Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

doi: 10.3791/53073 Published: December 1, 2015

Summary

Biz lipid veziküller kullanmadan katı yüzeyler üzerinde desteklenen lipid çift oluşturmak için deneysel bir protokol mevcut. Çeşitli biyolojik uygulamalarda, kolesterol açısından zengin bir etki ile, bir lipid, silikon dioksit ve altın iki tabakalı olarak desteklenen zarları meydana getirmek üzere, bir aşamalı bir yöntemi göstermektedir.

Abstract

Hücre zarları taklit etmek amacıyla, desteklenen çift katlı lipid (SLB) katı yüzeylere biyouyumluluk ve biofunctionality kazandıran ise membran ile ilgili süreçlerin in vitro soruşturma sağlayan çekici bir platformdur. Fosfolipit keseciklerin spontan adsorpsiyon ve kopma SLBs oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında, vezikül füzyon (VF) lipid bileşimleri ve katı destek, yalnızca bir alt kümesi ile sınırlıdır. Burada, veziküller gerektirmez SLBs oluşturmak üzere çözücü yardımlı lipid iki katmanlı (SALB) oluşumu yöntemi denir tek-aşamalı bir genel prosedür tarif etmektedir. SALB yöntemi SLB oluşumunu tetiklemek amacıyla, su ile karışabilen organik çözücüler (örneğin, izopropanol) ve sulu tampon solüsyonu ile daha sonra solvent değişimi varlığında bir katı yüzey üzerine lipit moleküllerinin birikmesini içerir. Sürekli çözücü değişim aşaması uygulanmasını sağlarİzleme iki katmanlı oluşum ve yüzey duyarlı biyosensör geniş bir yelpazede kullanarak bir sonraki değişiklikler için uygun olan bir akış konfigürasyonunda metot. SALB yöntemi vezikül füzyon dirençli olanlar dahil olmak üzere, hidrofil bir yüzeylerin geniş bir yelpazede SLBs imal etmek için de kullanılabilir. Buna ek olarak, bu vezikül füzyon metodu kullanılarak hazırlanamaz lipid bileşimlerinin oluşan SLBs imalatım mümkün. Burada, iki örnek hidrofilik yüzeyler, silisyum dioksit ve altın SALB ve konvansiyonel vezikül füzyon yöntemleri ile elde edilen sonuçları karşılaştırmak. SALB yöntemi ile hazırlanan, yüksek kaliteli iki katmanlı hazırlanması için deneysel koşullar optimize etmek için, yerleştirme aşamasında organik çözücü tipi, çözücü değişimine oranı ve lipit konsantrasyonu dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin etkisi sorun uçları ile birlikte ele alınmaktadır . Yüksek kolesterol içeren fraksiyonlar desteklenen membran oluşumu da cinler olanMembran yapılandırmaları geniş bir aralığı için SALB tekniğinin teknik özelliklerini vurgulayan, SALB yöntemiyle trated.

Introduction

Katı destekli lipid iki katmanlı 1 (SLB) bu tür iki tabakalı bir kalınlıkta, iki boyutlu lipit yayılma ve membran bağlantılı biyomoleküllerin barındırmak yeteneği gibi biyomembranlar temel özelliklerini koruyan çok yönlü bir platformdur. Nedeniyle doğal hücre membranlarının karmaşıklığı nedeniyle, bu basit bir platform 3, virüs ve virüs benzeri partikül 4,5 ciltleme gibi Sal oluşumu 2, protein gibi zara bağlı süreçlerin, in vitro çalışmalar için etkili bir platform işlevi gösterilmiştir ve hücre 6 sinyalizasyon. Katı bir desteğe yakın olarak kurulan SLB bu platform, toplam iç yansıma mikroskobu (TIRF), kuartz kristali mikro--dağılımı (QCM-D) ve empedans spektroskopi gibi yüzey duyarlı ölçümleri bir dizi teknik ile uyumludur.

Çeşitli yöntemler de dahil olmak üzere hava kabarcığı SLBs farklı üretmek için geliştirilmiştirmikrondan daha küçük ebatlı lipit noktalar çöküşü 7 ve dip-kalem Nanolitografi 8, spin-kaplama iki tabakalı yığınları ve Langmuir-Blodgett (LB) 10 ve tam yayılarak, tek çift katlı lipid kaplamalar için vezikül füzyon (VF) 11 9. VF yöntem, sürekli bir lipid çift oluşturmak için katı bir destek ve daha sonra kendiliğinden kopma ve füzyon küçük tek lamelli vesiküller adsorpsiyonu oluşur. Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında kendiliğinden vezikül yırtılması ağırlıklı olarak silikon dioksit, cam ve mika gibi silikon bazlı malzemeler ile sınırlıdır. Buna ek olarak, vezikül yırtılması kolesterol veya negatif yüklü yüksek lipid içeren fraksiyonlar gibi karmaşık lipid bileşimlerin keseler kendiliğinden oluşmaz. Sisteme bağlı olarak, vezikül yırtılması daha sıcaklık 12, çözelti pH 13 ve tuzluluk 14, ozmotik şok 15 gibi deneysel koşulların uyarlayarak indüklenebilir 16, ya da Ca2 + gibi iki değerlikli iyonların yanı sıra yukarı> ya da 17. Buna alternatif olarak zar aktif peptidi AH bir dizi vezikül kopma ve iki tabakalı bir oluşumuna yol açan, adsorbe veziküller bir tabaka destabilize etmek için dahil edilebilir 18-22 yüzeyleri.

Ayrıca, başarılı bir şekilde iki katmanlı oluşum zaman alıcı ve belli membran bileşimleri için elde etmek zor olabilir küçük tek lamelli vesiküller ve iyi kontrol edilen bir nüfus hazırlanmasını gerektirir. Bu nedenle, optimal durumlarda yüksek verimliliğine rağmen (örneğin, veziküller 23 geniş dondurma-eritme öncesi işlemden sonra), vezikül füzyon genel uygulama için uygun alt tabakalar ve membran bileşimlerinin kapsamı ile sınırlıdır.

Çözücü yardımlı lipid iki katmanlı (SALB) yöntemi 24-28 lipid kabarcıklar gerektirmeyen alternatif bir üretim tekniğidir. Yöntem biriktirme o dayanmaktadırSLB oluşumunu tetiklemek için, sulu bir tampon çözelti ile bu çözücü yavaş yavaş değişimi, ardından su ile karışabilen bir organik çözücünün varlığında, bir katı yüzey üzerine ön lipit molekülleri. Solvent değişim aşamasının, lipidler, bir organik çözücü üçlü karışım ve su sırasında yığın solüsyonu içinde bir katmanlı faz yapısında oluşumu ve katı bir substrat üzerinde SLB neden su oranının, artan bir dizi faz değişimlerine maruz kalır. Önemli olarak, bu kendi kendini montaj yolu genellikle SLB içinde adsorbe veziküllerin transformasyonu için sınırlayıcı bir adımdır vezikül yırtılması, ihtiyacı atlar. Protokol silikon dioksit, alüminyum oksit, krom, indiyum tin oksit, altın yüzeyleri de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede uygulanabilir. Bu yazıda ve beraberindeki video, SALB ve vezikül füzyon yöntemleri ile lipid birikimi bir karşılaştırma sunulmaktadır. Özel olarak, deney parametreleri etkisi de dahil olmak üzere, lipid konsantrasyonu,Akış oranı ve SALB yöntemi ile oluşturulan çift katlı kalitesi su ile karışabilen bir organik çözücü seçimi, tartışılmıştır. Imal edilmiş SLBs Analitik Karakterizasyonu (FRAP) teknikleri ışıkla ağartma sonra QCM-D, flüoresan mikroskobu ve floresan kurtarma ile gerçekleştirilir. QCM-D izleme Keller ve Kasemo 29 tarafından yapılan öncü çalışmalar, çünkü geniş bir nicel iki katmanlı oluşum araştırmak için kullanılmıştır, bir yüzey-duyarlı bir kütle ölçümü tekniğidir. Floresan mikroskopi zar homojenliği denetlenmesine yanı sıra membran etki görselleştirme izin verir. FRAP tekniği akışkan zarlarının esas bir özelliği olan, SLB, lipid moleküllerinin yatay hareketlilik belirlemek için standart bir araçtır.

Bu çalışmanın ilk bölümü silikon dioksit ve altın iki tabakalı oluşumunu girişimi uygulanan SALB of QCM-D analizi ve vezikül füzyon yöntemleri içerir. İkinci bölümde ise,hazırlanması ve SALB yöntemi ile kolesterol konsantrasyonlarının bir dizi içeren bir taşıyıcı membran karakterizasyonu gösterilmiştir ve sonuçlar vezikül füzyon metodu ile elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır.

Protocol

Bir Hidrofilik Katı Destek Desteklenen çift katlı lipid 1. oluşumu

  1. 10 mg / ml 1,2-dioleoil-sn -glisero-3-fosfokolin lipid stok çözelti hazırlayın (DOPC) ve 1 mg / ml 1,2-dioleoil-sn -glisero-3-phosphoethanolamine- A ^ - (lisamin rodamin B ilgili lipid tozlar çözülmesiyle sülfonil) (Rh-PE) (uygun şekilde izopropanol çözeltisi içinde bir analitik kitle balansı) ile daha önce tartılmış.
  2. Seyreltilir ve nihai konsantrasyonda istenilen lipid karışımı hazırlamak için izopropanol içindeki stok çözeltileri karıştırın. Floresans mikroskobu ve sıkı bağlamak deneyler için,% 0.5 ağırlık Rh-PE lipit karışımı içinde dahil edilmelidir.
  3. Dolana kadar o mikroakışkan kanal içine izopropanol lipid karışımı enjekte edilir.
  4. Yaklaşık 10 dakika boyunca bir cam yüzeyi üzerinde, lipid karışımı inkübe edin.
  5. Yavaş yavaş çok düşük bir akış hızında, bir peristaltik pompa kullanılarak, su veya tampon solüsyonu ile lipid çözeltisi yerine(10-50 ul / dakika). Seçenek olarak ise, tekrar pipetleme lipit karışımı değiştirin.
  6. Kalıntı izopropanol çıkartmak için aşırı tamponu ile iyice kanal durulayın.

Kolesterol zenginleştirilmiş Desteklenen Membran 2. oluşumu

Not: Katı yüzeyi (SiO 2) vezikül füzyon destekler, ancak kolesterol zenginleştirilmiş kesecikler yüksek sertliği 30 bükme çünkü membran bileşimi (yüksek kolesterol) vezikül füzyon engeller.

  1. İlk izopropanol ilgili tozların eritilmesi ile 10 mg / ml lipid DOPC, 10 mg / ml kolesterol ve 1 mg / ml Rh PE ihtiva eden bir stok çözelti hazırlayın.
  2. Yineleyin adımda 2.1 hazırlanan stok solüsyonları kullanılarak 1.2-1.6 adımları tekrarlayın.

3. Membran Akışkanlık Testi

  1. 10 dakika boyunca, sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi (% 1) içinde cam slayt bırakın.
  2. Deiyonize su ile iyice yıkayın slaytlar ve zekâ durulamah etanol.
  3. Darbe-kuru hafif bir azot akımı kullanılarak slaytlar.
  4. Oksijen plazma odasına maksimum radyofrekans gücünde 30 saniye boyunca oksijen plazma slaytlar Açığa.
  5. Dipsiz ticari mikroakışkan odası (Şekil 1A) koruyucu film kaplamayı bir cımbız kullanarak çıkartın ve bölmenin (Şekil 1B) yapışkan yüzüne cam slayt takın.
  6. Odasının giriş ve çıkış pozisyonlarına içine konnektörleri ve tüp monte edin ve mikroskop sahne (Şekil 1C) üzerine mikroakışkan kanal yerleştirin.
  7. Mikroakışkan kanal bir floresan etiketli desteklenen lipid çift Form [istenen lipit bileşimi kullanılarak tekrar aşama 1 (örneğin, 0.5 mg / ml DOPC) 0.5 ağırlık% Rh-PE organik bir çözücü de dahil olmak üzere].
  8. Görüntü yakalamak için 60X yağa batırılmış objektif (NA 1.49) ile iki tabakalı uçağı bulun.
  9. İki ön ağartıcı görüntüleri çekmek, daha sonra 30 foto-ağartıcı1; a 532 nm, 100 mW lazer ışını ile geniş dairesel nokta m. Onun yoğunluğu dengeli hale gelene kadar photobleaching önce, lazer ısınmak. Hemen photobleaching sonra, ağartılmış noktada floresan kurtarma takip etmek amacıyla 2 dakika süreyle her 1 sn görüntüleri bir dizi yakalamak.

4. Kolesterol Ölçümü Testi

  1. Oksijen plazma odasına maksimum radyofrekans gücünde 30 saniye boyunca oksijen plazma silikon dioksit kaplı kuvars kristal sensör çipi Açığa. Odasından çipini çıkarın ve hemen ölçüm odasında çip monte edin.
  2. Deneyden önce, ilk olarak uygun bir şekilde monte edilebilmesini sağlamak için hava içinde sensör yongasının sıklığı ve dağılımı elde.
    1. Ticari Q-Sense E1 veya E4 QCM-D enstrüman için, Q-Soft yazılım programı çalıştırın ve "Toplama" linkine tıklayın ve "Kurulum Ölçüm" seçeneğini seçin.
    2. Görüntülenen Yeni penceresinde, 3, 5, 7 çek, 9, 11 ve 13 imalar ardından bulun ve rezonans spektrumları kontrol etmek için çalıştırın tıklayın. 24 sıcaklık ayarlama ° C. Kişinin ya da daha fazla rezonans frekansları beklenen değerlerle kabul etmiyorsanız, montaj çip kontrol edin ve bir anlaşmaya ulaşılana kadar bu adımı tekrar gerçekleştirin.
  3. Peristaltik pompayı 100 ul / dakikalık bir akış hızında ölçüm haznesine tampon çözeltisi (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) akar.
  4. Yazılım programında, "Toplama" linkine tıklayın ve rezonans frekansı ve enerji sönümleme sinyallerini kaydetmek için "Yeniden Ölçümü" seçeneğini seçin. Istikrarlı bir temel frekans ve dağıtma vardiya için elde edilene kadar bu adımı yineleyin. Not: zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir edilebilir ilave frekans ve enerji kaybı değişimleri olacak bundan sonra adımlar için.
  5. 10 dakika boyunca (lipid) olmadan izopropanol enjekte edilir.
  6. En DOPC lipid / kolesterol karışımı enjekte10 dakika boyunca, izopropanol içinde 0.5 mg / ml'lik bir toplam lipid konsantrasyonu, istenen mol oranı.
  7. 100 ul / dakikalık bir akış oranında 20 dakika boyunca tampon enjekte edilir.
  8. Tampon maddesi (oran 100 ul / dakika akış) frekans sinyalinin stabil bir değere ulaşıncaya kadar hazırlanan 1 mM metil-β-siklodekstrin (MβCD) ihtiva eden bir çözelti enjekte edilir.
  9. MβCD muamele aşamasından kaynaklanan görece olumlu frekans değişimleri ölçün ve [Δm = Sauerbrey denklemi kullanarak toplu değerlere kadar taşınmış cho ve mesafe kadar taşınmış DOPC değerleri dönüştürerek kolesterol ve DOPC lipidlerin kütlesi hesaplamak - (C / n) × mesafe kadar taşınmış, burada C = 17,7 ng / cm 2, n: overtone].
  10. Dikkate DOPC lipid (786,1 g / mol) ve kolesterol (386.6 g / mol) molekül ağırlıklarına alarak SLB içinde kolesterol mol fraksiyonu hesaplayın.

Representative Results

Hidrofilik yüzeylerde desteklenen lipit bilayers imalatı.

VF ile SALB oluşum yöntemleri silikon dioksit ve altın QCM boyutlu ölçüm tekniği ile gerçek zamanlı olarak takip edildi oluşumu süreçlerine denendi. Kristal yüzeyine kitle adsorpsiyon üzerine salınan bir piezoelektrik kuvars kristali rezonans frekansı (Δ f) 'de QCM-D enstrüman ölçer değişir. Buna ek olarak, QCM-D gösterge adlayer viskoelastik özellikleri (sağlamlık ve yumuşaklık) karakterize etmek amacıyla, titreşim enerjisi dağılımı ölçer. Daha önce tarif edildiği gibi 31 Vesikül füzyonu deneyleri yapıldı. Kısaca, bazal birinci sulu tampon çözeltisi [10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5 sıklığı ve dağılımı sinyalleri için kurulmuş; (Şekil 2A ve B)]. Daha sonra, aynı tampon içinde küçük tek lamelli veziküller DOPC lipid edildiSilikon dioksit (Şekil 2A) ve altın üzerine t = 10 dk maruz kalanlar (ok 1) (Şekil 2B). Sırasıyla, 6, - silikon dioksit vezikül füzyon için, iki aşamalı bir soğurma kinetikleri frekansı ve enerji -26 (± 1) Hz dağılması ve 0.3 son değişiklikler (± 0.2), 10 x gözlendi. Bu değerler, desteklenen bir çift katlı lipid 29 oluşumu ile uyumludur.

Şekil 2B'de gösterildiği gibi, kendi değerleri Hz (10 ±) -150 ulaştı kadar ve altın yüzeye vezikül çözeltisinin eklenmesi, sırasıyla, Δ F ve Δ D sinyalleri, eşzamanlı bir azalma ve bir artışa yol açtı (7,5 ± 2) sırasıyla 6 - 10 ×. Bu değerler, bir adsorbe vezikül tabakasının oluşumu karşılık gelmektedir. Bu nedenle, beklendiği gibi, bir SLB vezikül füzyon metodu ile altın üzerinde oluşturulmuş değildi.

QCSALB yöntemi ile, silisyum dioksit ve altın iki katmanlı oluşum için MD analizi Şekil 2C ve D sunulmuştur. 6, sırası ile, elde edildi, bu değerler SLB oluşumunu göstermektedir - silikon dioksit, -25,6 (0.55 ±) nihai Δ F ve Δ D kaymalar Hz (0.27 ±) 0.4 üzerinde 10 ×. Δ f ve Δ D Benzer aralıkları (Δ f Au: -27,3 ± 2.7 Hz, Δ D Au: 0.48 (0.26 ±) × 10-6) altın gözlendi. Bu sonuçlar SALB yöntemi vezikül delinmesine engel yüzeylerde desteklenen lipit bilayers oluşumunu sağladığını desteklemektedir.

Desteklenen lipid iki katmanlı kalitesine solvent değişimi akış hızının etkisi.

Yüksek kaliteli desteklenen lipit bilayers vi imalatı için en uygun koşulları belirlemek içinBir SALB yöntem, lipid konsantrasyonu, solvent kur ve organik çözücünün seçimi etkisi incelenmiştir.

Iki farklı akış hızlarında (100 ve 600 ul / dakika) ve iki farklı lipit konsantrasyonlarında (0.125 ve 0.5 mg / ml), silikon dioksit üzerinde gerçekleştirilen Şekil 3, SALB protokolü son aşaması sırasında QCM-D frekansındaki değişimi göstermektedir .

0.5 mg / ml lipid DOPC (Şekil 3A) kullanıldığında, iki katmanlı oluşum akış hızı ve hem de akış oranlarının da elde edilmiştir -26 Hz nihai kadar taşınmış kayması etkilenmedi.

Buna karşılık, daha düşük bir lipid konsantrasyonu kullanıldığı zaman, Tam çözücü değişiminden sonra adsorbe sfingosinin miktarı önemli ölçüde akış hızı (Şekil 3B) etkilenmiştir. 100 ul / dakikalık bir ortalama akış hızında, iki katmanlı oluşum (-26 Hz civarında kadar taşınmış) tamamlandı. Ancak, 6-kat daha yüksek bir akış hızında (600 ul / dakika), tam bir iki katmanlı -17 Hz civarında (kadar taşınmış) oluşan değildi. Bu sonuçlar, tercih edilen organik çözücü olarak izopropanol SALB yöntem kullanarak başarılı şekilde iki katmanlı oluşum için doğru koşulları seçmek için deney bir kılavuz sağlar.

Çeşitli alkol çözümlerinde farklı lipid konsantrasyonları oluşan desteklenen lipit bilayers karakterizasyonu.

Lipid konsantrasyonu SALB yöntem kullanılarak elde SLBs kalitesini etkiler bir diğer parametredir. Floresan mikroskopi 0,05 mg / ml lipid konsantrasyonu, sadece izole edilmiş, alt-mikroskopik lipit yapıların (Şekil 4A) oluşturulmuştur, ortaya koymuştur. SALB prosedüründe kullanılan lipid konsantrasyonunun arttırılması ile de lipit yapıların floresans yoğunluğu daha homojen hale geldi. Yapıların, tüm f katedecek yoktu, ancak 0.1 mg / ml lipid konsantrasyon olarak, mikroskopik lipid yamalar vardıbakış ield (Şekil 4B). 0.25 mg / ml lipid konsantrasyon kullanılmıştır, ancak, homojen bir lipid iki katmanlı (Şekil 4C) oluşmuştur. Bu nedenle bir tam tam kapsayan SLB oluşturmak için gereken minimum lipid konsantrasyonu vardır.

SALB deneyler nihai sonucu lipid konsantrasyonunun etkisi de daha geniş bir lipid konsantrasyonu aralığı (0,01-5 mg / ml) ve çeşitli organik çözücüler içinde (izopropanol, etanol, ve n-propanol) üzerinde incelenmiştir. Δ f SALB prosedürüne son aşamasından gelen Δ D değerleri, Şekil 5'te sunulmaktadır.

Biz sırasıyla -25 ve -30 Hz ve daha az 0.5 x 10 -6 arasında frekans ve enerji yayılımı son değişikliklere göre iki tabakalı oluşumunu tanımladı. Bu kriterlere dayanarak, optimal lipid konsantrasyon aralığı desteklenen bir lipid iki katmanlı 0.1 ve 0.5 mg arasında olduğu saptanmıştır oluşturulması için/ ml organik çözücü tipi büyük ölçüde bağımsız. Elde Δ f ve Δ D sapmalar dışında yukarıda belirtilen aralığın kayar kütlesini (örneğin, iki-tabaka yığınları), non-iki katmanlı morfolojileri oluşumu (örneğin, veziküller, solucan benzeri miseller) varlığı nedeniyle, ve alt tabaka üzerinde eksik morfolojisi ile parçalanmış iki katmanlı adaların varlığı.

Elde edilen desteklenen lipid çift tabakaları için SALB prosedürü nispeten sağlam iken, yüksek kaliteli bir şekilde iki katmanlı oluşum için optimal lipid konsantrasyonu spesifik deneysel konfigürasyonuna bağlı olarak ayarlama gerektirebilir. Temel olarak, en az lipid konsantrasyonu, aynı zamanda SALB yöntemi ile uygun şekilde iki katmanlı oluşum için gerekli olan maksimum lipid konsantrasyonu, sadece vardır. Optimal konsantrasyon aralığı, akış hızına bağlıdır ve aynı zamanda alt-tabaka ve lipid bileşimi ile etkilenebilir olabilir. Ampirik olarak, pek çok durumda, f varound 0,5 mg / ml ile 100 ul'lik bir akış oranında, bir lipid konsantrasyonunda olduğu / dakika homojen desteklenen lipid tabakasının oluşumu için koşullar uygun bir kümesidir. Ancak, lipit kompozisyonu ve akış hücre geometrisi-ikincisi bağlı olan gerekli olabilir lipit konsantrasyonuna çözücü döviz ileri optimizasyon sırasında akış profili etkiler. Böylece, QCM-D veya floresan mikroskopi teknikleri kullanılarak iki katmanlı kalite için bir 0.5 mg / ml lipid konsantrasyon kullanılarak ve değerlendirmek Pilot SALB deneyler önerilir. Bilayers eksik görünüyorsa tatminkar sonuçlar elde edilinceye kadar, sonra lipid konsantrasyonu% 10 artışlarla arttırılmalıdır. Iki tabakalı lipit yapıları, ek ile birlikte var görünüyorsa tatminkar sonuçlar elde edilinceye kadar, sonra lipid konsantrasyonu% 10 artışlarla azaltılmalıdır.

Çeşitli lipid kompozisyonlar ve d desteklenen lipit bilayers imalatıifferent kolesterin fraksiyonlarını.

Daha sonra, SALB VF yöntemleri, kolesterol ile zenginleştirilmiş SLBs oluşturmak üzere kullanılmıştır. 6 SALB yöntem yolu ile hazırlandı, kolesterol içeren bir taşıyıcı membranlar temsili floresan görüntüleri (100 x 100 um) göstermektedir. Membranlar homojen floresan parlaklık özelliği sürekli bir faz ile çevrili dairesel şekilli boya hariç etki oluşur. Koyu etki ön-madde lipid karışımı kolesterol oranının artırılması ile alan artmıştır. Daha sonra, sıkı bağlamak Ölçümler lipid iki katmanlı filmlerin akışkanlığının incelemek için yapıldı. Sıkı bağlamak ölçümleri yanal lipidlerin hareketlilik ve tek çift katlı lipid böylece oluşumu gösteren, çevredeki aşamasında neredeyse tamamen floresan kurtarma saptandı. Tercihen sıvı faza Rh-PE bölümleri için, koyu renkli etki muhtemelen yoğun kolesterol bakımından zenginleştirilmiş yapılar oluşur. Karşılaştırma için, VF yöntemini kullanarak DOPC / Kol bilayers imalatı da denendi. Vezikül ekstrüzyon yöntemi ile hazırlanmıştır - (40 mol% 'si 10) DOPC kolesterin fraksiyonlarını artan vezikülleri. Rh-PE lipid (% 0.5 ağırlık) görüntüleme için floresan etiket olarak kullanılmıştır. 7 kolesterol içeren veziküller cam substratların inkübasyon üzerine oluşturulan yapılar için temsili floresan görüntüleri (100 x 100 um) göstermektedir. FRAP analizi% 20 mol ya da daha az bulunan kol veziküller kullanarak akıcı bir lipid tabakasının oluşumunu gösterdi. Ancak, örnekler adsorbe ancak Unrüptüre veziküllerin varlığını gösteren, iyileşme gözlenmemiştir yüksek kolesterol fraksiyonları ile veziküllerin kullanılarak hazırlanabilir.

Sonuçta desteklenen lipid çift tabakaları içine dahil edilmiştir kolesterol fraksiyon ön-madde dudak dahil edilmiş kolesterol fraksiyonunun bir fonksiyonu olarak nicelleştirilmiştirSALB yönteminde ve VF yöntemde, sulu çözelti içinde veziküllerinde organik çözücü içinde id karışımı ile gerçekleştirilmektedir. QCM-D teknik kullanılarak iki katmanlı oluşum gözlenmiş ve MβCD özellikle desteklenen lipid çift tabakaları 32 kol elde etmek için ilave edildi. SLB ile ilişkili (| | Δ f) nedeniyle kolesterol kaldırılması kütle kaybı frekans kayması mutlak değer olarak bir azalmaya yol açtı. MβCD muamele aşamasından kaynaklanan bağıl pozitif ötelemeri Şekil 8A'da gösterilmiştir. Şekil 8B'de gösterildiği gibi kolesterol mol fraksiyonu, frekans kayması ile hesaplanmıştır.

SALB yöntemi ile üretilmiş olan lipid çift tabakaları içine dahil, kolesterol ön madde fraksiyonu lipid karışımı kolesterol içeriği neredeyse doğrusal olarak orantılıdır. İlginç bir şekilde, VF yöntemle hazırlanabilir ikili tabakalar kolesterol fraksiyonu (vezikülleri içeren% 20 mol Chol) ön-madde veziküller içerdiği önemli ölçüde daha düşük olmuştur. Aslında, VF yöntem ile elde edilen kolesterol yüksek fraksiyon yaklaşık 10 mol% 'si olmuştur.

Kolesterol, fosfolipid β-iki fazlı birlikte varlığı bölgede şerit üstyapı Gözlem çift katlı lipit katmanını destekledi.

SALB deneyleri daha kolesterol daha yüksek bir fraksiyonuna sahip bir lipid karışımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 4 olduğunda: DOPC ve kolesterol karışımı 6 kullanıldı, aynı anda oluşmuş iki evreye düzgün bir sıvı fazdan oluşan bir kademeli karışmanın bozulması koyu (boya hariç) bir arka plan üzerinde, parlak şerit biçimli etki alanları olarak görselleştirildi (Şekil 9) gözlenmiştir. Bu Rh-PE kolesterolden zengin etki 33, ve dolayısıyla arka plan olarak ortaya çıkan baskın koyu etki alanlarından kolesterol bakımından zengin bölgelerdir hariç olduğu bilinmektedir. Karanlık bir arka plan üzerinde mikron büyüklüğünde, parlak alanların oluşumu hiGH kolesterol fraksiyonu (>% 50 mol) kolesterol / fosfolipid karışımları 34,35 tek tabakalı faz diyagramı β bölge ile tutarlıdır. Ayrıca, zayıf hat geriliminden kaynaklanan şerit etki, oluşumu, karışım, bir karışabilirlik kritik nokta civarında olduğunu göstermektedir.

figür 1
Epifloresans mikroskobu için uygun bir konfigürasyonda SALB formasyonu için Şekil 1. mikroakışkan bölmesi (A). Ticari mikroakışkan odası, (B), bölmenin yapışkan tarafı üzerine tutturulmuş cam lamel (C) içine bağlanan boru ile bir mikroskop tutucu üzerine tam ayar odasının giriş ve çıkış bağlantı noktaları ve (D) Peristaltik pompa çözücü değişimine oranını kontrol etmek için kullanılır. Izopropanol içinde çözüldü lipidler ölçüm odacıklı içine enjekte edilirer peristaltik pompa yardımıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Silikon dioksit ve altın yüzeylerde vezikül füzyonu ve SALB deneyler Şekil 2. QCM-D analizi. QCM-D frekansı (kadar taşınmış, mavi) ve dağılımı üçüncü aşırı ton için (ΔD, kırmızı) cevaplar (n = 3) olarak kaydedilmiştir Lipid adsorpsiyon (A ve C) silikon dioksit, (B ve D) bir altın sırasında zaman fonksiyonu. Paneller a ve b vezikül füzyon yöntem mevcut. DOPC lipid vezikülleri (1 ok) t = 10 dk enjekte edilmiştir. C ve D panelleri SALB oluşumu yöntemine karşılık gelir. Oklar tampon maddesi (1), izopropanol, izopropanol (2), yağ karışımı, [0,5 mg / ml lipid DOPC enjeksiyonunu gösterir; (3)] ​​ve devetüyüer değişimi (4). Panel B, çizgili eğirinin lipid enjekte verildiği bir kontrol deneyinde karşılık gelir. Her yüzey için mesafe kadar taşınmış ve ΔD nihai değerleri belirlenir. Nihai sıklığı ve dağılımı kaymaları anlaşılacağı şekilde şemadaki önerilen monte lipit yapıları göstermektedir. Referans 24 uyarlanmıştır ve Amerikan Kimya Derneği izni ile kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
SALB oluşum sürecine çözücü kur 3. Etkisi Şekil. SALB yönteminde QCM-D frekans ötelemesi (kadar taşınmış) son aşamada karşılık gelen (Şekil 2C ok 4) iki farklı döviz kuru, 100 ve 600 ul / dakika, u silikon dioksit üzerinde ölçülmüştür şarkı (A), 0.5 mg / ml ve izopropanol içinde (B) 0,125 mg / ml lipid DOPC. Sulu tampon çözeltisi içinde ölçüm temel değere göre nihai kadar taşınmış değerleri de, belirtilir. Referans 24 uyarlanmıştır ve Amerikan Kimya Derneği izni ile kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Tam SALB formasyonu için lipid Konsantrasyon Şekil 4. Eşik (A) 0,05 mg / ml kullanarak SALB hazırlanan silikon dioksit lipid tabakaları Epifloresans mikroskopi.; (B) 0.1 mg / ml; ve (C) 0.25 mg / ml lipid konsantrasyon. Referans 26 uyarlanmıştır ve Amerikan Kimya Derneği izni ile kullanılır./files/ftp_upload/53073/53073fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
SALB yöntemi ile lipit konsantrasyonu ve desteklenen lipid iki katmanlı oluşum organik çözücünün Şekil 5. etkisi. QCM-D son değişiklikleri (A), frekans ve lipit bir fonksiyonu olarak çeşitli organik çözücüler kullanılarak SALB deneyleri için (B), enerji kaybı, konsantrasyonu. Kesik yeşil çizgiler tam bir çift-katlı (-30 Hz <mesafe kadar taşınmış <-25 Hz ve ΔD <1 x 10 -6) için beklenen frekans ve dağıtma vardiya karşılık gelir. Referans 26 uyarlanmıştır ve Amerikan Kimya Derneği izni ile kullanılır. Bu fi büyük halini görmek için tıklayınızşekil.

Şekil 6,
Bir cam substrat üzerinde SALB yöntemle hazırlanabilir kolesterol fraksiyonların farklı desteklenmiş lipid iki katmanlı analizi ışıkla ağartma sonra Şekil 6. Floresan kazanımı. Ikili katmandan (AE) Floresans mikrograflar ön-karışım içerisinde farklı kolesterin fraksiyonlarını kullanılarak hazırlandı. Fotoğraflar ışıkla ağartma hemen sonra (üst) ve 1 dak (orta) kaydedildi. Görüntü merkezi karanlık nokta photobleached bölgeye karşılık gelir. Ölçek çubukları 20 um vardır. Her bir numune içindeki bireysel boya dışlanan alanların yüzey alanı histogramlar da (alt) sunulmuştur. Referans 36 uyarlanmıştır ve Amerikan Kimya Derneği izni ile kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Vezikül füzyon metodu ile hazırlanan kolesterol içeren desteklenen iki katmanlı 7. FRAP analizi Şekil. Iki katmanlı (AD) Floresans mikrografları ön-madde veziküllerinde çeşitli kolesterin fraksiyonlarını (10 ila 40 mol%) kullanılarak hazırlandı. Fotoğraflar ışıkla ağartma hemen sonra (üst) ve 1 dak (alt) kaydedildi. Görüntü merkezi karanlık nokta photobleached bölgeye karşılık gelir. Ölçek çubukları 20 um vardır. Referans 36 uyarlanmıştır ve Amerikan Kimya Derneği izni ile kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8
Şekil 8. QuDesteklenen lipid çift tabakaları kolesterol fraksiyonunun antification. (A) (0 50 mol% arasında) ön-madde karışımı içinde kolesterol mol fraksiyonlarını değişen desteklenmiş lipid çift tabakaları üzerine 1 mM MβCD enjeksiyonu üzerine pozitif QCM-D frekans kayması. (B) ön-madde karışımları veya veziküller kolesterol fraksiyonunun bir fonksiyonu olarak SALB ve vezikül füzyon yöntemlerle hazırlanabilir ikili tabakalar tükenmiş kolesterol mol oranında. Referans 36 uyarlanmıştır ve Amerikan Kimya Derneği izni ile kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 9
6 molar oranı conta: DOPC / Kol (4 desteklenen bir iki tabakalı floresan mikroyapı Şekil 9. Zamana bağlı evrimSALB yöntemle hazırlanabilir% 0.5 Rhodamine-PE) düzeyine getirildi. tek tip bir fazın özgül ağırlığı kademeli faz Tam çözücü değişmesini var üzerine bir sıvı-sıvı bir arada bulunma bölgesi içine ayrılır. Referans 37 uyarlanmıştır ve Amerikan Kimya Derneği izni ile kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bu çalışmada, bir çözücü-değişimi protokolü, bir katı destek ile inkübe edilir alkol (izopropanol, etanol veya n-propanol), hangi lipidler içinde sunulmaktadır ve daha sonra alkol, bir dizi kumanda etmek üzere, sulu bir tampon solüsyonu ile yavaş yavaş değiştirilir Faz geçişleri sonunda katmanlı fazlı çift katlı lipit katmanını 24 üreten. Bu yöntem, vezikül füzyon yöntemine dirençli olan altın gibi yüzeyler üzerinde desteklenen lipid iki katmanlı imalatım mümkün olduğu gösterilmiştir.

Optimal bir lipid konsantrasyonu aralığı (0,1-0,5 mg / ml) Şimdiye kadar test edilen standart deneysel biçimleri tam çift katlı bir oluşum için tespit edilmiştir. Iki katmanlı 0.1 mg / ml arasında, ayrı ayrı, mikroskopik yamalar aşağıdaki lipit konsantrasyonlarında kurdu. Diğer taraftan, 0.1 mg / ml'nin üzerindeki konsantrasyonlarda ve daha az daha 0,5 mg / ml, tam ve düzgün bir iki katmanlı oluşturulmaktadır. Bu aralığın üstüne lipit konsantrasyonlarında, iki katmanlı bir sıvı hala doğrulanmadan olarak elde edildiFRAP analizi ile ed Ancak, floresan mikroskobu çift katmanı üstüne ilave lipit yapıların varlığını gösterir. QCM-D analizi ile belirlendiği gibi, çarpıcı bir biçimde, bu ek de lipit yapıların morfolojisi, inkübasyon kademesi sırasında kullanılan alkolün bağlıydı. Etanol olması durumunda, nispeten yüksek Δ F ve Δ D kaymalar bir adsorbe vezikül tabakası için elde edilen QCM-D imza benzer. Izopropanol ya da n-propanol yerine kullanıldığı zaman Δ D kayda değer ölçüde daha yüksek iken, Δ f bir iki katmanlı (-30 Hz -40 arasında nihai Δ f) için tahmin edilen değerden biraz daha yüksek olmuştur. Bu tür QCM-D yanıtları (bazı durumlarda flüoresans mikroskopi ile görünür gibi) membran yüzeyinden dışarı doğru çıkıntı yapan uzun bir lipit yapıların (örneğin, solucan benzeri miseller) için beklenir.

Çözücü değişimine oranı espec, kritik öneme sahip bir başka önemli parametredirAlt lipid konsantrasyonları (örneğin, 0,1 mg / ml) kullanılmıştır selülazlar olduğunda. Düşük lipid konsantrasyonunda hızlı solvent alış veriş eksik çift tabakaların oluşmasına yol açar. Bu yazıda QCM-D ölçümlerinin (Q-Sense E4 ölçüm odası), yaklaşık 100 ul / dk akış oranları için kullanılan standart ölçüm odasında, yüksek tekrarlanabilir tam iki katmanlı oluşumuna uygun idi. Diğer geometriler ve hacim ile akış hücreleri için, uygun bir akış hızı değişebilir ve ampirik olarak burada önerilen adımları göre belirlenmelidir.

Vezikül füzyon dirençli olan yüzeyler üzerinde desteklenen lipid ikili katlar oluşturacak ek olarak, SALB böylece kompleks bileşimleri ile desteklenen zarların imalat kapı açma, yırtılabilir lipid vezikülleri için ihtiyaç aşmak için kullanılabilir. Açıklayıcı bir örnek, bir bileşim olarak, kolesterol, yüksek fraksiyonlu lipit karışımları incelenmiştir. Kolesterol memeli konakçının önemli bir bileşenidiralian hücre zarları ve onun fraksiyonu (eritrositler içinde, örneğin) membran lipid bileşiminin 45-50 mol% yaklaşım olabilir. Bu durumda, bir insan hücre zarı temsil eden bir çift katlı lipid bile basit bir model kolesterol içermelidir.

Vezikül füzyon sadece% 10-15 kolesterol ihtiva eden akışkan bir lipid ikili tabakaları imal etmek için kullanılabilir ise 36 (QCM-D ölçümleri sayıya dökülmüş olarak 57% mol kadar), SALB yöntemi yüksek kolesterol içeren fraksiyonlar akışkan lipid iki katmanlı oluşum sağlamaktadır. Kolesterol seviyesi daha (63 mol kadar%) yükselmiş, ancak, şerit şeklinde alanları 37 gözlendi. Yandaş etki hava-su arayüzünde kolesterol / fosfolipidler tek tabaka faz diyagramı β bölgede gözlenen anımsatan sıvı vardı.

Genel olarak, SALB yöntemi özellikle, desteklenen lipid ikili katlar oluşturacak için basit ve verimli bir yaklaşım olduğu gösterilmiştirGeleneksel vezikül füzyon yöntemi kapsamı dışındadır n olgu. Şu ana kadar, QCM-D tekniği ve floresan mikroskobu esas SALB metodu ile oluşturulmuş desteklenen lipit katmanlarını karakterize etmek için kullanıldı. İleriye yönelik olarak, yüzey plasmon rezonansı (SPR) 38, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) 39,40 olmak üzere yüzey duyarlı analitik ölçümler teknikleri, geniş bir yelpazede, kızılötesi spektroskopi 41 Fourier-dönüşümü, X-ışını 42 ve nötron yansıtma 43 can, Daha fazla karakterize ve basit ve karmaşık iki katmanlı yapılandırmaları SALB yöntemiyle hazırlamak incelemek için kullanılabilir. Bunlar gelişmekte olan yetenekleri basit ve sağlam deneysel protokol yararlanarak yapay hücre zarlarını keşfedebilirsiniz bilim adamlarının daha fazla sayıda kapıyı açın.

Acknowledgments

Yazarlar NJC Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK -NRFF2011-01 ve NRF2015NRF-POC0001-19), Ulusal Medikal Araştırma Konseyi (NMRC / CBRG / / 2012 0005) ve Nanyang Technological University gelen destek için teşekkürlerimizi sunarız

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QCM-D silicon dioxide-coated substrates QSense AB,  Sweden
QCM-D gold-coated substrates QSense AB,  Sweden
Q-Sense E4 module QSense AB,  Sweden
Plasma Cleaner, PDC-32G Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-001 (115V) 
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) Avanti Polar Lipids 810150P
cholesterol Avanti Polar Lipids 700000P
Methyl-β-cyclodextrin Sigma  C4555
Isopropanol Sigma  673773
Ethanol Sigma  459844
n-propanol Sigma  279544
Sticky-Slide I 0.1 Luer IBIDI 81128
Male elbow 1/8” Cole-Parmer 30505-70
Silicon tubing 1.6 mm ID IBIDI 10842
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm IBIDI 10812
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump Ismatec
Sodium dodecyl sulfate Sigma  71725

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sackmann, E. Supported membranes: Scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
  2. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry. Science. 313, 1948-1951 (2006).
  3. Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy. Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).
  4. Bally, M., et al. Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers. Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).
  5. Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis. Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).
  6. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication. Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.
  7. Mager, M. D., Melosh, N. A. Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse. Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).
  8. Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns. Small. 3, 71-75 (2007).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).
  11. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers. Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).
  12. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).
  13. Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  14. Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration. Thin Solid Films. 495-4246 (2006).
  15. Stanglmaier, S., et al. Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).
  16. Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports. Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).
  17. Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material. Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).
  18. Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2. Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).
  19. Hardy, G. J., et al. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).
  20. Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica. European Biophysics Journal. 1-10 (2014).
  21. Coutable, A., et al. Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression. Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).
  22. Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers. The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).
  23. Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment. Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).
  24. Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold. Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).
  25. Hohner, A., David, M., Rädlera, J. Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces. Biointerphases. 5, 1-8 (2010).
  26. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes. Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).
  27. Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation. Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. (2015).
  28. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer. Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  29. Keller, C., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
  30. Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).
  31. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).
  32. Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).
  33. Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer. Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).
  34. Okonogi, T., McConnell, H. Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers. Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).
  35. McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. Condensed complexes of cholesterol and phospholipids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).
  36. Tabaei, S. R., et al. Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly. Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).
  37. Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes. Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).
  38. Salamon, Z., Wang, Y., Tollin, G., Macleod, H. A. Assembly and molecular organization of self-assembled lipid bilayers on solid substrates monitored by surface plasmon resonance spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1195-11267 (1994).
  39. Yuan, C., Johnston, L. Phase evolution in cholesterol/DPPC monolayers: atomic force microscopy and near field scanning optical microscopy studies. Journal of microscopy. 205, 136-146 (2002).
  40. Schneider, J., Dufrêne, Y. F., Barger, W. R. Jr, Lee, G. U. Atomic force microscope image contrast mechanisms on supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 79, 1107-1118 (2000).
  41. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Quarterly reviews of biophysics. 30, 365-429 (1997).
  42. Miller, C. E., Majewski, J., Gog, T., Kuhl, T. L. Characterization of biological thin films at the solid-liquid interface by X-ray reflectivity. Physical Review Letters. 94, 238104 (2005).
  43. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, 1343-1350 (1996).
Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).More

Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, M., Yorulmaz, S., Vafaei, S., Cho, N. J. Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method. J. Vis. Exp. (106), e53073, doi:10.3791/53073 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter