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Bioengineering

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

doi: 10.3791/53073 Published: December 1, 2015

Summary

우리는 지질 소포를 사용하지 않고 고체 기판 상에지지 지질 이중층을 형성하는 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 다양한 생물학적 응용을위한 콜레스테롤이 풍부한 도메인과 지질 이산화 규소 및 골드 이중층뿐만 아니라지지 막을 형성하는 하나의 단계 방법을 보여준다.

Abstract

세포막을 모방하기 위해,지지 지질 이중층 (SLB)는 고체 기판에 biofunctionality 생체 적합성을 부여하면서 막 - 관련 프로세스의 체외 조사 가능 매력적인 플랫폼이다. 인지질 소포체의 자발적 흡착 및 파열 SLB 수를 형성하는 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 그러나, 생리 학적 조건 하에서, 소포 융합 (VF)는 지질 조성물 및 고체 지지체의 서브 세트로 제한된다. 여기서는 소체를 필요로하지 않는다 SLB 수를 형성하기 위해서 용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 형성 방법이라고 한 단계 반응 절차를 설명한다. SALB 방법은 SLB 형성을 유발하기 위해 수혼 화성 유기 용매 (예 : 이소프로판올) 및 수성 완충 용액으로 교환 후속 용매의 존재하에 고형 표면에 지질 분자의 침착을 포함한다. 연속 용매 교환 단계의 적용을 가능하게모니터링 이중층 형성 및 표면 성 바이오 센서의 넓은 범위를 사용하여 후속의 변경에 적합한 관류 구성 방법. SALB 방법은 소포 융합되는 난치성 포함한 친수성 ​​고체 표면의 광범위한 SLB 수를 제조 할 수있다. 또한, 소포 융합 방법을 사용하여 제조 할 수없는 지질 조성물로 이루어지는 SLB 수의 제조를 가능하게한다. 여기서, 우리는 두 가지 예시 친수성 ​​표면, 이산화 규소 및 골드 SALB 종래 소포 융합 방법으로 얻어진 결과를 비교. SALB 방법을 통해 제조 된 고품질의 이중층의 제조를위한 실험 조건을 최적화하기 위해, 성막 공정에서의 유기 용제의 종류, 용매 교환의 속도 및 지질 농도를 포함하는 다양한 파라미터의 효과가 해결 정보와 함께 논의 . 콜레스테롤이 높은 분획을 함유하는지지 막의 형성도이다 귀신막 구성의 광범위한 SALB 기술의 기술 능력을 강조 SALB 방법으로 보이는 것.

Introduction

고체지지 지질 이중층 1 (SLB)은 이러한 이중층 두께, 이차원 확산 지질 및 막 - 관련 생체 분자를 호스팅 할 수있는 능력으로 생체막의 기본 특성을 보존 다목적 플랫폼이다. 자연적인 세포막의 복잡성이 간단한 플랫폼 (3), 바이러스 및 바이러스 유사 입자는 4,5- 결합을 결합 등 뗏목 형성 2 단백질로서 세포막 관련 프로세스의 시험 관내 연구를위한 효율적인 플랫폼으로서 기능하는 것으로 나타났다 및 셀 (6) 신호. 고체 지지체에 근접하여 형성된, SLB 플랫폼은 전반사 현미경 (TIRF), 수정 진동자 마이크로 밸런스 방산 (QCM-D), 및 임피던스 분광법으로 표면 성 측정 기술의 범위와 호환된다.

몇몇 방법은 기포를 포함 SLB 수의 다른 유형을 생성하기 위해 개발되어왔다서브 마이크론 크기의 지질 명소에 대한 붕괴 7 딥 - 펜 나노 리소그래피 (8), 스핀 코팅 이중층 스택과 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) (10) 및 풀 스패닝, 하나의 지질 이중층 코팅 소포 융합 (VF) 11 9. VF 방법은 연속 지질 이중층을 형성하도록 고체 지지체 이후 자발 파열과 융합 소형 단일 층 소포 흡착 이루어져있다. 그러나, 생리 학적 조건 하에서 자발적 소포 파괴는 주로 이산화 규소, 유리, 운모 등의 실리콘계 재료로 한정된다. 또한, 소포 파열은 콜레스테롤 또는 음으로 하전 된 지질의 높은 분획을 함유하는 것과 같은 복잡한 지질 조성물의 소포에 대해 자발적으로 발생하지 않는다. 시스템에 따라, 소포 파열은 또한 온도 12 용액의 pH를 13, 14 및 염분, 삼투압 충격 (15)와 같은 실험 조건을 조정하여 유도 될 수있다 (16), 또는 칼슘과 같은 가의 이온 첨가 닫> 또는 (17). 대안 적으로, 막 - 활성 AH 펩티드의 범위에 소포 파열 이중층 형성 선도 흡착 소체 층을 불안정하게하기 위해 도입 될 수있다 18-22면.

또한, 성공적인 이중층 형성 시간과 특정 막 조성물을 달성하기 어려울 수있다 소형 단일 층 소포 잘 조절 집단의 제조를 필요로한다. 따라서, 최적의 경우에 높은 효율에도 불구하고 (예를 들면, 소체 (23)의 동결 - 해동 광범위한 전처리 후), 소포 융합의 일반적인 애플리케이션은 적절한 기판과 막 조성물의 범위에 의해서만 한정된다.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법 24-28 지질 소포를 필요로하지 않는 다른 제조 기술이다. 이 방법은 증착 O에 기초SLB 형성을 유발하기 위해 수성 완충액이 용매의 점진적인 교환 하였다 수혼 화성 유기 용매의 존재하에 고형 표면 상 F 지질 분자. 용매 교환 단계, 지질, 유기 용매의 삼원 혼합물, 및 물 중에 벌크 용액 라멜라 상 구조 형성 및 고체 기판에 SLB 리드 물 분율 증가와 직렬 위상 천이를 겪는다. 중요한 것은,이 자기 ​​조립 행은 일반적으로 흡착 SLB 소체의 변환을위한 제한 단계이다 소포 파열에 대한 요구를 무시. 프로토콜은 이산화 규소, 산화 알루미늄, 크롬, 인듐 주석 산화물, 및 금을 포함하여 다양한 표면에 적용될 수있다. 본 논문에서는 첨부 영상에서 SALB 및 소포 융합 방법에 의해 지질 침착의 비교를 제시한다. 특히, 실험적인 매개 변수의 영향을 포함한 지질 농도, 유량 및 SALB 방법에 의해 형성된 이중층의 품질에 수혼 화성 유기 용매의 선택은, 논의된다. 제작 SLB 수의 분석 특성화 (FRAP) 기법 photobleaching에 후 QCM-D, 형광 현미경, 형광 회복에 의해 수행된다. QCM-D 모니터링 켈러와 Kasemo (29)에 의해 수행 된 선구적인 작업부터, 광범위하게 정량적으로 이중층 형성을 조사하기 위해 사용 된, 표면에 민감한 질량 측정 기술이다. 형광 현미경은 막 균일 성 검사뿐만 아니라 멤브레인 도메인의 시각화를 허용한다. FRAP 기술은 유체 막의 필수 속성 인 SLB, 지질 분자의 측방 이동을 결정하는 표준 도구이다.

본 연구의 첫 번째 부분은 실리콘 이산화물과 금에 이중층을 형성하도록 시도인가 SALB의 QCM-D 분석과 소포 융합 방법을 포함한다. 두 번째 부분에서는,준비 및 SALB 법 콜레스테롤 농도 범위를 함유하는지지 막의 특성이 입증되고, 결과는 소포 융합 방법에 의해 수득 된 것과 비교한다.

Protocol

친수성 고체 지지체에 지원되는 지질 이중층 1. 형성

  1. 10 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 지질 스톡 용액을 제조 (DOPC) 1 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N - (리사 민 로다 민 B 각 지질 분말을 용해시켜 술 포닐) (RH-PE)는 (적절히 이소프로판올 용액의 분석 질량 균형)을 미리 칭량.
  2. 희석하고, 최종 농도 원하는 지질 혼합물을 제조하기 위해 이소프로판올 스톡 용액을 혼합한다. 형광 현미경 및 FRAP 실험, 0.5 중량 % RH-PE는 지질 혼합물을 포함한다.
  3. 이 채워질 때까지 미세 유체 채널로 이소프로판올 지질 혼합물을 주입한다.
  4. 약 10 분 동안 유리 표면에 지질 혼합물을 배양한다.
  5. 서서히 매우 낮은 유속으로 연동 펌프를 사용하여 물 또는 완충액과 지질 용액을 대체(10 ~ 50 μL / 분). 또한, 반복 피펫에 의한 지질 혼합물을 교체합니다.
  6. 잔류 이소프로판올을 제거하기 위해 과량의 완충액으로 철저하게 채널을 헹군다.

콜레스테롤이 풍부한 지원 막 2. 형성

참고 : 고체 표면 (SiO2를하면) 소포 융합을 지원하지만 콜레스테롤이 풍부한 소포는 높은 강성 (30) 굽힘 때문에 막 조성 (고 콜레스테롤) 소포 융합을 억제한다.

  1. 제 이소프로판올 각 분말을 용해시켜 10 ㎎ / ㎖의 DOPC 지질, 10 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤, 1 ㎎ / ㎖ RH-PE를 함유하는 스톡 용액을 제조 하였다.
  2. 반복 2.1 단계에서 제조 된 원액을 사용하여 1.2-1.6 단계를 반복합니다.

3. 막 유동성 분석

  1. 10 분 동안 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 용액 (1 %)의 유리 슬라이드를 담근다.
  2. 탈 이온수로 철저하게 슬라이드를 세척하고 재치 린스시간 에탄올.
  3. 불어 건조 질소의 부드러운 흐름을 사용하여 슬라이드를.
  4. 산소 플라즈마 챔버에서 최대 무선 주파수 전력에서 30 초 동안 산소 플라즈마에 노출 슬라이드.
  5. 밑 상업 미세 유체 챔버 (그림 1A)의 보호 필름 코팅 트위터를 사용하여 제거하고 챔버 (그림 1B)의 접착면에 유리 슬라이드를 연결합니다.
  6. 챔버의 입구와 출구의 위치에 커넥터와 튜브를 조립하고 현미경 단계 (그림 1C)에 미세 유체 채널을 배치합니다.
  7. 미세 유체 채널의 형광 표지 된 지원 지질 이중층 형성 [바람직한 지질 조성물을 사용하여 반복 스텝 (1) (예, 0.5 ㎎ / ㎖ DOPC) 0.5 중량 % RH-PE 유기 용매를 포함].
  8. 이미지를 캡처하기 위해 60X 기름 침지 목표 (NA 1.49)와 이중층 평면을 찾습니다.
  9. 두 사전 표백제 이미지를 가지고, 다음 (30) 사진 - 표백1, 532 nm의, 100 mW의 레이저 빔으로 넓은 원형의 자리를 해요. 그 강도가 안정 될 때까지 photobleaching에 전에 레이저를 따뜻하게. photobleaching에 바로 후 표백 지점에서 형광 강도의 복구를 수행하기 위해 2 분 동안 1 초마다 일련의 이미지를 캡쳐.

4. 콜레스테롤 정량 분석

  1. 산소 플라즈마 챔버에서 최대 무선 주파수 전력에서 30 초 동안 산소 플라즈마에 실리콘 이산화물 코팅 된 석영 결정 센서 칩을 노출. 챔버로부터 칩을 분리하고 즉시 측정 챔버에 칩을 마운트.
  2. 실험 전에 먼저 적정 부착을 보장하기 위해 공중에 센서 칩의 주파수 및 분산을 획득.
    1. 상업 Q 감지 E1 또는 E4 QCM-D 악기를 들어, Q-소프트 소프트웨어 프로그램을 실행하고 "취득"버튼을 클릭 "설정 측정"을 선택합니다.
    2. 표시되는 새 창에서, 3, 5, 7을 확인, 9, 11, 13 배음 다음 찾기 및 공명 스펙트럼을 확인하기 위해 실행을 클릭합니다. (24)에서 온도를 설정 기음. 하나 또는 그 이상의 공진 주파수가 예상 된 값과 일치하지 않는 경우, 칩 탑재를 확인하고 합의에 도달 할 때까지이 과정을 다시 수행한다.
  3. 연동 펌프를 시작하고, 100 μL / 분의 유속으로 상기 측정 챔버 내에 완충액 (10 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)를 흐른다.
  4. 소프트웨어 프로그램에서 "취득"버튼을 클릭 공진 주파수와 에너지 소비 신호를 기록하기 위해 "다시 측정"을 선택합니다. 안정된 기준은 주파수와 소비 변화에 대해 얻을 때까지이 단계를 반복합니다. 참고, 시간의 함수로서 기록 될 수있는 추가 주파수 및 소산 교대있을 것이다 이하 단계는.
  5. 10 분 동안 (지질 제외) 이소프로판올을 주입한다.
  6. DOPC에서 지질 / 콜레스테롤 혼합물을 주입10 분간 이소프로판올에 0.5 ㎎ / ㎖의 총 지질 농도와 원하는 몰비.
  7. 100 μL / 분의 유속으로 20 분 동안 버퍼를 주입.
  8. 버퍼 (레이트 100 μL / 분으로 흐름) 주파수 신호가 안정된 값에 도달 할 때까지 준비 1mM의 메틸 - β - 시클로 덱스트린 (MβCD)의 용액을 주입한다.
  9. MβCD 처리 공정에 의해 야기되는 상대적으로 양의 주파수 변화를 측정하고 [ΔM = 사우어 브레이 식을 이용하여 질량 값 Δf에 CHO 및 Δf에 DOPC 값을 변환하여 콜레스테롤 및 DOPC 지질의 질량을 계산 - (C / N) × ΔF, 여기서 C = 17.7 NG / cm 2, N : 상음].
  10. 고려 DOPC 지질 (786.1 g / mol) 및 콜레스테롤 (386.6 g / 몰)의 분자량을 가지고, SLB 콜레스테롤의 몰분율을 계산한다.

Representative Results

친수성 기판에 지원 지질 이중층의 제작.

VF SALB 및 형성 방법은 이산화 규소와 금 QCM-D 측정 기술에 의하여 실시간으로 모니터링 하였다 형성 과정에서 시도되었다. 결정의 표면에 질량 흡착에 따라 진동하는 압전 석영 크리스탈의 공진 주파수 (Δ의 F)에 QCM-D 장비의 변화를 측정. 또한, QCM-D 악기 adlayer의 점탄성 (강성과 부드러움)을 특성화하기 위해 진동 에너지의 소산을 측정한다. 앞서 설명한 바와 같이 31 소포 융합 실험을 수행 하였다. 요약하면, 기준은 첫째, 수성 완충 용액 [10 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.5에서 주파수 및 신호 손실 확립시켰다 (도 2A와 B)]. 다음, 동일한 완충액에서 작은 DOPC 라멜라 지질 소포에 있었다이산화 규소 (그림 2A) 및 금 상 T = 10 분의 투사 (화살표 1) (그림 2B). 각각 6 - 이산화 규소 소포 융합의 경우, 두 단계 흡착 동역학은 주파수 및 에너지 -26 (± 1) 헤르츠 소산 0.3에서 최종 변화 (± 0.2) × 10으로 관찰 하였다. 이러한 값은 지원되는 지질 이중층 (29)의 형성과 일치한다.

도 2b에 도시 된 바와 같이 그 값이 Hz에서 (10 ±) -150에 도달 할 때까지, 금 표면에 소포 용액의 첨가는, 각각 Δ F 및 Δ D 신호의 동시 감소 및 증가되었다 (7.5 ± 2) 각각 6 - 10 ×. 이러한 값은 소포 흡착 층의 형성에 대응한다. 따라서, 예상대로, SLB는 소포 융합 방법을 통해 금에 형성되지 않았다.

품질 관리SALB 방법에 의한 이산화 규소 및 금에 이중층 형성 MD 분석은 그림 2C와 D로 표시됩니다. 6, 각각 달성하고, 이러한 값이 SLB의 형성을 나타내는 - 이산화 규소, -25.6 (± 0.55)의 최종 Δ와 Δ F D 시프트 Hz에서 (± 0.27) 0.4 10는 ×. Δ F와 Δ D의 유사 범위 (Δ F : -27.3 ± 2.7 Hz에서, Δ D : 0.48 (0.26 ±) × 10-6)는 금에 관찰되었다. 이러한 결과는 SALB 방법은 소포 파열을 방지 표면에지지 지질 이중층을 형성 할 수 있음을 지원한다.

지원 지질 이중층의 품질에 용제 - 교환 유량의 효과.

고품질 지원 지질 이중층 VI의 제조에 최적의 조건을 결정하는SALB 법, 지질 농도, 용매 환율 및 유기 용매의 선택의 영향을 조사 하였다.

두 개의 서로 다른 유동 속도 (100, 600 μL / 분)와 두 개의 서로 다른 지질 농도 (0.125 내지 0.5 ㎎ / ㎖)에 이산화 실리콘 상에 수행되는 것으로도 3은 SALB 프로토콜의 최종 단계 동안 QCM-D 주파수의 변화를 나타낸다 .

0.5 ㎎ / ㎖의 DOPC 지질은 (도 3A)을 이용한 경우, 이중층 형성 유량 양쪽 유량 얻었다 약 -26 Hz의 최종 시프트 Δf에 의해 영향을받지 않았다.

대조적으로, 낮은 지질 농도가 사용될 때, 완전한 용매 교환 후 흡착 지질의 양이 크게 유량 (도 3b)에 의해 영향을 받았다. 100 μL / 분의 평균 유속, 이중층의 형성이 (-26 Hz에서 약 Δf에) 완전했다. 그러나, 6 배 더 높은 유속 (600 μL / 분)은, 완전한 이중층은 -17 Hz의 주위에 (Δf에) 형성되지 않았다. 이러한 결과는 선택의 유기 용매로서 이소프로판올 SALB 방법을 사용하여 성공적 이중층 형성에 적합한 실험 조건을 선택하기위한 기준을 제공한다.

다양한 알코올 솔루션의 다른 지질 농도를 형성 지원 지질 이중층의 특성.

지질 농도 SALB 방법을 사용하여 수득 SLB 수의 품질에 영향을 미치는 다른 파라미터이다. 형광 현미경은 0.05 ㎎ / ㎖ 지질 농도 만 고립 된, 하위 현미경 지질 구조 (그림 4A)을 형성, 것으로 나타났습니다. SALB 절차에서 사용되는 지질 농도가 증가함에 따라, 지질 구조체의 형광 강도가보다 균일하게되었다. 구조는 전체 F에 걸쳐되지 않았지만 0.1 ㎎ / ㎖ 지질 농도, 미세 지질 패치가 있었다보기의 ield (그림 4B). 0.25 ㎎ / ㎖ 지질 농도를 사용한 경우에는, 균일 한 지질 이중층은 (도 4c)을 형성 하였다. 따라서, 완전한 전체 스패닝 SLB를 형성하기 위해 필요한 최소한의 지질 농도가있다.

SALB 실험의 최종 결과에 지질 농도의 영향은 또한 넓은 지질 농도 범위 (0.01~5 ㎎ / ㎖)과 다른 유기 용매 (이소프로판올, 에탄올 및 n- 프로판올)을 통해 조사 하였다. Δ의 F와 SALB 절차의 마지막 단계에 해당하는 Δ D 값은 그림 5에 제시되어있다.

우리는 각각 -25 및 -30 Hz에서 이하 0.5 × 10-6 사이의 주파수 및 에너지 손실의 변화에 기초하여 최종 이중층 형성을 정의. 이러한 기준에 따라 최적의 지질 농도의 범위는 지원되는 지질 이중층은 0.1 내지 0.5 mg의 사이 인 것으로 결정되었다 형성하도록/ ml의 유기 용매의 종류에 거의 독립적. 취득한 Δ의 F 및 Δ D의 편차는 외부 상기 범위의 시프트 추가 질량 (예를 들면, 이중층 스택), 비 이중층 모폴로지의 발생 (예, 소체, 웜 형상 미셀)의 존재에 기인 한 기판에 대한 불완전한 형태와 조각 이중층 섬의 존재.

얻어진지지 지질 이중층에 SALB 절차가 비교적 견고하면서, 고품질의 이중층 형성을위한 최적의 지질 농도는 실험의 특정 구성에 따라 조정이 필요할 수있다. 기본적으로, 최소한의 지질 농도뿐만 아니라 SALB 방법을 통해 최적의 이중층의 형성에 필요한 최대 지질 농도뿐만있다. 최적 농도 범위는 유량에 의존하며, 기판과 지질 조성에 의해 영향을받을 수있다. 경험적으로, 많은 경우에, 우리는 f를했다운드, 0.5 ㎎ / ㎖ 및 100 ㎕의 유속의 지질 농도 것을 / 분 균질지지 지질 이중층의 형성을위한 최적 조건의 세트이다. 그러나, 지질 조성 및 흐름 세포 지오메트리 후자에 따라서 어느 필요할 수 지질 농도의 용매 교환 중에 상기 최적화 흐름 프로필에 영향을 미친다. 따라서, 우리는 QCM-D 또는 형광 현미경 기술을 사용하여 이중층 품질을 0.5 ㎎ / ㎖ 지질 농도를 이용하여 평가 된 파일럿 SALB 실험 수행 권장. 이중층 불완전 나타나는 경우 양호한 결과가 달성 될 때까지, 다음 지질 농도가 10 % 씩 증가한다. 추가적인 지질 이중층 구조와 공존하도록 나타나면 양호한 결과가 달성 될 때까지, 다음 지질 농도를 10 % 씩 감소한다.

다양한 지질 조성 및 D 지원 지질 이중층의 제작ifferent 콜레스테롤 분획.

다음에, SALB과 VF 방법 콜레스테롤 - 풍부 SLB 수를 형성하기 위하여 사용 하였다. 6 SALB 법에 의해 제조 된 콜레스테롤 - 함유지지 막의 대표적인 형광 화상 (100 × 100 ㎛)를 나타낸다. 멤브레인은 균일 한 형광 밝기를 특징으로하는 연속 상으로 둘러싸인 원형 염료 제외 도메인으로 구성되어 있습니다. 어두운 영역은 전구체 지질 혼합물 콜레스테롤 분율이 증가함에 따라 증가 영역. 다음에, FRAP 측정은 지질 이중층 필름의 유동성을 조사하기 위하여 수행 하였다. FRAP 측정은 측면 지질의 이동성과 하나의 지질 이중층의 이렇게 형성을 나타내는, 주변의 단계에서 거의 완전한 형광 복구를 한 것으로 밝혀졌습니다. 우선적으로 유체 상 RH-PE로 분할하기 때문에, 어두운 영역은 대부분 고밀도 콜레스테롤이 풍부한 구조로 구성된다. 비교를 위해, VF 방법을 사용 DOPC / Chol을 이중층의 제조도 시도 하였다. 소포 압출 법에 의해 제조 하였다 - (40 몰 % 10) DOPC 콜레스테롤 분획 증가에 소포. RH-PE 지질 (0.5 중량 %)의 이미징을위한 형광 표지로서 사용 하였다. (7)는 콜레스테롤 - 함유 소포와 유리 기판의 배양시에 생성 구조 대표적인 형광 화상 (100 × 100 ㎛)를 나타낸다. FRAP 분석은 20 몰 % 이하 Chol을 함유 소포를 사용하여 유체의 지질 이중층의 형성을 보였다. 그러나, 시료 흡착하지만 파열 소포의 존재를 나타내는, 회복을 나타내지 않았다 높은 콜레스테롤 분수 소포를 사용하여 제조.

궁극적으로 지원 지질 이중층에 편입 된 콜레스테롤 분획 전구체 립에 포함되었던 콜레스테롤 비율의 함수로서 정량 하였다SALB 방법 또는 VF 방법에서 수용액 중의 소체 유기 용매 ID 혼합물. QCM-D 기술을 사용하여, 이중층의 형성을 모니터링 한 후, MβCD 특별히 지원 지질 이중층 32 Chol을 추출하기 위해 첨가 하였다. SLB와 연관된 (| | Δ의 f)에 의한 콜레스테롤의 제거 질량 손실은 주파수 시프트의 절대 값이 감소했다. MβCD 처리 공정에 의한 상대적인 양의 주파수 이동은도 8a에 도시되어있다.도 8b에 제시된 콜레스테롤의 몰분율은 주파수 시프트에 기초하여 산출 하였다.

SALB 방법에 의해 제조 된 담지 지질 이중층에 편입 콜레스테롤 분획 전구체 지질 혼합물 중의 콜레스테롤 함량을 거의 선형으로 비례한다. 흥미롭게도, VF의 방법에 의해 제조 된 이중층의 콜레스테롤 분획 (소포까지 포함20 몰 % Chol을)은 전구체 소체에 포함되는 것보다 실질적으로 낮았다. 사실, VF 방법에 의해 얻어진 콜레스테롤의 높은 비율은 약 10 몰 %였다.

콜레스테롤 인지질의 β-이 상 공존 영역에서의 스트라이프 상부 구조의 관측은 지질 이중층을 지원했다.

SALB 실험은 또한 콜레스테롤의 더 높은 분율로 지질 혼합물을 사용하여 수행 하였다. 4 때 DOPC 및 콜레스테롤 6 혼합물을 사용하고, 두 공존하는 상으로 균일 한 액상의 점진적인 demixing 어두운 (염료 제외) 배경에 밝은 스트라이프 형 도메인으로 가시화는 (도 9)를 관찰 하였다. 그것은 RH-PE는 콜레스테롤이 풍부한 도메인 (33), 따라서 배경으로 등장 주된 어두운 영역에서 콜레스테롤이 풍부한 지역입니다 제외됩니다 설정됩니다. 에서 어두운 배경에 마이크론 크기의 밝은 영역의 형성 안녕하세요GH 콜레스테롤 비율 (> 50 몰 %) 콜레스테롤 / 인지질 혼합물 (34, 35)의 단층 위상 다이어그램 β 영역과 일치한다. 또한, 약한 라인 장력으로부터 발생 스트라이프 영역의 형성은, 혼 화성 혼합물 임계점 근처임을 시사한다.

그림 1
표면 형광 현미경에 적합한 구성 SALB 형성을위한 그림 1. 미세 유체 실. (A) 상업 미세 유체 챔버 (B) 챔버의 접착면에 부착 된 유리 커버 슬립, (C)에 연결된 튜브와 현미경 홀더에 전체 설치 상기 챔버의 입구 및 출구 포트, 및 (D) 연동 펌프는 용매 교환의 속도를 제어하기 위해 사용된다. 이소프로판올에 용해 지질 측정 chamb에 주입어 연동 펌프의 도움으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
이산화 규소와 골드 기판에 소포 융합과 SALB 실험 그림 2. QCM-D 분석. QCM-D 주파수 (Δf에, 파란색)과 소산 세 번째 배음에 대한 (ΔD, 빨간색) 응답 (N = 3)으로 기록되었다 지질 흡착 상 (A 및 C) 이산화 규소, (B 및 D)의 시간 동안 금 기능. 패널 B는 소포 융합 방법을 제시한다. DOPC 지질 소포는 (화살표 1) t = 10 분으로 주사 하였다. 패널 C 및 D는 SALB 형성 방법에 대응한다. 화살표는 버퍼 (1), 이소프로판올을 이소프로판올 (2), 지질 혼합물 [0.5 ㎎ / ㎖의 DOPC 지질의 주입을 나타낸다; (3)]​​ 및 버프어 교환 (4). 패널 B에서 점선 곡선은 지질이 주입되지시킨 대조 실험에 대응한다. 각 표면 Δf에와 ΔD의 최종 값이 지정됩니다. 최종 주파수와 소비 변화에서 유추로 회로도는 제안 조립 지질 구조를 보여줍니다. 참조 24에서 적응과 미국 화학 학회의 허가를 받아 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
SALB 형성 과정에 대한 용매 환율 3. 영향을줍니다. SALB 방법에서 QCM-D 주파수 시프트 (Δf에), 최종 단계에 대응하는 (도 2c에서 화살표 4 참조)는 두 개의 서로 다른 환율, 100, 600 μL / 분으로, U에 이산화 규소를 측정했다 노래 (A) 0.5 ㎎ / ㎖와 이소프로판올 (B) 0.125 ㎎ / ㎖의 DOPC 지질. 수성 완충액에서 측정 기준과 비교하여 최종적인 값 Δf에 또한 지정된다. 참조 24에서 적응과 미국 화학 학회의 허가를 받아 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
전체 SALB 형성 지질 농도도 4 임계 값 (A) 0.05 ㎎ / ㎖을 사용하여 제조 SALB 이산화 규소 지질 층의 표면 형광 현미경.; (B) 0.1 ㎎ / ㎖; 및 (C) 0.25 ㎎ / ㎖ 농도의 지질. 참조 26에서 적응과 미국 화학 학회의 허가를 받아 사용./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
SALB 법에 의한 지질 농도와지지 지질 이중층의 형성에 유기 용매도 5에 영향을 미친다. QCM-D에서의 최종 변경 (A)의 주파수 및 지질의 함수로서 다양한 유기 용매를 사용 SALB 실험에 대한 (B)의 에너지 소비, 집중. 녹색 파선은 완전한 이중층 (-30 Hz의 <Δf에 <-25 Hz에서 ΔD <1 × 10 -6)에 대한 예상 주파수와 소비 변화에 해당합니다. 참조 26에서 적응과 미국 화학 학회의 허가를 받아 사용. 이 파이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오gure.

그림 6
유리 기판 상 SALB 방법에 의해 제조 된 콜레스테롤 분획 다양한 지원 지질 이중층 분석 photobleaching에 후도 6 형광 복구. 이중층의 (AE) 형광 현미경 사진 전구체 혼합물에서 각종 콜레스테롤 분획을 사용하여 제조. 이미지는 photobleaching에 후 즉시 (위)과 1 분 (중간)를 기록했다. 이미지 센터에서 어두운 장소는 광 퇴색 지역에 해당한다. 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다. 각 샘플 내의 개별 염료 제외 도메인의 표면 영역 히스토그램도 (아래)되게됩니다. 참조 36에서 적응과 미국 화학 학회의 허가를 받아 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
소포 융합 법에 의해 제조 된 콜레스테롤 - 함유지지 이중층 항 FRAP 분석 도표. 이중층의 (AD) 형광 현미경 사진 전구체 소체에, 각종 콜레스테롤 분획 (10 내지 40 몰 %)을 사용하여 제조. 이미지는 photobleaching에 후 즉시 (위)과 1 분 (아래)를 기록했다. 이미지 센터에서 어두운 장소는 광 퇴색 지역에 해당한다. 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다. 참조 36에서 적응과 미국 화학 학회의 허가를 받아 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8. 숨어지원 지질 이중층 콜레스테롤 분획 antification. (A) (0 ~ 50 몰 % 사이) 전구체 혼합물 콜레스테롤 몰분율을 변화 지원 지질 이중층 상 1mM의 MβCD 주입시 포지티브 QCM-D 주파수 시프트. (B) 상기 전구체 혼합물 또는 소체 콜레스테롤 비율의 함수로서 SALB 및 소포 융합 방법에 의해 제조 된 이중층 120408 콜레스테롤 몰 %. 참조 36에서 적응과 미국 화학 학회의 허가를 받아 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9
6 몰비의 접점 : DOPC / Chol을 (4의 지원 이중층의 형광 미세 그림 9. 시간 의존 진화SALB 법으로 제조 된 0.5 % 로다 PE) ining. 위상이 서서히 균일 위상은 완전히 용매 교환시 액체 - 액체 공존 영역으로 분리한다. 참조 37에서 적응과 미국 화학 학회의 허가를 받아 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 작업에서, 용제 - 교환 프로토콜은 고체 지지체에 배양 알코올 (이소프로판올, 에탄올 또는 n- 프로판올)에있는 지질로 표시 한 후 알코올 시리즈를 구동하기 위해 수성 완충액으로 점차 대체 위상 천이 결국 라멜라 상 지질 이중층 (24)의 제조. 이 방법은 소포 융합 방법에 난치성 인 금,은 등의 표면에 담지 된 지질 이중층의 제조를 가능하게하는 것이 도시되어있다.

최적의 지질 농도 범위 (0,1 - 0,5 ㎎ / ㎖)는 지금까지 시험 표준 실험에서 완전한 포맷 이중층 형성을 위해 결정되었다. 이중층의 0.1 ㎎ / ㎖, 이산 미세한 패치 아래 지질 농도로 형성했다. 한편, 0.1 ㎎ / ㎖ 이상의 농도에서 및보다 낮은 0.5 ㎎ / ㎖, 완전하고 균일 이중층이 형성된다. 이 범위보다 지질 농도, 유체 이중층 여전히 검증기로 형성 하였다FRAP 분석하여 에드 그러나, 형광 현미경은 이중층 위에 추가적인 지질 구조의 존재를 드러낸다. QCM-D 분석에 의해 결정되는 바와 같이 현저하게, 이러한 추가 지질 구조체의 형태는 배양 단계 동안 사용 된 알코올에 의존. 에탄올의 경우, 상대적으로 높은 F Δ와 Δ D 변화는 흡착 층 소포 얻어 QCM-D 서명을 닮은. 이소프로판올 또는 n- 프로판올 대신 사용한 경우 Δ D가 상당히 높았다, Δ의 F는, 이중층 (-30 Hz에서 -40 사이의 최종 Δ F)에 대한 기대 값보다 약간 높았다. 이러한 QCM-D 응답은 (어떤 경우에는 형광 현미경으로 보이는)을 막 표면으로부터 외측으로 돌출되어 연장 된 지질 구조체 (예를 들어, 웜 형상 미셀)을 위해 예상된다.

용매의 환율은 ESPEC, 중요 할 수있는 또 다른 중요한 변수이다낮은 지질 농도 (예, 0.1 ㎎ / ㎖)을 사용하는 경우 ially. 낮은 지질 농도의 빠른 용매 교환은 불완전 이중층의 형성으로 이어질 수 있습니다. 본 논문에서는 QCM-D 측정치 (Q 감지 E4 측정 챔버), 약 100 μL / 분의 유동 속도를 위해 사용되는 표준 측정 챔버 내에, 높은 재현성 완전한 이중층 형성에 적합 하였다. 다른 형상 및 부피 유동 세포, 최적의 유량은 변할 수 있고, 본 명세서에서 제안 된 실험적 단계에 기초하여 결정되어야한다.

소포 융합 난치성이다 표면에 담지 된 지질 이중층을 형성 할뿐만 아니라, SALB시켜 복합 조성물 지원 막의 제조의 문을 열고, 파열 수 지질 소포에 대한 필요성을 회피하는 데 사용될 수있다. 예시 조성물로서, 콜레스테롤의 높은 비율과 지질의 혼합물을 조사 하였다. 콜레스테롤 mamm의 중요한 구성 요소알랸 세포막, 및 분획 (적혈구, 예), 막 지질 조성의 45 ~ 50 몰 %에 접근 할 수있다. 따라서, 인간 세포막을 나타내는 지질 이중층 심지어 간단한 모델은 콜레스테롤을 포함한다.

소포 융합은 10-15 %의 콜레스테롤을 함유하는 유체의 지질 이중층을 제조하는데 사용될 수 있지만 36 (QCM-D의 측정에 의해 정량으로, 57 몰 % 이하), SALB 방법은 콜레스테롤이 높은 분획을 함유하는 유체의 지질 이중층의 형성을 가능하게한다. 콜레스테롤의 수준이 더 (63 몰 % 이하) 승온 그러나, 스트라이프 형상 영역 (37)을 관찰 하였다. 공존 도메인은 공기 - 물 계면에서 콜레스테롤 / 인지질 단층의 상태도에서 β 영역에서 관찰되는 연상 액체였다.

전체적으로 SALB 방법은 내가 특히, 지원되는 지질 이중층을 형성하는 간단하고 효율적인 방식으로 도시되어있다종래 소포 융합 방법의 범위를 벗어나는 경우, N. 지금까지 QCM-D 기술과 형광 현미경 주로 SALB 법에 의해 형성된지지 지질 이중층을 특성화하기 위해 사용되었다. 기대, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (38), 원자력 현미경 (AFM) (39, 40)를 포함하여 표면 성 분석 측정 기법의 넓은 범위가, 적외선 분광기 (41)를 푸리에 변환, X 선 (42) 및 중성자 반사율 43 수 상기 특성화 및 단순 및 복합 이중층 구성 SALB 방법에 의해 제조 연구하는 데 사용할. 이 새로운 기능은 간단하고 강력한 실험 프로토콜을 이용하여 인공 세포막을 탐색 할 수 있습니다 과학자의 더 많은 수의 문을 엽니 다.

Acknowledgments

저자는 NJC에 국립 연구 재단 (NRF -NRFF2011-01과 NRF2015NRF-POC0001-19), 국립 의료 연구위원회 (NMRC / CBRG / / 2012 0005), 그리고 난양 기술 대학에서 지원을 인정하고자하는

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QCM-D silicon dioxide-coated substrates QSense AB,  Sweden
QCM-D gold-coated substrates QSense AB,  Sweden
Q-Sense E4 module QSense AB,  Sweden
Plasma Cleaner, PDC-32G Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) Avanti Polar Lipids 810150P
cholesterol Avanti Polar Lipids 700000P
Methyl-β-cyclodextrin Sigma  C4555
Isopropanol Sigma  673773
Ethanol Sigma  459844
n-propanol Sigma  279544
Sticky-Slide I 0.1 Luer IBIDI 81128
Male elbow 1/8” Cole-Parmer 30505-70
Silicon tubing 1.6 mm ID IBIDI 10842
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm IBIDI 10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump Ismatec
Sodium dodecyl sulfate Sigma  71725

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References

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용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작
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Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).More

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).

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