Introduction
Det overordnede formål med denne prosedyren er den raske kvantifisering av energistatusen for C. elegans in vivo med tanke på å bruke dette som et endepunkt i forbindelse screening. Begrunnelsen er basert på den transgene uttrykk for ildflueluciferase i nematode C. elegans 1-3 via plasmidet pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). Luciferase-enzymet er fusjonert til grønt fluorescerende protein GFP og uttrykkes konstitutivt og overalt i cytoplasma (luciferase peroksisomal rettet signal ble fjernet). Dette fører til lysemisjon når substratet luciferin tilveiebringes eksogent. Som ormen er gjennomsiktig, kan lyset måles i et luminometer som relative lysenheter (RLU). Cellular ATP brensel Bioluminescens reaksjon og dens tilgjengelighet bestemmer lysnivåer produsert. Derfor luminometry tilbyr en convenient betyr å vurdere relative ATP nivåer og i forlengelsen av mitokondrienes funksjon, siden ATP produksjon forekommer hovedsakelig i mitokondriene. En kobling mellom mitokondrienes funksjon og Bioluminescens nivåer har vært vist tidligere gjennom stanse av mitokondrielle elektrontransportkjeden gener og samtidig redusert lysutbytte. 1
Bioluminescens stammer genererte ble utpekt PE254 (feIs4) og PE255 (feIs5) 1 (se liste materiale), og kan brukes om hverandre. 3. En rekke studier har utnyttet disse sensor påkjenningene utrede cellulære ATP-nivåer in vivo etter eksponering for ulike xenobiotiske kjemikalier slik som natriumazid 1, kadmium 2, kloakk slam ekstrakt 3, 5'-fluor-2-deoksyuridin 6, og en tobakk-spesifikke nitrosamin 7. Stammene har også vært nyttig å overvåke effekter av eksponering for ultrafiolett C stråling
Protokollen gir mulighet for in vivo overvåkning av energinivåene (i motsetning til mer teknisk arbeidskrevende in vitro bestemmelser ATP) som muliggjør forbindelse screening og reposisjonering i fysiologisk sammenheng med en hel multicellular organisme. Prosedyren kan utvides til en rekke genetiske bakgrunn av krysset kromosomer integrert transgenet inn i butikken mutantstammer og / eller ved å stanse gener ved RNA interferens; dermed ta full nytte av C. elegans som modellorganisme. Metoden skal bidra til å redusere sen fase svikt i legemiddelkandidater skyldes mitokondrietoksisitet og gi et bidrag til reduksjon av høyere dyreforsøk.
Protocol
MERK: Utfør alle trinnene under sterile forhold (laminær kabinett) og med pre-sterilisert materialer (etter autoklave 126 ° C, 11 min). En LB plate med stripete ut E. coli OP50 ble holdt ved 4 ° C er nødvendig, strek ut mot fersk LB-plater og restreak hver måned.
1. Bakteriell Food (Escherichia coli OP50) Forberedelse
- Dag 1. Inokuler 2 x 5 ml LB i to universelle flasker med en enkelt koloni av E. coli OP50 og plasser i risteinkubator ved 37 ° C (220 rpm) i 8 timer.
- Etter 8 timers inkubasjon bruke 2 ml E. coli OP50 LB kultur for å inokulere hver av 3 x 200 ml LB. Plasser kolber i rysteinkubator (220 opm) O / N (17 timer) ved 37 ° C.
- Vei 20 x 50 ml sentrifugerør og skrive vekt på røret.
- Dag 2. Bruk en serologisk pipette, delmengde 30 ml O / N E. coli OP50 kulturen i den på forhånd veide sentrifugerør. Sentrifuger ved 7,741 xg, 10 ° C, 8 min.
- Dekanter nøye supernatanten, holde røret invertert med lokk på og la det stå i flere minutter. Ved hjelp av en pipette fjerne eventuelt overskudd supernatant som kan ha samlet seg i lokket. Vei røret og beregne vekten av pelleten.
- Beregne volumet nødvendig for å gi en suspensjon på 30 g / l og merke dette volumet på røret. Dato, label og plassere rør ved -20 ° C til bruk i løpet av 1-3 måneder, eller ved - 80 ° C om lagring i mer enn 3 måneder.
- Forbered bakteriell suspensjon for voksende nematoder; tillate bakteriepelleten å tine opp og legge nødvendige volumet av S komplett medium 11,12 til hvert rør, vortex forsiktig å resuspendere pellets, til basseng innholdet i forskjellige rør innhente nødvendig volum. Arbeide under sterile forhold.
2. Utarbeidelse av narkotika Standards i en 96-brønns plate Format
MERK: Hvis du bruker et legemiddel bibliotek, er narkotika plater gitt på en enkeltKonsentrasjonen av forbindelsen i DMSO. Primær screening vil teste forbindelser i en enkel konsentrasjon. Instruksjoner følger for utarbeidelse av narkotika plate for bekreftende forbindelse testing på en rekke konsentrasjoner mellom 0-160 mikrometer, valgt etter statistisk signifikans på 10 mikrometer. Trinnene nedenfor kan tilpasses til å teste andre konsentrasjoner.
FORSIKTIG! Følg nødvendige forholdsregler for håndtering av legemidler (generelt ansiktsmaske, vernebriller, hansker er nødvendig).
- Forbered medikament plate med arbeids standarder for bekreftende screening: veie den nødvendige mengde av forbindelse i sterilt 1,7 ml mikrosentrifugerør, og fremstille 16 mM forbindelsen i DMSO (for eksempel 100 x konsentrert i forhold til den ønskede toppkonsentrasjonen for eksponering).
- Serielt fortynnet 16 mM stock 1: 2 i DMSO for å oppnå 8, 4, 2, 1, 0,5 og 0,25 mM standarder (sterile betingelser). Disse er 100x konsentrert og vil bli fortynnet ned til sluttkonsentrasjoner på 0 (bærer),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 og 160 um (i 1% DMSO) under legemiddeleksponering.
- I en laminær strømningsskap, plasserer 20-50 ul pr brønn av sammensatte standarder innenfor en kolonne av en 96-brønns plate, for eksempel plate stilling A1: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mm, F1: 0,5 mm, G1: 0,25 mm narkotika og H1: DMSO. Bruk ulike kolonner for fortynningsserie av ulike rusmidler.
- Alikvot kjøretøy til brønnene i kolonne 12 i medikamentplate.
MERK: Dette vil legge til rette for testing av kjøretøy kontroll ned kolonner i tillegg til testing sammen rad H, slik at kjøretøyet er testet i stillinger representativ for hele platen.
MERK: Hver narkotika plate for bekreftende screening holder fortynningsserier for maksimalt 11 ulike medikamenter for å bli testet pluss bilen kontroll. - Etikett og tetning plate, dekk med folie og legg ved -20 ° C inntil nødvendig.
3. nematode Eksperimenter
MERK: Utfør alle trinn under sterile forhold, aseptisk og med forhånds sterilisert materialer og reagenser. Oppretthold C. elegans stammer rutinemessig på NGM plater med E. coli OP50. 12 foreslåtte timings for de ulike protokoll trinnene er gitt i tabell 1.
- Dag 1 oppgave: sette opp væske kultur av biosensor belastning for påfølgende synkronisering.
- Ta opp nematoder fra ett 6 cm NGM plate (med massevis av unge larver der mat har bare kjørt) i 2 ml S komplett og overføre til kolbe med 30 g / L E. OP50 coli i komplett S (totalt volum 30 ml i en 250 ml kapasitet konisk glasskolbe). Inkuber 3 dager ved 20 ° C, 160 rpm.
- Dag 4 oppgave (tillate ca 30-35 min): blekemiddel kultur for å høste egg og synkronisere ormen befolkningen. Utføre alle sentrifugeringstrinn for 1 min, 600 x g.
- Forbered blekemiddel løsning like før bruk: til hver 16 ml 0,156 M KOH / NaOH legge 4 ml blekemiddel.
- Hell 2 x 14 mlorm kultur i 15 ml koniske sentrifugeringsrør. Tillat ormer å bosette av tyngdekraften (3 min). Fjern og kast flytende over avgjort nematoder. Tilsett 5 ml blekeløsning til hvert rør og start tidtakeren. Kombiner volumer i en tube.
- Snu røret forsiktig i 2 min, sjekk under stereoskop for å bryte av ormer og utgivelsen av egg i suspensjon. Når de fleste eggene er utgitt eller på en maksimal tid på 2 min i blekemiddel, sentrifuger.
- Fjern supernatanten forsiktig. Vask 1x pellet med 14 ml S komplett og sentrifuge.
- Kast supernatant, tilsett 10 ml blekemiddel og starte timeren (dette andre bleike trinnet sikrer at de fleste av ormen skrotter i oppløsning og er ikke lenger sees under stereoskop). Etter en maksimal tid på bleke oppløsning av 2 minutter, sentrifuger.
- Vask pelleten 3x i S fullført, forsiktig dekanter supernatanten og resuspender pelleten i 14 ml S fullført etter hver sentrifugering. Etter siste vask, resuspender egg pellet i 14 ml S-complete.
- Overfør volumet til en konisk glasskolbe. Inkuber 18-24 timer ved 20 ° C, 160 rpm.
MERK: Høstes eggene vil klekke O / N og arrestere utvikling ved første larvestadium (L1) på grunn av mangel på mat, derav de vil alle være på samme stadium av vekst.
- Dag 5 oppgave: sette opp synkroniserte snekke kulturer for narkotikaanalyser.
MERK: Worms opphengt i sult medium tendens til å overholde hydrofobe plastoverflater som pipetter og rør. 0,01% tween-20 er et overflateaktivt middel som brukes her for å gjøre plastoverflater mer hydrofil, og gi større nøyaktighet ved telling (0,01% Triton-X100 kan også brukes). Når nematoder er i bakteriell supplert medium, har de ikke pleier å holde seg til plast.- Bestem antall klekket L1 er i kolben, holde kolben på risting plattform (160 rpm).
- Ta 3x 100 ul prøver fra kolbe (bruk en ren spiss hver gang) i separate 1,7 ml mikrorør med 900 mikroliter væske medium 0,01% Tween-20.
MERK: Aspire 100 mL prøve til ren spiss bare én gang. Så når utlevering, pipette opp og ned et par ganger i det tween supplert medium for å slippe noen ormer man følger til spissen. - Telle nematoder i 4x 10 pl dråper fra hvert tre eksemplarer fortynning tube. Beregne gjennomsnittsverdien, og beregne antall ormer som er tilstede i den kjegleformede glasskolbe.
- Ta 3x 100 ul prøver fra kolbe (bruk en ren spiss hver gang) i separate 1,7 ml mikrorør med 900 mikroliter væske medium 0,01% Tween-20.
- Beregne volumet av klekket nematode suspensjon som kreves for å sette opp en 2 x 20 ml kultur med 10 nematoder per 10 pl. Øk beregnede volumet med 10% til ansvar for noen påfølgende nematode tap under sentrifugeringstrinn.
- Dekanter volumet som kreves i 2 x 15 ml sentrifugeringsrør (pre-veid). Veie rør for å oppnå faktiske volumet utlevert, vortex forsiktig og justere for å målrette volumet ved å fjerne overflødig volum med en 5 ml pipette (kun det sterile spissen bør gå inn i røret).
- Fyll opp volumet til 14 ml med ferske S komplett med varh nematoder. Sentrifuge (1 min, 600 g). Fjern og kast supernatanten med forsiktighet for ikke å forstyrre den nematode pellet.
- Tilsett 5 ml S komplett med 30 g / l E. coli OP50 til pellets nematoder. Overfør 5 ml i hvert rør til et konisk glasskolbe inneholdende 15 ml S komplett med 30 g / l E. coli OP50. Skriv ned tids nematoder ble først gitt med mat.
- Rist flasken forsiktig (160 rpm), ta 9 x 10 pl dråper på mikroskopiske lysbilder (bruker ferske tips hver gang) å telle nematoder og bekrefte gjennomsnitt på ca 10 (± 2) per 10 pl.
- Plasser nematode kolber i risteinkubator ved 20 ° C, 160 opm i 42-44 timer.
- Bestem antall klekket L1 er i kolben, holde kolben på risting plattform (160 rpm).
- Dag 7 oppgave: overføre nematoder til 96-brønners plater og initiere legemiddeleksponering.
- Kombiner nematode kulturer i en enkelt flaske, holde virvlende kolben forsiktig og plasser 3 x 4 ml nematode kultur i en 60 ml steril trau. Plasser trau på en risting plattform (160 rpm).
- Bruk 8 channel pipette til delmengde 25 mL suspendert nematoder per brønn av 96 godt sorte mikrotiterplater med en flat gjennomsiktig bunn (for å ta både luminescens og fluorescens avlesninger, eller hvite plater for luminescens only). Dekk med plate lokk og sett til side.
- Etter å ha satt opp av hver 2 plater, legger ytterligere 2 x 2,5 ml nematoder i trau for å erstatte tapt volum (holde en "død volum" i bunnen på ca 7 ml).
- Sett opp 13/14 plater med nematoder. 11 nematode plater vil være nødvendig å teste to 96-brønners narkotika plater. 12. nematode plate vil bli lastet utelukkende med bærer som kontroll. Den 13. Platen vil bli brukt til å etablere bakgrunnsfluorescens på dag 8 (se nedenfor). En ekstra plate kan være forberedt på bruk bør feilene oppstår under satt opp.
- Aliquot 74 ul S komp til hver brønn og platen sted i et fuktig kammer (se liste materiale) i en rysteinkubator (20 ° C, 160 rpm) until klar til delmengde testforbindelser ved forhåndsvalgt utviklings tid (f.eks 45 timer 30 min etter mat følger med). [Volume per brønn er nå 99 ul].
- Tine opp stoffet plate (r) til test.
- Bruk multikanalspipette å sette opp nematode plater med narkotika, endre tips hver gang. Tillat 5 min per 96 brønners plate for alikvoteringsprosessen narkotika.
- Ta 1 mL fra 1. kolonne av narkotika plate og legge til kolonner 1-5 av en plate som inneholder nematoder; gjenta fra 2. spalte i stoffet platen i kolonner 8-12 i platen inneholdende nematoder. Legg 1 mL av kjøretøyet for å kolonner 6 og 7 i nematode plate.
NB: Det totale volum per brønn i nematode plate vil være 100 ul resulterer i en 1: 100 fortynning av forbindelse / kjøretøy. - Gjenta fremgangsmåten ved tilsetning av 1 pl av 3 rd / 4-te kolonne av medikamentet platen til kolonnene 1-5 / 8-12 fra den andre nematode plate; legge til kjøretøyet for å kolonner 6 og 7 i nematode plate.
- Fortsette å teste gjenværende legemiddel plate kolonner. Sett opp minimum en nematode plate med kjøretøy i alle brønnene ved prøvetaking fra kolonne 12 av narkotika plate. Plasser platene tilbake i fuktige kamre i risteinkubator (20 ° C, 160 rpm) for 20-22 timer (se note for dag 8).
- Ta 1 mL fra 1. kolonne av narkotika plate og legge til kolonner 1-5 av en plate som inneholder nematoder; gjenta fra 2. spalte i stoffet platen i kolonner 8-12 i platen inneholdende nematoder. Legg 1 mL av kjøretøyet for å kolonner 6 og 7 i nematode plate.
- Part-forberede luminescens buffer for neste dag: legg DMSO og 10% Triton-X-100 til det nødvendige volumet av S fullstendig for å oppnå 1% DMSO og 0,15% Triton X-100. Tillat 5 ml per plate lese for luminescens, pluss 1 ml for grunning luminometer injektor.
- Dag 8 oppgaven: Les eksperimentelle endepunkter - fluorescens og bioluminescens. (GFP fluorescens målinger er anbefalt som et middel til å normalisere Bioluminescens data.)
MERK: Mål å lese endepunkter ved 66-67 timer etter mat levert til nematoder for å forebygge vesentlig avkommet produksjon under de eksperimentelle betingelser som er beskrevet.- Sett opp plate å bruke som bakgrunn kontroll for GFP målinger. Combine vel innholdet fra 13 th plate inn i en 15 ml tube. Tillat nematoder å bosette (2-3 min). Bruk supernatant å laste en mikro (svart med gjennomsiktig bunn) med 100 mL bakteriell suspensjon per brønn.
- Observere bakgrunnen kontroll plate under mikroskop notere ned brønner hvor nematoder kan sees. Utelukke disse fra bakgrunnen estimat benyttes i påfølgende dataanalyse.
- Les fluorescens av hver 96-brønns plate, herunder bakgrunnen kontroll. (Innstillinger: optikk fra bunnen av tallerkenen, filtre 485/20 eksitasjon; 528/20 utslipp.)
- Forbered buffer for luminescens målinger: legg luciferin (20 mm) til å del-forberedt buffer (fra gårsdagen), for å få luminescens buffer med 1% DMSO (1x), 0,15% Triton-X100 (3x) og 0,3 mM luciferin (3x ). Prime luminometer injektor 6x med 150 ul luminescens buffer.
- Forrige trinn foruts 1% DMSO som kjøretøyet under legemiddeleksponering. Når bilen er vann, justere concentration av DMSO i luminescens buffer til 3% (dvs. 3x).
- Arbeide med en plate om gangen. Tilsett 50 ul luminescens buffer per brønn. (150 ul endelige volum i tillegg; 3x utvanning av luminescens buffer: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 og 0,1 mm luciferin sluttkonsentrasjoner.) Plasser umiddelbart på risting plattform og starter tidtakeren.
- Etter 3 min på risting plattform (160 rpm), lese luminescens (1 sek per måling).
- Sett opp plate å bruke som bakgrunn kontroll for GFP målinger. Combine vel innholdet fra 13 th plate inn i en 15 ml tube. Tillat nematoder å bosette (2-3 min). Bruk supernatant å laste en mikro (svart med gjennomsiktig bunn) med 100 mL bakteriell suspensjon per brønn.
4. Data Analysis
- Trekk fra gjennomsnittlig GFP bakgrunn lesing fra fluorescens resultater. Dele Bioluminescens av respektive GFP lesing.
- Når en høy GFP verdi detekteres for nematoder som er utsatt for en forbindelse, måle fluorescensen av forbindelsen i seg selv for å ta hensyn til hvilken som helst forbindelse fluorescens. Hvis høyere enn gjennomsnittet, kan du bruke dette som bakgrunn i stedet.
- Express Bioluminescens, GFP normalisert bioluminescens ennd GFP fluorescens data som en prosent av den gjennomsnittlige verdien for kjøretøykontroll i hver plate.
- Plotte gjennomsnittsverdier og feilfelt for hver konsentrasjon.
- Test for statistisk signifikans ved hjelp av to-veis analyse av varians (ANOVA) med effekten av 'Konsentrasjon', 'Experiment ", og deres interaksjon (hvert datapunkt refererer til en enkelt brønn), og bruke Dunnett test som post-hoc test (vs . kjøretøykontroll).
MERK: Hvis "eksperiment" eller "samhandling" vilkårene er betydelig, kan ytterligere eksperimenter være nødvendig for å bekrefte svaret. Der ingen variasjon mellom eksperimenter er tydelig fra observasjon av dataplott, kan en Enveis ANOVA utføres på data fra uavhengige forsøk.- For den statistiske analysen av plate (r) med bilen bare ved å velge alle brønner i kolonne 6 -7 og alle brønner i rad H som kontrollgruppe (disse er stillingene rutinemessig tildelt kjøretøyet under sammensatte testing).
Representative Results
Representative resultater for å illustrere fremgangsmåten ble oppnådd for rotenon (figur 1), paraquat (figur 2), oksaloacetat (figur 3), og 4 forbindelser som ble plukket opp som ildflue luciferase-hemmere i screening av et medikament bibliotek 13 (figur 4). Den legemiddeleksponering ble startet på L4 fasen i alle tilfeller, men forsøkene paraquat eksponerings ble startet ved 41 timer etter at maten først levert til nematoder sammenlignet med 45-46 timer for de andre forbindelser. Protokollen muliggjør en grad av fleksibilitet i valg av tiden for initiering av medikamenteksponering og eksponeringen lengde. Men for screening-formål, satt ganger bør følges når valgt, for reproduserbarhet mellom eksperimenter. Endepunktene bør måles ved 66-67 timer utviklingsmessige tid for å unngå omfattende egglegging og klekking av avkom i brønner. Retningslinjer for timings er gitt i Tstand en.
Rotenon, et mitokondriell kompleks I-inhibitor, redusert bioluminescens etter at begge relativt korte (2 timer) og lengre eksponering (24 t) til et område av konsentrasjoner (figur 1). I dette tilfellet ble det ikke GFP målinger tatt, men antall tekniske replikater brukes (n = 6) er tilstrekkelig for å utjevne eventuelle forskjeller i snekke tall mellom brønner 3. Den 24-timers eksponering er et tidsvindu over hvilke nematoder vokser, og langsommere utvikling som et resultat av kompleks I inhibering ble forventet å bidra til nedgangen i Bioluminescens. Dette ble bekreftet ved visuell observasjon under stereoskop med forsinket utvikling sett, spesielt ved konsentrasjoner på 20 uM og ovenfor; i tillegg noen dødelighet ble lagt merke til fra 40 mikrometer (kvalitative observasjoner ikke kvantifisert). Ingen dødelighet ble observert etter 2 timers eksponering, men effektene på snekkebevegelse ble sett. En kraftig nedgang i Bioluminescens forhold til kontroller occuRøed ved den laveste konsentrasjon av rotenon testet 2,5 uM, for hvilke effektene ble ikke lett påvises ved rask visuell observasjon ved 2 timers eksponering. Denne nedgang i Bioluminescens er forenlig med redusert cellular ATP. Maksimal inhibering ble oppnådd med den laveste konsentrasjon av rotenon brukes (2,5 pM) som indikerer at alle påfølgende eksperimenter spesielt rettet rotenon bør utføres mellom 0 og 5 uM [konsentrasjonsområdet 0-160 uM ble valgt som en del av en sammenligning med andre legemidler utgangspunktet identifisert som å ha betydelige effekter på 10 mm (for å bli publisert andre steder)].
Herbicidet paraquat påvirker mitokondriefunksjon ved økning av reaktive oksygenarter. Her viser vi dens effekt på Bioluminescens av C. elegans belastning PE254 etter eksponering for en rekke konsentrasjoner for 24 timer (figur 2). Som belastningen bærer et luc :: GFP fusjon, GFP fluorescens var also målt som et middel for normalisering. 6,9 Paraquat redusert bioluminescens, GFP fluorescens og normalisert bioluminescens betydelig. Den Dunnet post-hoc test indikerte at konsentrasjonene av paraquat med betydelige forskjeller i forhold til bærerkontroll var 4 og 8 mM for bioluminescens og normalisert bioluminescens, så vel som 2 mM for normalisert bioluminescens. Den eneste konsentrasjon betydelig reduserer GFP fluorescens var 8 mm, en konsentrasjon på hvilke vekst effekter og en og annen død orm ble sett (kvalitative observasjoner). Nedgangen i bioluminescens (og normalisert bioluminescens) var større enn for fluorescens, i samsvar med nedsatt mitokondriefunksjon og effekter på ATP produksjon.
Sitronsyresyklusen mellom oksaloacetat testet på C. elegans belastning PE254 på en enkel konsentrasjon på 8 mm, førte til en økning i Bioluminescens (figur 3). Ingen GFP fluoresceNCE målinger ble oppnådd eller visuell observasjon utført; men en slik reaksjon på en enkel konsentrasjon ville fortjener ytterligere bekreftende eksponering for en rekke konsentrasjoner, og mer detaljerte observasjoner av effekter. En forbedring av biolumine av denne forbindelsen er ikke overraskende da det kan være antatt å føre til større aktivitet i sitronsyresyklusen, og til slutt større produksjon av ATP (ikke desto mindre ville det være tilrådelig å kontrollere for eventuelle virkninger på luciferase-nivåer ved å vurdere GFP fluorescens i senere eksperimenter). De oksaloacetat datasett vist avsløre graden av variabilitet i responsen vist på luciferase-basert forsøk. Etter vår erfaring er denne variasjonen er en funksjon av testsystem spesielt for mindre skadelige eksponeringsforhold.
Den ildflueluciferase hemmende forbindelser DDD00001434, ble DDD0001477, DDD00000635 og DDD00023047 testet både in vitro ved å se på effekter på pufjerne nesten all enzym og in vivo ved hjelp av C. elegans luc: GFP uttrykke belastning. Det var ingen bevis for at noen av de testede forbindelsene forårsaket nematode død under eksponeringsforholdene. Alle 4 forbindelser påvirkes luciferase-aktivitet in vitro ved 2 konsentrasjoner testet 25 og 100 pM (figur 4A). DDD00001434 drepte aktiviteten av det rensede luciferase nesten fullstendig, noe som ga en troverdig begrunnelse for det store fallet i in vivo bioluminescens (figur 4B). Selv om in vitro og in vivo er ikke direkte sammenlignbare, responsen på DDD00023047 var lik i begge analysene. DDD0001477 og DDD00000635 forårsaket en større nedgang in vivo enn in vitro. Disse forbindelsene ble gitt til de levende ormer 22 timer før den luciferin underlaget, og resultatene kan gjenspeile at de ikke var lett forskjøvet fra luciferase aktive området når luciferin ble tilgjenglable. Alternativt kan DDD0001477 og DDD00000635 ha en ekstra effekt på mobilnettet ATP nivåer. Dette vil måtte vurderes ved hjelp som ikke involverer ildflueluciferase. I notatet var sterk forbedring av GFP signal i levende ormer utsatt for sammensatte DDD00000635. Dette vil bli omtalt nedenfor.
Figur 1. mitokondrielle kompleks I-inhibitor rotenon redusert energistatusen for C. elegans som målt ved bioluminescens av stamme PE254. Synkronisert L4 trinns ormer (45-46 timer etter mat levert til L1 larver) som utsettes for 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 og 160 uM rotenon i 1% DMSO for 2 hr (kort) eller 24 timer (lang eksponering) tidligere lesninger av Bioluminescens henholdsvis 48 og 69 timer av ormen utvikling etter mat oppgitt. Bioluminesens (enhet relative lysenheter, RLU) ble uttrykt som en prosentandel av kjøretøyet (1% DMSO) verdier. Feilfelt viser SEM av tekniske replikater på hver rotenon konsentrasjon (n = 6). Alle konsentrasjoner ble testet resulterte i en meget statistisk signifikant forskjell i forhold til bærerkontroll (p <0,001).
Figur 2. Den oksidative stressfaktoren paraquat redusert energistatusen for C. elegans stamme PE254 på en konsentrasjonsavhengig måte (målt ved bioluminescens). Synkronisert L4 trinns ormer (for enkelhets skyld i dette tilfelle ved 41 timer etter mat levert til L1 larver) ble utsatt for 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 eller 8 mM paraquat i 24 timer. GFP fluorescens (enhet i forhold fluorescensenheter, RFU) ble brukt til å normalisere Bioluminescens data (enhet RLU), begge endepunkter oppnådd ved 65 hr utvikling. Data er uttrykt som en prosent av kontroller (1% DMSO). Feilfelt skildre SEM av tekniske replikater(n = 5 for forskjellige konsentrasjoner; n = 18 for kontroller). Enveis ANOVA: *** p <0,001 i forhold til kjøretøykontroll.
Figur 3. Den sitronsyresyklusen mellom oksaloacetat (8 mM) forbedret Bioluminescens av C. elegans belastning PE254. Synkronisert L4 scenen ormer (45-46 timer etter mat levert til L1 larver) ble utsatt for nylagde 8 mm oxaloacetate for 18 timer ± 30 min. Bioluminesens (enhet RLU) ble avlest på en utviklings tid på 63,5 timer ± 1 time, og ble uttrykt som en prosentandel av bærerkontrollen (DDH 2 O). Forskjellige kolonner representerer forskjellige datasett av 8 tekniske replikater allokert til forskjellige 96-brønners plater i det samme eksperimentet. Feilfelt viser SEM-tekniske replikater (n = 8). 2-veis-ANOVA med "sett" og "konsentrasjon" som faktorer: ̵6; Set 'p> 0,05,' konsentrasjon 'p <0,001 og samhandling sikt p> 0,05.
A 
B 
Figur 4. Testing av respons på 4 forbindelser fra Dundee medisiner forbindelse bibliotek 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 og C4: DDD00023047) med kjent hemmende aktivitet på ildflueluciferase luminescens. (A) Effekt av forbindelsene på aktiviteten av renset ildflueluciferase (målt som lysenheter, RLU), uttrykt som en prosent av bærerkontrollen. ATP Bioluminescens CLSII kit (Roche, Manheim, Tyskland) ble brukt i henhold til instruksjoner med samme mengde luciferase enzymet alikvotert til brønner (hvit 96-well mikrotiterplater). ATP ble gitt til en endelig konsentrasjon på 10 uM og 1 pl av forbindelsen (sluttkonsentrasjon er angitt) eller DMSO (1%) ble tilsatt. Luminescence signal ble integrert for 10 sekunder. Feilfelt viser SEM-tekniske replikater (n = 4). Analyse: Enveis ANOVA; * p <0,05 eller *** p <0,001 i forhold til kjøretøykontroll. Forskjeller mellom 25 og 100 mikrometer stor betydning for C1 (DDD00001434; p <0,001), og betydelig for C2 og C3 (henholdsvis DDD0001477 og DDD00000635; p <0,05). (B) In vivo målinger av Bioluminescens, bioluminescens normalisert til GFP fluorescens og GFP fluorescens av C. elegans belastning PE254 på 67 timer utviklings tid etter eksponering for testforbindelser i 22 timer. Feilfelt viser SEM-tekniske replikater (n = 8). Statistisk analyse (En måte-ANOVA) utført på data fra 3 datasett (3 Xn = 8). * p <0,05 eller *** p <0,001 i forhold til de respektive bærerkontroll. Differences mellom 25 og 100 uM bare statistisk signifikant (p <0,05) for normalisert bioluminescens etter eksponering for C4 (DDD00023047).
| Tid på dagen | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | Dag 7 | Dag 8 |
| 9-10 | Trinn 5 | |||||||
| 10-11 | Trinn 5 | |||||||
| 11-12 | Trinn 4 | Trinn 5 | ||||||
| 12-13 | Trinn 4 | |||||||
| 13-14 | ||||||||
| 14-15 | ||||||||
| 15-16 | ||||||||
| 16-17 | Trinn 1 | Trinn 3 | ||||||
| 17-18 | ||||||||
| 18-19 | Trinn 2 |
Tabell 1. Oversikt over protokolltrinn som skal utføres på hver dag av nematode eksperimenter (avsnitt 3), og foreslo tidsberegning.
Discussion
Modellen organismen C. elegans gir en kraftig eksperimentelt system. Det er lett å kultur og produserer rikelig genetisk identisk avkom med en 3,5 dag livssyklus fra egg til å reprodusere voksen (via juvenile larvestadier L1 til å L4). På grunn av sin lille størrelse, kan det være beleilig dyrket i 96-brønners plater, tilrettelegge forbindelse screening. Vi presenterer en fenotypisk screening protokoll basert på stammer av C. elegans som fungerer som in vivo sensorene energinivåer. 14 Protokollen kan anvendes på en hvilken som helst laboratorium, selv om en 96-brønns plate luminometer og en steril skap er nødvendig. Det er viktig å hindre forurensning i analyser ved hjelp av god laboratorieteknikk. Ved arbeid manuelt, er det maksimale antall nematode plater oppnåelig 13 per eksperiment tillater testing av 2x 96-brønners narkotika plater og med to kjøretøy plater. Representative Resultatene presenteres for mitokondrie-komplekset Jeg inhibitor Rotenone, den superoksid generatoren paraquat, sitronsyresyklusen mellom oksaloacetat og fire forbindelser med kjent ildflueluciferase inhibitorisk aktivitet. De to første forbindelser førte til en nedgang i Bioluminescens som spådd mens oxaloacetate førte til en forbedring, trolig skyldes økt produksjon av ATP. De oksaloacetat datasettene viser også den iboende variabilitet i eksperimenter basert på ildflueluciferase som en reporter. Minst tre uavhengige eksperimenter er tilrådelig å fastslå robusthet av svar til ukjente forbindelser.
Inhibering av ildflue luciferase aktiviteten var identifiserbar med en in vitro-analyse ved bruk av et kommersielt sett. 3 en av de forbindelser som resulterte i en betydelig økning i GFP fluorescens i samsvar med inhibitoren å øke nivåene av GFP-merket ildflueluciferase ved binding til luciferase enzymets aktive området, og gjør den mer stabil. 15 I noen tilfeller(ikke i dette spesielle tilfellet) kan dette føre til økte nivåer av bioluminescens når inhibitoren fortrenges av overskudd av substrat. 15 Det er derfor viktig ikke å tolke resultatene feilaktig fra forbindelser som interagerer med den ildflue enzym som reduseres eller økes ATP nivåer / mitokondrienes funksjon. Endringer i luminescens signal ganske ofte korrelerer med flere målinger av helse som bevegelse, utvikling og vekst. Som et eksempel, er en forbindelse en mistenkt luciferase-inhibitor hvis en dramatisk nedgang i bioluminescens signal registreres, men ormer er umulig å skille fra kontrollene ved mikroskopisk observasjon. En økning i GFP fluorescens, ikke forklares med vekst eller sammensatte autofluorescence, kan også vise til en hemmer. En rekke luciferasepreparater hemmere 15 er kjent og har inngått PubChem. Derfor i første omgang, er det lurt å oppsøke informasjon om luciferasepreparater hemmere eid av PubChem; etterfulgt av tressant av de sammensatte virkninger i in vitro-forsøk med det rensede enzym 3 og / eller bekreftelse av effekter på mitokondriefunksjon ved ytterligere midler. 16,17
GFP fluorescensmålinger aktivere sporing av ildflueluciferase nivåer (og potensialet påvisning av enkelte luciferasepreparater hemmere som omtalt ovenfor) gjør en sterk sak for å måle dette endepunktet sammen Bioluminescens der det er mulig. Normalisering av Bioluminescens avlesninger til GFP er også et middel for behandling av variasjoner i snekke tall mellom brønnene (selv om dette kan også oppnås ved å inkludere flere tekniske replikater). For å oppnå større følsomhet, er det viktig å trekke fra bakgrunnsfluorescensen fra avlesninger. Protokollen vurderer bidraget av bakteriesuspensjonen til bakgrunnsfluorescens, men nematode autofluorescens ikke tas hensyn til (en begrensning av den aktuelle analyse, særlig kritisk for noen aldring studør gitt at nematode autofluorescence øker med alderen). Autofluorescence av testforbindelser bør også vurderes parallelt. GFP normalisering ville virke uunnværlig hvor forskere ønske å tilpasse protokoll for å sammenligne cellulære ATP bassenger i ulike genetiske mutanter eller etter tie forskjellige gener, for å kontrollere for eventuelle belastningsforskjeller på nivået av ekspresjon av Bioluminescens transgenet.
Kritiske parametre i protokollen omfatter utviklingsstadiet hvor eksponering blir initiert, lengden av eksponeringen, og å oppnå tilsvarende antall av nematoder i forskjellige brønner. Eksponering kan starte når som helst stadium i utviklingen av nematoder, men L3 scenen eller eldre er å foretrekke. Fra dette stadiet på, nematoder avhenge oksidativ fosforylering for utvikling inn i voksenlivet, som dokumentert av en meget betydelig økning i mtDNA innhold, oksygenforbruk og ATP-nivåer. 18,19,20 protokoll initierer exposure på L4 scenen. Grunnen til alikvoteringsprosessen nematoder til 96-brønners plater bare på dette stadium (heller enn da de ble først forsynt med mat på L1 stadium), er at selv om platene er plassert i fuktige kammere for å minimalisere fordamping, en viss grad av fordampning fremdeles forekommer i vår risteinkubator, sett på som svært små dråper som danner på lokkene (dette kan ikke være et problem med andre inkubatorer). Ved alikvoteringsprosessen nematoder til plater like før tilsetningen av legemiddel standarder, er selve legemiddelkonsentrasjon ikke påvirket av noen små variasjoner i volum på grunn av fordampning. Legge en nematode plate med bilen bare er nyttig å sjekke at nematoder ble jevnt fordelt mellom brønnene. Eventuelle signifikante forskjeller ble funnet for kjøretøyet eneste plate ville være en indikasjon på dårlig teknikk i utlevering av nematoder til brønner.
Lengden av eksponering er en viktig faktor å vurdere. Hvis effekter på energistatus uavhengig av vekst er av interesse, proprotokollen kan endres for å imøtekomme kortere eksponeringer (fra nesten umiddelbare svar på, for eksempel, to hr). På den annen side, oppføring av forbindelser i C. elegans vev kan ta litt tid. For eksempel 12-24 timer er nødvendig for å oppnå maksimale interne konsentrasjoner av resveratrol og 5-fluor-2'-deoksyuridin (FuDR). 21 Derfor lengre eksponeringstid (18 til 24 timer) kan være forsvarlig å maksimere eksponeringsnivåer. Eksponeringstiden bør begrenses til tider som ikke tillater betydelige nivåer av reproduksjon skal finne sted i brønnen. Vi anbefaler at den totale utviklingstiden nematoder holdes under 66-67 timer. Selv om praktisk, er nematoder gravid da og har igangsatt egglaying. Likevel har vi funnet Bioluminescens avlesninger fra egg preparater for å være ubetydelig (ikke vist). Den sur-5 promoter drevet transgene uttrykk først oppdaget bare to til to og en halv time etter befruktning ved 100 cellestadiet 22 og chitinous eggeskall er sannsynlig å begrense oppføring av luciferin. Andre har funnet at embryonerte egg ikke bidra vesentlig til metabolismen av gravid voksne. 23 Imidlertid, for forhold som gir betydelig avkom produksjonen skal unngås. Hvis foretrukket, kan den eksperimentelle tidsskalaen bli flyttet tilbake: vi har tidligere innledet eksponering for en miljøgift på slutten L3 larvestadiet (36 timer) og gjennomført Bioluminescens og GFP målinger på 55 hr 2 Alternativt genetiske bakgrunn som er betinget sterile. kan brukes til å hindre avkom produksjon, som for eksempel den fer-15 (b16) II; FEM-1 (hc17) IV dobbel mutant som kan opprettholdes på 15 ° C, men er steril ved 25 ° C. 24. Anvendelse av FuDR for å indusere sterilitet anbefales ikke, da dette kan i seg selv påvirke nematode metabolismen. 25 Analysen kunne også utføres i stammer med mer permeable hårstråene som delvis tap-av-funksjoion buss-8 mutanter som er multi sensitive grunn til å øke permeabiliteten av narkotika. 26 Dette vil lette kortere eksponeringer og lavere sammensatte konsentrasjoner. Vilkårene for å legge luciferin til disse nematoder kan også trenger justering dvs. 1% DMSO og 0,05% Triton-X100 i luminescens buffer kan ikke være nødvendig å forbedre luciferin tilgjengelighet.
Protokollen bruker 1% DMSO som redskap for sammensatte levering. Selv om ikke dødelig, har denne konsentrasjon av DMSO noen biologiske virkninger som vi har omtalt i en tidligere publikasjon. 3 Mange av de tilgjengelige medisinske bibliotekene blir fremstilt i 100% DMSO, ved konsentrasjoner som vil være egnet for celle-baserte analyser etter fortynning på kjøretøyet til 0,1%. Høyere sammensatte konsentrasjoner er pålagt å framprovosere reaksjoner i C. elegans sammenlignet med humane celler, slik at det ofte ikke er mulig å utføre analyser ved lavere enn 1% DMSO. Igjen er anvendelsen av bakteriermer permeable hårstråene kan føre til testing med lavere konsentrasjoner av kjøretøyet. Konsentrasjoner av DMSO høyere enn 1% er ikke anbefalt.
Et sett inkubasjonstid med luciferin før målingene må overholdes. Som tidligere vist, når luminescens dets maksimalt nivå i det andre minutt etter tilsetning av luciferin, det er relativt stabilt for den første 5 min, etterfulgt av en langsom gradvis reduksjon i luminescens i løpet av de neste 30 min 1. Kinetisk respons på en bestemt kjemisk kan utføres i løpet av denne innledende fasen av 30 min etter innledende dosering av luciferin.
Protokollen omfatter et sult trinn etter samling av egg for å oppnå synkronisering av nematode befolkningen. Vi anbefaler synkronisering av nematode test populasjoner siden forskjellige utviklingsstadier er forskjellige i cellulære ATP-nivåer, og kan reagere forskjellig på testforbindelsene. Ved å utføre den sult i S fullstendigmedium i motsetning til M9 er klekke nematoder forsynt med en karbonkilde (etanol), slik at larvene ikke utvikler, men er ikke helt utsultet. 27,28 Det har også blitt vist at arrestert L1-er primet for rask respons til mat og L1 normal vekst er oppnådd innen 3 timer etter at maten blir tilgjengelig. 29 Imidlertid, det muligheten for at sult trinnet kan endre metabolismen av C. elegans kan ikke utelukkes. 30 Av denne grunn er lengden av sult bør ikke overstige 24 timer (18 timer er tilstrekkelig for synkronisering). Enkelte laboratorier kan ha muligheten for å bruke en Copas Biosorter for alder synkronisering utenom sult skrittet helt. Andre laboratorier kan ha en preferanse for å utvide nematode befolkningen på faste medier (NGM plater med OP50) før bleking (trinn 3.1), og dette vil fungere bra også. Vi bruker S medium under sammensatte eksponering som en standard medium for nematode dyrking, however andre medier kan velges, for eksempel K medium eller EPA moderat hardt vann er ofte brukt for økotoksikologiske studier. 31,32
Protokollen gir et middel til skjermen og til å identifisere kandidater for videre testing i form av effekter på mitokondrienes funksjon. I den fasen av primær screening er det sannsynlig at noen forbindelser vil ha blitt oversett på grunn av bare en konsentrasjon som testes, er derfor narkotika-skjermer skal ikke betraktes som uttømmende. Hits kan valideres ved bruk av teknikker for å vurdere ulike aspekter av mitokondrienes funksjon for eksempel oksygenforbruk, C. elegans-stammer med GFP-uttrykkende mitokondrier, flekker på mitokondriemembranpotensialet og / eller ROS-målinger. 16,33,34 Den største betydning ved metoden er å ha et middel for screening av store antall av forbindelser og / eller forholdene på den flercellede organismal nivå, og viktigere å være i stand til å dra nytte av the genetisk tractability av C. elegans å undersøke virkningsmekanismer. Teknikken kan bidra til å akselerere og finne nye veier til oppdagelsen av interessante forbindelser og mål. Det er tenkt at en kombinasjon av en sensor med genetiske bakgrunn er forbundet med human sykdom for screening av sammensatte bibliotek i en sykdom relevant sammenheng vil ha mye å tilby.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
| Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
| Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15 ml tubes) | |
| Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
| Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
| Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
| Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
| Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
| Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
| 0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
| Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
| Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
| Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
| Reservoir reagent 60 ml | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1 |
| Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
| Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4 °C, seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
| D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
| DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
| Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH2O |
| Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
| C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
| E. coli OP50 | CGC | ||
| General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |
References
- Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans. BMC Physiol. 8, 7 (2008).
- Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor. Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).
- McLaggan, D., et al. Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor. PloS one. 7, e46503 (2012).
- Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells. Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).
- Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
- Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans. Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).
- Leung, M. C., et al. Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).
- Kuang, J. J., Ebert, P. R. The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism. Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).
- Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors. FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Brenk, R., et al. Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases. ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).
- Lagido, C. Nematodes as environmental indicators. Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. , CABI. 225-251 (2009).
- Thorne, N., et al. Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter. Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).
- Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497, 451-457 (2013).
- Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Pharmacological approaches to restore mitochondrial function. Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).
- Tsang, W. Y., Lemire, B. D. Mitochondrial genome content is regulated during nematode development. Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).
- Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans. Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).
- Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
- Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods. PloS one. 8, e56877 (2013).
- Yochem, J., Gu, T., Han, M. A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis. Genetics. 149, 1323-1334 (1998).
- Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans. J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev Biol. 317, 549-559 (2008).
- Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae. PloS one. 7, (2012).
- Baugh, L. R. To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest. Genetics. 194, 539-555 (2013).
- Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest. Science. 324, 92-94 (2009).
- Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans. Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).
- Cressman, C. P., Williams, P. L. Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media. Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).
- Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media. Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).
- Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response. Genetics. 174, 229-239 (2006).
- Yang, W., Hekimi, S. A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans. Plos Biol. 8, (2010).
