우리는 지질 소포를 사용하지 않고 고체 기판 상에지지 지질 이중층을 형성하는 실험 프로토콜을 제시한다. 우리는 다양한 생물학적 응용을위한 콜레스테롤이 풍부한 도메인과 지질 이산화 규소 및 골드 이중층뿐만 아니라지지 막을 형성하는 하나의 단계 방법을 보여준다.
세포막을 모방하기 위해,지지 지질 이중층 (SLB)는 고체 기판에 biofunctionality 생체 적합성을 부여하면서 막 – 관련 프로세스의 체외 조사 가능 매력적인 플랫폼이다. 인지질 소포체의 자발적 흡착 및 파열 SLB 수를 형성하는 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 그러나, 생리 학적 조건 하에서, 소포 융합 (VF)는 지질 조성물 및 고체 지지체의 서브 세트로 제한된다. 여기서는 소체를 필요로하지 않는다 SLB 수를 형성하기 위해서 용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 형성 방법이라고 한 단계 반응 절차를 설명한다. SALB 방법은 SLB 형성을 유발하기 위해 수혼 화성 유기 용매 (예 : 이소프로판올) 및 수성 완충 용액으로 교환 후속 용매의 존재하에 고형 표면에 지질 분자의 침착을 포함한다. 연속 용매 교환 단계의 적용을 가능하게모니터링 이중층 형성 및 표면 성 바이오 센서의 넓은 범위를 사용하여 후속의 변경에 적합한 관류 구성 방법. SALB 방법은 소포 융합되는 난치성 포함한 친수성 고체 표면의 광범위한 SLB 수를 제조 할 수있다. 또한, 소포 융합 방법을 사용하여 제조 할 수없는 지질 조성물로 이루어지는 SLB 수의 제조를 가능하게한다. 여기서, 우리는 두 가지 예시 친수성 표면, 이산화 규소 및 골드 SALB 종래 소포 융합 방법으로 얻어진 결과를 비교. SALB 방법을 통해 제조 된 고품질의 이중층의 제조를위한 실험 조건을 최적화하기 위해, 성막 공정에서의 유기 용제의 종류, 용매 교환의 속도 및 지질 농도를 포함하는 다양한 파라미터의 효과가 해결 정보와 함께 논의 . 콜레스테롤이 높은 분획을 함유하는지지 막의 형성도이다 귀신막 구성의 광범위한 SALB 기술의 기술 능력을 강조 SALB 방법으로 보이는 것.
고체지지 지질 이중층 1 (SLB)은 이러한 이중층 두께, 이차원 확산 지질 및 막 – 관련 생체 분자를 호스팅 할 수있는 능력으로 생체막의 기본 특성을 보존 다목적 플랫폼이다. 자연적인 세포막의 복잡성이 간단한 플랫폼 (3), 바이러스 및 바이러스 유사 입자는 4,5- 결합을 결합 등 뗏목 형성 2 단백질로서 세포막 관련 프로세스의 시험 관내 연구를위한 효율적인 플랫폼으로서 기능하는 것으로 나타났다 및 셀 (6) 신호. 고체 지지체에 근접하여 형성된, SLB 플랫폼은 전반사 현미경 (TIRF), 수정 진동자 마이크로 밸런스 방산 (QCM-D), 및 임피던스 분광법으로 표면 성 측정 기술의 범위와 호환된다.
몇몇 방법은 기포를 포함 SLB 수의 다른 유형을 생성하기 위해 개발되어왔다서브 마이크론 크기의 지질 명소에 대한 붕괴 7 딥 – 펜 나노 리소그래피 (8), 스핀 코팅 이중층 스택과 랭 뮤어 – 블로 젯 (LB) (10) 및 풀 스패닝, 하나의 지질 이중층 코팅 소포 융합 (VF) 11 9. VF 방법은 연속 지질 이중층을 형성하도록 고체 지지체 이후 자발 파열과 융합 소형 단일 층 소포 흡착 이루어져있다. 그러나, 생리 학적 조건 하에서 자발적 소포 파괴는 주로 이산화 규소, 유리, 운모 등의 실리콘계 재료로 한정된다. 또한, 소포 파열은 콜레스테롤 또는 음으로 하전 된 지질의 높은 분획을 함유하는 것과 같은 복잡한 지질 조성물의 소포에 대해 자발적으로 발생하지 않는다. 시스템에 따라, 소포 파열은 또한 온도 12 용액의 pH를 13, 14 및 염분, 삼투압 충격 (15)와 같은 실험 조건을 조정하여 유도 될 수있다 </s압력 (16), 또는 칼슘과 같은 가의 이온 첨가 닫> 또는 (17). 대안 적으로, 막 – 활성 AH 펩티드의 범위에 소포 파열 이중층 형성 선도 흡착 소체 층을 불안정하게하기 위해 도입 될 수있다 18-22면.
또한, 성공적인 이중층 형성 시간과 특정 막 조성물을 달성하기 어려울 수있다 소형 단일 층 소포 잘 조절 집단의 제조를 필요로한다. 따라서, 최적의 경우에 높은 효율에도 불구하고 (예를 들면, 소체 (23)의 동결 – 해동 광범위한 전처리 후), 소포 융합의 일반적인 애플리케이션은 적절한 기판과 막 조성물의 범위에 의해서만 한정된다.
용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법 24-28 지질 소포를 필요로하지 않는 다른 제조 기술이다. 이 방법은 증착 O에 기초SLB 형성을 유발하기 위해 수성 완충액이 용매의 점진적인 교환 하였다 수혼 화성 유기 용매의 존재하에 고형 표면 상 F 지질 분자. 용매 교환 단계, 지질, 유기 용매의 삼원 혼합물, 및 물 중에 벌크 용액 라멜라 상 구조 형성 및 고체 기판에 SLB 리드 물 분율 증가와 직렬 위상 천이를 겪는다. 중요한 것은,이 자기 조립 행은 일반적으로 흡착 SLB 소체의 변환을위한 제한 단계이다 소포 파열에 대한 요구를 무시. 프로토콜은 이산화 규소, 산화 알루미늄, 크롬, 인듐 주석 산화물, 및 금을 포함하여 다양한 표면에 적용될 수있다. 본 논문에서는 첨부 영상에서 SALB 및 소포 융합 방법에 의해 지질 침착의 비교를 제시한다. 특히, 실험적인 매개 변수의 영향을 포함한 지질 농도, 유량 및 SALB 방법에 의해 형성된 이중층의 품질에 수혼 화성 유기 용매의 선택은, 논의된다. 제작 SLB 수의 분석 특성화 (FRAP) 기법 photobleaching에 후 QCM-D, 형광 현미경, 형광 회복에 의해 수행된다. QCM-D 모니터링 켈러와 Kasemo (29)에 의해 수행 된 선구적인 작업부터, 광범위하게 정량적으로 이중층 형성을 조사하기 위해 사용 된, 표면에 민감한 질량 측정 기술이다. 형광 현미경은 막 균일 성 검사뿐만 아니라 멤브레인 도메인의 시각화를 허용한다. FRAP 기술은 유체 막의 필수 속성 인 SLB, 지질 분자의 측방 이동을 결정하는 표준 도구이다.
본 연구의 첫 번째 부분은 실리콘 이산화물과 금에 이중층을 형성하도록 시도인가 SALB의 QCM-D 분석과 소포 융합 방법을 포함한다. 두 번째 부분에서는,준비 및 SALB 법 콜레스테롤 농도 범위를 함유하는지지 막의 특성이 입증되고, 결과는 소포 융합 방법에 의해 수득 된 것과 비교한다.
이 작업에서, 용제 – 교환 프로토콜은 고체 지지체에 배양 알코올 (이소프로판올, 에탄올 또는 n- 프로판올)에있는 지질로 표시 한 후 알코올 시리즈를 구동하기 위해 수성 완충액으로 점차 대체 위상 천이 결국 라멜라 상 지질 이중층 (24)의 제조. 이 방법은 소포 융합 방법에 난치성 인 금,은 등의 표면에 담지 된 지질 이중층의 제조를 가능하게하는 것이 도시되어있다.
최적의 지질 농도 범위 (0,1 – 0,5 ㎎ / ㎖)는 지금까지 시험 표준 실험에서 완전한 포맷 이중층 형성을 위해 결정되었다. 이중층의 0.1 ㎎ / ㎖, 이산 미세한 패치 아래 지질 농도로 형성했다. 한편, 0.1 ㎎ / ㎖ 이상의 농도에서 및보다 낮은 0.5 ㎎ / ㎖, 완전하고 균일 이중층이 형성된다. 이 범위보다 지질 농도, 유체 이중층 여전히 검증기로 형성 하였다FRAP 분석하여 에드 그러나, 형광 현미경은 이중층 위에 추가적인 지질 구조의 존재를 드러낸다. QCM-D 분석에 의해 결정되는 바와 같이 현저하게, 이러한 추가 지질 구조체의 형태는 배양 단계 동안 사용 된 알코올에 의존. 에탄올의 경우, 상대적으로 높은 F Δ와 Δ D 변화는 흡착 층 소포 얻어 QCM-D 서명을 닮은. 이소프로판올 또는 n- 프로판올 대신 사용한 경우 Δ D가 상당히 높았다, Δ의 F는, 이중층 (-30 Hz에서 -40 사이의 최종 Δ F)에 대한 기대 값보다 약간 높았다. 이러한 QCM-D 응답은 (어떤 경우에는 형광 현미경으로 보이는)을 막 표면으로부터 외측으로 돌출되어 연장 된 지질 구조체 (예를 들어, 웜 형상 미셀)을 위해 예상된다.
용매의 환율은 ESPEC, 중요 할 수있는 또 다른 중요한 변수이다낮은 지질 농도 (예, 0.1 ㎎ / ㎖)을 사용하는 경우 ially. 낮은 지질 농도의 빠른 용매 교환은 불완전 이중층의 형성으로 이어질 수 있습니다. 본 논문에서는 QCM-D 측정치 (Q 감지 E4 측정 챔버), 약 100 μL / 분의 유동 속도를 위해 사용되는 표준 측정 챔버 내에, 높은 재현성 완전한 이중층 형성에 적합 하였다. 다른 형상 및 부피 유동 세포, 최적의 유량은 변할 수 있고, 본 명세서에서 제안 된 실험적 단계에 기초하여 결정되어야한다.
소포 융합 난치성이다 표면에 담지 된 지질 이중층을 형성 할뿐만 아니라, SALB시켜 복합 조성물 지원 막의 제조의 문을 열고, 파열 수 지질 소포에 대한 필요성을 회피하는 데 사용될 수있다. 예시 조성물로서, 콜레스테롤의 높은 비율과 지질의 혼합물을 조사 하였다. 콜레스테롤 mamm의 중요한 구성 요소알랸 세포막, 및 분획 (적혈구, 예), 막 지질 조성의 45 ~ 50 몰 %에 접근 할 수있다. 따라서, 인간 세포막을 나타내는 지질 이중층 심지어 간단한 모델은 콜레스테롤을 포함한다.
소포 융합은 10-15 %의 콜레스테롤을 함유하는 유체의 지질 이중층을 제조하는데 사용될 수 있지만 36 (QCM-D의 측정에 의해 정량으로, 57 몰 % 이하), SALB 방법은 콜레스테롤이 높은 분획을 함유하는 유체의 지질 이중층의 형성을 가능하게한다. 콜레스테롤의 수준이 더 (63 몰 % 이하) 승온 그러나, 스트라이프 형상 영역 (37)을 관찰 하였다. 공존 도메인은 공기 – 물 계면에서 콜레스테롤 / 인지질 단층의 상태도에서 β 영역에서 관찰되는 연상 액체였다.
전체적으로 SALB 방법은 내가 특히, 지원되는 지질 이중층을 형성하는 간단하고 효율적인 방식으로 도시되어있다종래 소포 융합 방법의 범위를 벗어나는 경우, N. 지금까지 QCM-D 기술과 형광 현미경 주로 SALB 법에 의해 형성된지지 지질 이중층을 특성화하기 위해 사용되었다. 기대, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (38), 원자력 현미경 (AFM) (39, 40)를 포함하여 표면 성 분석 측정 기법의 넓은 범위가, 적외선 분광기 (41)를 푸리에 변환, X 선 (42) 및 중성자 반사율 43 수 상기 특성화 및 단순 및 복합 이중층 구성 SALB 방법에 의해 제조 연구하는 데 사용할. 이 새로운 기능은 간단하고 강력한 실험 프로토콜을 이용하여 인공 세포막을 탐색 할 수 있습니다 과학자의 더 많은 수의 문을 엽니 다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 NJC에 국립 연구 재단 (NRF -NRFF2011-01과 NRF2015NRF-POC0001-19), 국립 의료 연구위원회 (NMRC / CBRG / / 2012 0005), 그리고 난양 기술 대학에서 지원을 인정하고자하는
QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Isopropanol | Sigma | 673773 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
n-propanol | Sigma | 279544 | |
Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
Silicon tubing 1.6mm ID | IBIDI | 10842 | |
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |