Biz lipid veziküller kullanmadan katı yüzeyler üzerinde desteklenen lipid çift oluşturmak için deneysel bir protokol mevcut. Çeşitli biyolojik uygulamalarda, kolesterol açısından zengin bir etki ile, bir lipid, silikon dioksit ve altın iki tabakalı olarak desteklenen zarları meydana getirmek üzere, bir aşamalı bir yöntemi göstermektedir.
Hücre zarları taklit etmek amacıyla, desteklenen çift katlı lipid (SLB) katı yüzeylere biyouyumluluk ve biofunctionality kazandıran ise membran ile ilgili süreçlerin in vitro soruşturma sağlayan çekici bir platformdur. Fosfolipit keseciklerin spontan adsorpsiyon ve kopma SLBs oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında, vezikül füzyon (VF) lipid bileşimleri ve katı destek, yalnızca bir alt kümesi ile sınırlıdır. Burada, veziküller gerektirmez SLBs oluşturmak üzere çözücü yardımlı lipid iki katmanlı (SALB) oluşumu yöntemi denir tek-aşamalı bir genel prosedür tarif etmektedir. SALB yöntemi SLB oluşumunu tetiklemek amacıyla, su ile karışabilen organik çözücüler (örneğin, izopropanol) ve sulu tampon solüsyonu ile daha sonra solvent değişimi varlığında bir katı yüzey üzerine lipit moleküllerinin birikmesini içerir. Sürekli çözücü değişim aşaması uygulanmasını sağlarİzleme iki katmanlı oluşum ve yüzey duyarlı biyosensör geniş bir yelpazede kullanarak bir sonraki değişiklikler için uygun olan bir akış konfigürasyonunda metot. SALB yöntemi vezikül füzyon dirençli olanlar dahil olmak üzere, hidrofil bir yüzeylerin geniş bir yelpazede SLBs imal etmek için de kullanılabilir. Buna ek olarak, bu vezikül füzyon metodu kullanılarak hazırlanamaz lipid bileşimlerinin oluşan SLBs imalatım mümkün. Burada, iki örnek hidrofilik yüzeyler, silisyum dioksit ve altın SALB ve konvansiyonel vezikül füzyon yöntemleri ile elde edilen sonuçları karşılaştırmak. SALB yöntemi ile hazırlanan, yüksek kaliteli iki katmanlı hazırlanması için deneysel koşullar optimize etmek için, yerleştirme aşamasında organik çözücü tipi, çözücü değişimine oranı ve lipit konsantrasyonu dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin etkisi sorun uçları ile birlikte ele alınmaktadır . Yüksek kolesterol içeren fraksiyonlar desteklenen membran oluşumu da cinler olanMembran yapılandırmaları geniş bir aralığı için SALB tekniğinin teknik özelliklerini vurgulayan, SALB yöntemiyle trated.
Katı destekli lipid iki katmanlı 1 (SLB) bu tür iki tabakalı bir kalınlıkta, iki boyutlu lipit yayılma ve membran bağlantılı biyomoleküllerin barındırmak yeteneği gibi biyomembranlar temel özelliklerini koruyan çok yönlü bir platformdur. Nedeniyle doğal hücre membranlarının karmaşıklığı nedeniyle, bu basit bir platform 3, virüs ve virüs benzeri partikül 4,5 ciltleme gibi Sal oluşumu 2, protein gibi zara bağlı süreçlerin, in vitro çalışmalar için etkili bir platform işlevi gösterilmiştir ve hücre 6 sinyalizasyon. Katı bir desteğe yakın olarak kurulan SLB bu platform, toplam iç yansıma mikroskobu (TIRF), kuartz kristali mikro–dağılımı (QCM-D) ve empedans spektroskopi gibi yüzey duyarlı ölçümleri bir dizi teknik ile uyumludur.
Çeşitli yöntemler de dahil olmak üzere hava kabarcığı SLBs farklı üretmek için geliştirilmiştirmikrondan daha küçük ebatlı lipit noktalar çöküşü 7 ve dip-kalem Nanolitografi 8, spin-kaplama iki tabakalı yığınları ve Langmuir-Blodgett (LB) 10 ve tam yayılarak, tek çift katlı lipid kaplamalar için vezikül füzyon (VF) 11 9. VF yöntem, sürekli bir lipid çift oluşturmak için katı bir destek ve daha sonra kendiliğinden kopma ve füzyon küçük tek lamelli vesiküller adsorpsiyonu oluşur. Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında kendiliğinden vezikül yırtılması ağırlıklı olarak silikon dioksit, cam ve mika gibi silikon bazlı malzemeler ile sınırlıdır. Buna ek olarak, vezikül yırtılması kolesterol veya negatif yüklü yüksek lipid içeren fraksiyonlar gibi karmaşık lipid bileşimlerin keseler kendiliğinden oluşmaz. Sisteme bağlı olarak, vezikül yırtılması daha sıcaklık 12, çözelti pH 13 ve tuzluluk 14, ozmotik şok 15 gibi deneysel koşulların uyarlayarak indüklenebilir </sbasınç 16, ya da Ca2 + gibi iki değerlikli iyonların yanı sıra yukarı> ya da 17. Buna alternatif olarak zar aktif peptidi AH bir dizi vezikül kopma ve iki tabakalı bir oluşumuna yol açan, adsorbe veziküller bir tabaka destabilize etmek için dahil edilebilir 18-22 yüzeyleri.
Ayrıca, başarılı bir şekilde iki katmanlı oluşum zaman alıcı ve belli membran bileşimleri için elde etmek zor olabilir küçük tek lamelli vesiküller ve iyi kontrol edilen bir nüfus hazırlanmasını gerektirir. Bu nedenle, optimal durumlarda yüksek verimliliğine rağmen (örneğin, veziküller 23 geniş dondurma-eritme öncesi işlemden sonra), vezikül füzyon genel uygulama için uygun alt tabakalar ve membran bileşimlerinin kapsamı ile sınırlıdır.
Çözücü yardımlı lipid iki katmanlı (SALB) yöntemi 24-28 lipid kabarcıklar gerektirmeyen alternatif bir üretim tekniğidir. Yöntem biriktirme o dayanmaktadırSLB oluşumunu tetiklemek için, sulu bir tampon çözelti ile bu çözücü yavaş yavaş değişimi, ardından su ile karışabilen bir organik çözücünün varlığında, bir katı yüzey üzerine ön lipit molekülleri. Solvent değişim aşamasının, lipidler, bir organik çözücü üçlü karışım ve su sırasında yığın solüsyonu içinde bir katmanlı faz yapısında oluşumu ve katı bir substrat üzerinde SLB neden su oranının, artan bir dizi faz değişimlerine maruz kalır. Önemli olarak, bu kendi kendini montaj yolu genellikle SLB içinde adsorbe veziküllerin transformasyonu için sınırlayıcı bir adımdır vezikül yırtılması, ihtiyacı atlar. Protokol silikon dioksit, alüminyum oksit, krom, indiyum tin oksit, altın yüzeyleri de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede uygulanabilir. Bu yazıda ve beraberindeki video, SALB ve vezikül füzyon yöntemleri ile lipid birikimi bir karşılaştırma sunulmaktadır. Özel olarak, deney parametreleri etkisi de dahil olmak üzere, lipid konsantrasyonu,Akış oranı ve SALB yöntemi ile oluşturulan çift katlı kalitesi su ile karışabilen bir organik çözücü seçimi, tartışılmıştır. Imal edilmiş SLBs Analitik Karakterizasyonu (FRAP) teknikleri ışıkla ağartma sonra QCM-D, flüoresan mikroskobu ve floresan kurtarma ile gerçekleştirilir. QCM-D izleme Keller ve Kasemo 29 tarafından yapılan öncü çalışmalar, çünkü geniş bir nicel iki katmanlı oluşum araştırmak için kullanılmıştır, bir yüzey-duyarlı bir kütle ölçümü tekniğidir. Floresan mikroskopi zar homojenliği denetlenmesine yanı sıra membran etki görselleştirme izin verir. FRAP tekniği akışkan zarlarının esas bir özelliği olan, SLB, lipid moleküllerinin yatay hareketlilik belirlemek için standart bir araçtır.
Bu çalışmanın ilk bölümü silikon dioksit ve altın iki tabakalı oluşumunu girişimi uygulanan SALB of QCM-D analizi ve vezikül füzyon yöntemleri içerir. İkinci bölümde ise,hazırlanması ve SALB yöntemi ile kolesterol konsantrasyonlarının bir dizi içeren bir taşıyıcı membran karakterizasyonu gösterilmiştir ve sonuçlar vezikül füzyon metodu ile elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır.
Bu çalışmada, bir çözücü-değişimi protokolü, bir katı destek ile inkübe edilir alkol (izopropanol, etanol veya n-propanol), hangi lipidler içinde sunulmaktadır ve daha sonra alkol, bir dizi kumanda etmek üzere, sulu bir tampon solüsyonu ile yavaş yavaş değiştirilir Faz geçişleri sonunda katmanlı fazlı çift katlı lipit katmanını 24 üreten. Bu yöntem, vezikül füzyon yöntemine dirençli olan altın gibi yüzeyler üzerinde desteklenen lipid iki katmanlı imalatım mümkün olduğu gösterilmiştir.
Optimal bir lipid konsantrasyonu aralığı (0,1-0,5 mg / ml) Şimdiye kadar test edilen standart deneysel biçimleri tam çift katlı bir oluşum için tespit edilmiştir. Iki katmanlı 0.1 mg / ml arasında, ayrı ayrı, mikroskopik yamalar aşağıdaki lipit konsantrasyonlarında kurdu. Diğer taraftan, 0.1 mg / ml'nin üzerindeki konsantrasyonlarda ve daha az daha 0,5 mg / ml, tam ve düzgün bir iki katmanlı oluşturulmaktadır. Bu aralığın üstüne lipit konsantrasyonlarında, iki katmanlı bir sıvı hala doğrulanmadan olarak elde edildiFRAP analizi ile ed Ancak, floresan mikroskobu çift katmanı üstüne ilave lipit yapıların varlığını gösterir. QCM-D analizi ile belirlendiği gibi, çarpıcı bir biçimde, bu ek de lipit yapıların morfolojisi, inkübasyon kademesi sırasında kullanılan alkolün bağlıydı. Etanol olması durumunda, nispeten yüksek Δ F ve Δ D kaymalar bir adsorbe vezikül tabakası için elde edilen QCM-D imza benzer. Izopropanol ya da n-propanol yerine kullanıldığı zaman Δ D kayda değer ölçüde daha yüksek iken, Δ f bir iki katmanlı (-30 Hz -40 arasında nihai Δ f) için tahmin edilen değerden biraz daha yüksek olmuştur. Bu tür QCM-D yanıtları (bazı durumlarda flüoresans mikroskopi ile görünür gibi) membran yüzeyinden dışarı doğru çıkıntı yapan uzun bir lipit yapıların (örneğin, solucan benzeri miseller) için beklenir.
Çözücü değişimine oranı espec, kritik öneme sahip bir başka önemli parametredirAlt lipid konsantrasyonları (örneğin, 0,1 mg / ml) kullanılmıştır selülazlar olduğunda. Düşük lipid konsantrasyonunda hızlı solvent alış veriş eksik çift tabakaların oluşmasına yol açar. Bu yazıda QCM-D ölçümlerinin (Q-Sense E4 ölçüm odası), yaklaşık 100 ul / dk akış oranları için kullanılan standart ölçüm odasında, yüksek tekrarlanabilir tam iki katmanlı oluşumuna uygun idi. Diğer geometriler ve hacim ile akış hücreleri için, uygun bir akış hızı değişebilir ve ampirik olarak burada önerilen adımları göre belirlenmelidir.
Vezikül füzyon dirençli olan yüzeyler üzerinde desteklenen lipid ikili katlar oluşturacak ek olarak, SALB böylece kompleks bileşimleri ile desteklenen zarların imalat kapı açma, yırtılabilir lipid vezikülleri için ihtiyaç aşmak için kullanılabilir. Açıklayıcı bir örnek, bir bileşim olarak, kolesterol, yüksek fraksiyonlu lipit karışımları incelenmiştir. Kolesterol memeli konakçının önemli bir bileşenidiralian hücre zarları ve onun fraksiyonu (eritrositler içinde, örneğin) membran lipid bileşiminin 45-50 mol% yaklaşım olabilir. Bu durumda, bir insan hücre zarı temsil eden bir çift katlı lipid bile basit bir model kolesterol içermelidir.
Vezikül füzyon sadece% 10-15 kolesterol ihtiva eden akışkan bir lipid ikili tabakaları imal etmek için kullanılabilir ise 36 (QCM-D ölçümleri sayıya dökülmüş olarak 57% mol kadar), SALB yöntemi yüksek kolesterol içeren fraksiyonlar akışkan lipid iki katmanlı oluşum sağlamaktadır. Kolesterol seviyesi daha (63 mol kadar%) yükselmiş, ancak, şerit şeklinde alanları 37 gözlendi. Yandaş etki hava-su arayüzünde kolesterol / fosfolipidler tek tabaka faz diyagramı β bölgede gözlenen anımsatan sıvı vardı.
Genel olarak, SALB yöntemi özellikle, desteklenen lipid ikili katlar oluşturacak için basit ve verimli bir yaklaşım olduğu gösterilmiştirGeleneksel vezikül füzyon yöntemi kapsamı dışındadır n olgu. Şu ana kadar, QCM-D tekniği ve floresan mikroskobu esas SALB metodu ile oluşturulmuş desteklenen lipit katmanlarını karakterize etmek için kullanıldı. İleriye yönelik olarak, yüzey plasmon rezonansı (SPR) 38, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) 39,40 olmak üzere yüzey duyarlı analitik ölçümler teknikleri, geniş bir yelpazede, kızılötesi spektroskopi 41 Fourier-dönüşümü, X-ışını 42 ve nötron yansıtma 43 can, Daha fazla karakterize ve basit ve karmaşık iki katmanlı yapılandırmaları SALB yöntemiyle hazırlamak incelemek için kullanılabilir. Bunlar gelişmekte olan yetenekleri basit ve sağlam deneysel protokol yararlanarak yapay hücre zarlarını keşfedebilirsiniz bilim adamlarının daha fazla sayıda kapıyı açın.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar NJC Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK -NRFF2011-01 ve NRF2015NRF-POC0001-19), Ulusal Medikal Araştırma Konseyi (NMRC / CBRG / / 2012 0005) ve Nanyang Technological University gelen destek için teşekkürlerimizi sunarız
QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Isopropanol | Sigma | 673773 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
n-propanol | Sigma | 279544 | |
Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
Silicon tubing 1.6mm ID | IBIDI | 10842 | |
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |