol Sigma  673773
Ethanol Sigma  459844
n-propanol Sigma  279544
Sticky-Slide I 0.1 Luer IBIDI 81128
Male elbow 1/8” Cole-Parmer 30505-70
Silicon tubing 1.6 mm ID IBIDI 10842
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm IBIDI 10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump Ismatec
Sodium dodecyl sulfate Sigma  71725

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References

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विलायक की सहायता लिपिड bilayer (SALB) विधि द्वारा Biomembrane निर्माण
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Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).More

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).

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