Мы представляем экспериментальный протокол для формирования поддерживаемый липидный бислой на твердых подложках без использования липидные пузырьки. Покажем способ одностадийного сформировать липидный бислой на диоксид кремния и золота, а также поддерживаемые мембраны с холестерином обогащенного области для различных биологических приложений.
Для того, чтобы имитировать клеточные мембраны, поддерживаемой липидный бислой (SLB) является привлекательной платформой, которая позволяет в пробирке исследования мембранных процессов, связанных в то время придания биосовместимости и biofunctionality с твердыми подложками. Спонтанное адсорбции и разрыв пузырьков фосфолипида является наиболее широко используемым методом для формирования SLBS. Тем не менее, в физиологических условиях, слияния пузырьков (VF) ограничена только подмножество липидных композиций и твердых подложках. Здесь мы описываем один шаг общую процедуру называют методом формирования растворителей помощь липидный бислой (САЛБ), чтобы сформировать SLBS, который не требует везикулы. Способ САЛБ включает нанесение липидных молекул на твердую поверхность в присутствии смешивающихся с водой органических растворителей (например, изопропанол) и последующего растворителя обмена с водном буферном растворе, чтобы вызвать образование SLB. Непрерывный процесс обмена растворителя позволяет применениеСпособ в конфигурации проточного подходящей для формирования двухслойной мониторинг и последующих изменений с использованием широкого спектра поверхностных чувствительных биосенсоров. Способ САЛБ может быть использован для изготовления SLBS по широкому кругу гидрофильных твердых поверхностей, в том числе те, которые неразрешимыми слияния пузырьков. Кроме того, это дает возможность изготавливать SLBS, состоящих из липидных композиций, которые не могут быть получены с помощью метода слияния пузырьков. Здесь мы сравним результаты, полученные с SALB и традиционными методами слияния пузырьков на двух иллюстративных гидрофильных поверхностей, диоксид кремния и золота. Для оптимизации условий эксперимента для приготовления высококачественных бислоев, полученных с помощью метода SALB, влияние различных параметров, в том числе типа органического растворителя на стадии осаждения, скорости обмена растворителя и концентрации липидов рассматривается наряду с советы по устранению неисправностей , Формирование поддерживаемых мембран, содержащих высокие фракций холестерина также демоныtrated с методом SALB, выделяя технические возможности техники SALB для широкого диапазона конфигураций мембран.
Сплошная поддержке липидный бислой 1 (SLB) является универсальной платформой, которая сохраняет основные характеристики биомембран, такие как толщина двухслойной, двумерной диффузии липидов и способностью принять ассоциированных с мембранами биомолекул. Из-за сложности природных клеточных мембран, это простая платформа была показана функционировать в качестве платформы для эффективного обучения в пробирке в мембранных процессов, связанных с такими, как плот формирования 2, 3 связывания с белками, вирус и вирус связывания частица 4,5 и сотовый сигнализации 6. Сформированный в непосредственной близости от твердой подложке, платформа SLB совместим с различными поверхностно-чувствительных методов измерения, такие как полное внутреннее отражение микроскопии (TIRF), Пьезокварцевые-диссипации (QCM-D), и импедансной спектроскопии.
Некоторые методы были разработаны для получения разных типов, в том числе SLBS пузырька воздухаКрах 7 и ближнего пера нанолитографии 8 для субмикронных липидов пятен, спин-покрытие 9 для двухслойных труб и Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ) 10 и слияния пузырьков (VF) 11 для полного Spanning, однослойных покрытий липидного бислоя. Метод В. Ф. состоит из адсорбции небольшие однослойные пузырьки в твердом носителе и последующее спонтанного разрыва и слияния с образованием непрерывной липидный бислой. Тем не менее, в физиологических условиях, разрыв спонтанное пузырьков в основном ограничивается на основе кремния материалов, таких как диоксид кремния, стекла и слюды. Кроме того, разрыв пузырьков не происходит спонтанно в течение пузырьков сложных липидных композиций, таких как те, которые содержат высокие доли холестерина или отрицательно заряженных липидов. В зависимости от системы, разрыв пузырьков может быть вызвано тем, что дополнительно пошива экспериментальных условий, таких как температура 12, рН раствора 13 и солености 14 осмотического шока 15 </sдо> или давлением 16 или добавлением двухвалентных ионов, таких как Са2 + 17. В качестве альтернативы, мембрана-активные АГ пептид может быть введен с целью дестабилизации слоя адсорбированных пузырьков, что приводит к разрыву пузырьков и формирования двухслойной по ряду поверхности 18-22.
Кроме того, успешное формирование двухслойной требует подготовки хорошо контролируемых населения малых однослойных везикул, которые могут занять много времени, и трудно достичь определенных мембранных композиций. Таким образом, несмотря на его высокую эффективность в оптимальных случаях (например, после обширного замораживания-оттаивания предварительной пузырьков 23), общее применение слияния пузырьков будет ограничиваться рамками соответствующих субстратов и мембранных композиций.
Способ 24-28 растворителе при содействии липидный бислой (САЛБ) является альтернативой технология изготовления, которая не требует липидные пузырьки. Метод основан на осаждения OМолекулы липидов F на твердую поверхность в присутствии водорастворимого органического растворителя с последующей постепенной обмена этом растворителе с водным буферным раствором, чтобы вызвать образование SLB. В растворителей стадии обмена, тройной смеси липидов, органическом растворителе, и вода претерпевает фазовый переход серии с увеличением доли воды, что приводит к образованию слоистых структур в фазовых объеме раствора и SLB на твердой подложке. Важно отметить, что это самосборка маршрут обходит необходимость пузырьков разрыва, который, как правило, предельный шаг для превращения адсорбированных пузырьков в SLB. Протокол применим к широкому разнообразию поверхностей в том числе диоксида кремния, оксида алюминия, хрома, индия и олова, оксид и золота. В этой статье и в прилагаемом видео, сравнение липидного отложения в SALB и методов слияния пузырьков представлена. В частности, влияние параметров эксперимента, в том числе концентрации липидов, Скорость потока, и выбор смешивающегося с водой органического растворителя, от качества двухслойной, образованной методом SALB обсуждаются. Аналитическую характеристику изготовленного SLBS осуществляется QCM-D, флуоресцентной микроскопии, и восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) методы. QCM-D мониторинг техника измерения массы поверхности чувствительной, которые с новаторской работы, проведенной Келлер и Kasemo 29, широко используется для количественного исследования формирование двухслойной. Флуоресцентная микроскопия позволяет осмотр мембраны однородности, а также визуализацию мембранных доменов. Методика FRAP является стандартным инструментом для определения боковой подвижности липидных молекул в SLB, который является существенным свойством жидкостных мембран.
Первая часть этого исследования предполагает QCM-D анализ SALB и методы слияния пузырьков применяется, чтобы попытаться образование двухслойной диоксида кремния и золота. Во второй части,подготовка и характеристика поддерживаемых мембран, содержащих различные концентрации холестерина с использованием метода SALB продемонстрированы и результаты сравнивают с результатами, полученными с помощью метода слияния пузырьков.
В этой работе, протокол растворителей обмен представлен в котором липиды в спирте (изопропанол, этанол или н-пропанол) инкубируют с твердой подложкой, а затем спирт заменен постепенно с водным буферным раствором, чтобы вести серию фазовых переходов в конечном итоге производить пластинчатые фазы липидных двойных 24. Показано, что метод позволяет изготавливать поддерживаемых липидных бислоев на поверхностях, таких как золото, которое неразрешимыми методом слияния пузырьков.
Оптимальный диапазон концентраций липидов (0,1 – 0,5 мг / мл) была определена для полного формирования двухслойной в стандартных форматах экспериментальных проверенных сих пор. При концентрациях липидов ниже 0,1 мг / мл, дискретных, микроскопических пятен бислоями формируется. С другой стороны, при концентрации выше 0,1 мг / мл и меньше, чем 0,5 мг / мл, полное и равномерное бислой формируется. При концентрациях липидов выше этого диапазона, двухслойная жидкость еще формируется Verifiред анализа FRAP, однако, флуоресцентной микроскопии показывает наличие дополнительных структур липида в верхней части двойного слоя. Поразительно, морфология этих дополнительных липидов структур, как определено QCM-D анализа, зависит от спирта, который был использован в ходе стадии инкубации. В случае этанола, относительно высокие Д F Δ и D сдвиги напоминают QCM-D сигнатуру, полученную на адсорбированной пузырьков слоя. При изопропанол или н-пропанол вместо этого используется, Δ F была несколько выше, чем значение ожидаемой для двухслойной (конечная Д F между -30 до -40 Гц), в то время как Δ D была значительно выше. Такие QCM-D реакции можно было бы ожидать в течение длительных структур липида (например, червеобразные мицеллы), выступающие наружу от поверхности мембраны (как видно с помощью флуоресцентной микроскопии в некоторых случаях).
Скорость обмена растворителем является еще одним важным параметром, который может иметь решающее значение, ESPECially, когда более низкие концентрации липидов (например, 0,1 мг / мл) используются. Система быстрой смены растворителя при низкой концентрации липидов может привести к образованию неполных бислоев. В стандартной измерительной камеры, используемой для измерения QCM-D в этой статье (измерительная камера Q-Sense Е4), скорости потока около 100 мкл / мин, были пригодны для высокой воспроизводимостью полного формирования двухслойной. Для проточных с другими геометрии и объема, оптимальный расход может варьироваться и должны быть определены эмпирически на основе этапов, предложенных в настоящем документе.
Кроме того, чтобы сформировать поддерживаемые бислоев на поверхностях, которые неразрешимыми слияния пузырьков, то САЛБ могут быть использованы, чтобы обойти потребность в липидных везикул, которые могут разрыва, открывая тем самым дверь в изготовлении мембран с поддерживаемых сложных композиций. В качестве иллюстративного примера композиции, липидные смеси с высокой долей холестерина были изучены. Холестерин является важным компонентом MammАлеан клеточные мембраны, и его доля может приблизиться к 45-50 мол% от мембранных липидов композиции (например, в эритроцитах). Таким образом, даже простая модель липидного бислоя мембраны, представляющий клеток человека должна включать в себя холестерин.
В то время как слияния пузырьков может быть использовано для изготовления жидкостных бислоев, содержащих только 10-15% холестерина, причем способ включает САЛБ образование жидкостных липидных бислоев, содержащих высокие доли холестерина (до 57% мол, а количественно QCM-D измерений) 36. Однако, когда уровень холестерина был повышен дополнительно (до 63% мол), полоса-формы домены наблюдались 37. Сосуществующих домены были жидкость, напоминающая те, в регионе наблюдается бета на фазовой диаграмме монослоя холестерина / фосфолипидов на границе воздух-вода.
В целом, способ САЛБ Показано, что простой и эффективный подход к образуют поддерживаемые бислоев, особенно яN случаев выходит за рамки обычного метода слияния пузырьков. До сих пор, в QCM-D техника и флуоресцентной микроскопии, в основном, используется для характеристики поддерживаемых бислоев, сформированные методом SALB. Заглядывая вперед, широкий диапазон поверхностно-чувствительных методов аналитических измерений, в том числе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) 38, атомно-силовой микроскопии (АСМ) 39,40, Фурье-ИК-спектроскопии 41, рентген 42 и нейтронов отражения 43, может быть использованы для дальнейшего изучения свойств и простые и сложные конфигурации двухслойные подготовить методом SALB. Эти новые возможности открывают двери для большего числа ученых, которые можно исследовать мембраны клеток искусственные, воспользовавшись простой и надежной экспериментальной протокола.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить признательность поддержку от Национального исследовательского фонда (ПЗФ -NRFF2011-01 и NRF2015NRF-POC0001-19), Национального Медицинского исследовательского совета (NMRC / CBRG / 0005/2012), и Nanyang технологический университет в НСК
QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Isopropanol | Sigma | 673773 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
n-propanol | Sigma | 279544 | |
Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
Silicon tubing 1.6mm ID | IBIDI | 10842 | |
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |