Introduction
Det overordnede formål med denne procedure er den hurtige kvantificering af den energi status C. elegans in vivo med henblik på at bruge dette som et slutpunkt i sammensatte screening. Rationalet er baseret på den transgene ekspression af ildflue-luciferase i nematoden C. elegans 1-3 via plasmidet pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). Luciferaseenzymet er fusioneret til grønt fluorescerende protein GFP og udtrykkes konstitutivt og ubikvitært i cytoplasmaet (luciferase peroxisom målrettet signal blev fjernet). Dette fører til lysemission når substratet luciferin tilvejebringes eksogent. Som ormen er transparent, kan måles lys i et luminometer som relative lysenheder (RLU). Cellular ATP brændstoffer bioluminescensreaktionen og dets tilgængelighed bestemmer lysniveauer producerede. Følgelig luminometri tilbyder en convenient betyder at vurdere relative ATP niveauer og i forlængelse mitokondriefunktion, da ATP-produktion sker hovedsagelig i mitokondrier. En sammenhæng mellem mitokondriefunktionen og bioluminescens niveauer er blevet påvist tidligere gennem nedregulering af mitochondriale elektrontransportkæde gener og samtidig reduceret lyseffekt. 1
De Bioluminescens stammer genererede blev betegnet PE254 (feIs4) og PE255 (feIs5) 1 (se materialer listen) og kan anvendes i flæng. 3 En række undersøgelser har udnyttet disse sensor stammer til at rapportere om cellulære ATP-niveauer in vivo efter udsættelse for forskellige miljøfremmede kemikalier såsom natriumazid 1, cadmium 2, spildevand slam ekstrakt 3, 5'-fluor-2-deoxyuridin 6, og en tobaksspecifikke nitrosamin 7. Stammerne har også været nyttigt at overvåge virkningerne af eksponering for ultraviolet C-stråling
Protokollen giver mulighed for in vivo monitorering af energiniveauer (i modsætning til mere teknisk besværlig in vitro ATP bestemmelser), der muliggør forbindelse screening og repositionering i det fysiologiske forbindelse med en hel multicellular organisme. Proceduren kan udvides til en række genetiske baggrunde ved at krydse kromosomalt integreret transgen i tilgængelige mutantstammer og / eller ved at lukke munden gener ved RNA-interferens; dermed drage fuld fordel af C. elegans som en model organisme. Metoden skal hjælpe med at reducere sent svigt af lægemiddelkandidater fase på grund af mitokondrietoksicitet og yde et bidrag til reduktion af højere dyreforsøg.
Protocol
BEMÆRK: Udfør alle trin under sterile forhold (laminar flow skab) og præ-steriliserede materialer (ved autoklavering 126 ° C, 11 min). En LB plade med udstrøget E. coli OP50 holdt ved 4 ° C er påkrævet, streak ud på friske LB-plader og restreak hver måned.
1. Bakteriel Food (Escherichia coli OP50) Forberedelse
- Dag 1. Inokulér 2 x 5 ml LB i to universelle flasker med en enkelt koloni af E. coli OP50 og sted i rysteinkubator ved 37 ° C (220 rpm) i 8 timer.
- Efter 8 timers inkubation bruge 2 ml E. coli OP50 LB kultur til podning hver af 3 x 200 ml LB. Sted kolber i rysteinkubator (220 rpm) O / N (17 timer) ved 37 ° C.
- 20 x 50 ml centrifugerør afvejes og skrive vægten på røret.
- Dag 2. Brug en serologisk pipette portion 30 ml O / N E. coli OP50 kultur ind i pre vejet centrifugerør. Centrifuge ved 7.741 xg, 10 ° C, 8 min.
- Dekanteres forsigtigt supernatanten, holde røret omvendt med låg på og lad det stå i flere minutter. Ved hjælp af en pipette fjerne overskydende supernatant, der kan have samlet i låget. Røret vejes, og beregne vægten af bundfaldet.
- Beregn rumfanget nødvendig for at tilvejebringe en suspension af 30 g / L og markere denne mængde på røret. Dato, label og sted rør ved -20 ° C til brug inden for 1-3 måneder, eller ved - 80 ° C, hvis opbevaring i mere end 3 måneder.
- Forbered bakteriesuspension til dyrkning nematoder; tillade bakteriel pellet at tø op og tilsæt nødvendige mængde S komplet medium 11,12 til hvert rør, forsigtigt vortex for at resuspendere pellet, at samle indholdet af forskellige rør opnå det påkrævede volumen. Arbejde under sterile forhold.
2. Fremstilling af Drug Standards i en 96-brønds plade Format
BEMÆRK: Hvis du bruger et lægemiddel bibliotek, er narkotika plader leveres på en enkeltkoncentration af forbindelse i DMSO. Primær screening vil teste forbindelser ved en enkelt koncentration. Instruktioner følge for tilberedning af narkotika plade til bekræftende sammensatte test på en række koncentrationer mellem 0-160 uM, udvalgt efter statistisk signifikans ved 10 uM. Nedenstående trin kan tilpasses til at teste andre koncentrationer.
ADVARSEL! Følg nødvendige forholdsregler for håndtering af lægemidler (generelt står maske, beskyttelsesbriller, handsker er påkrævet).
- Forbered stof plade med arbejde standarder for bekræftende screening: Afvej den ønskede mængde forbindelse i sterilt 1,7 ml mikrocentrifugerør og forberede 16 mM forbindelse i DMSO (dvs. 100x koncentreret i forhold til den ønskede koncentration til toppen eksponering).
- Serielt fortyndet 16 mM stamopløsning 1: 2 i DMSO til opnåelse af 8, 4, 2, 1, 0,5 og 0,25 mM standarder (sterile betingelser). Disse er 100x koncentrerede og fortyndes ned til slutkoncentrationer på 0 (kun vehikel),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 og 160 uM (i 1% DMSO) under narkotika eksponering.
- I en laminar strømning, placere 20-50 pi per brønd af sammensatte standarder inden for en søjle i en plade med 96 brønde, f.eks pladeposition A1: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0,25 mM lægemiddel og H1: DMSO. Brug forskellige kolonner til fortynding række forskellige lægemidler.
- Alikvot køretøj til brøndene i kolonne 12 i lægemidlet pladen.
BEMÆRK: Dette vil lette test af køretøjets styring ned kolonner i supplement til de undersøgelser langs rækken H, der sikrer, at køretøjet er prøvet i positioner repræsentative for hele pladen.
BEMÆRK: Hvert lægemiddel plade til bekræftende screening holder fortyndingsrække i maksimalt 11 forskellige lægemidler, der skal testes plus køretøjet kontrol. - Label og tætningspladen, dække med folie og sted ved -20 ° C indtil anvendelse.
3. Nematode Eksperimenter
BEMÆRK: Udfør alle trin under sterile betingelser, aseptisk og med præ steriliseret materialer og reagenser. Vedligehold C. elegans stammer rutinemæssigt på NGM plader med E. coli OP50. 12 Foreslåede tider for de forskellige protokoltrin er tilvejebragt i tabel 1.
- Dag 1 opgave: oprettet flydende kultur af biosensor stammen til efterfølgende synkronisering.
- Tage op nematoder fra en 6 cm NGM plade (med masser af unge larver, hvor fødevarer er netop kørt ud) i 2 ml S komplette og overføre til kolbe med 30 g / l E. coli OP50 i S komplet (samlet volumen 30 ml i en 250 ml kapacitet konisk glaskolbe). Inkuber 3 dage ved 20 ° C, 160 rpm.
- Dag 4 opgave (tillade ca 30-35 min): blegemiddel kultur at høste æg og synkronisere ormen befolkning. Udfør alle centrifugeringstrin i 1 min, 600 x g.
- Forbered blegemiddel løsning lige før brug: til hver 16 ml 0,156 M KOH / NaOH tilsættes 4 ml blegemiddel.
- Hæld 2 x 14 mlormen kultur i 15 ml koniske centrifugeringsrør. Tillad orme at bosætte af tyngdekraften (3 min). Fjern og kassér flydende ovenfor afregnet nematoder. Der tilsættes 5 ml blegemiddelopløsning til hvert rør og begynde timer. Kombiner mængder i et rør.
- Vend røret forsigtigt i 2 min, så tjek under stereoskop for bruddet af orme og frigivelse af æg i suspension. Når de fleste æg er frigivet eller ved en maksimal tid på 2 minutter i blegemiddelopløsningen, centrifuge.
- Fjern supernatanten omhyggeligt. Vask pellet 1x med 14 ml S komplet og centrifuge.
- Kassér supernatanten, tilsættes 10 ml blegemiddelopløsning og start timeren (dette andet blegemiddel trin sikrer, at de fleste af ormen kroppe i opløsning og er ikke længere ses under stereoskop). Efter en maksimal tid i blegemiddel opløsning af 2 minutter, centrifugeres.
- Vask pellet 3x i S komplet, forsigtigt dekanteres supernatanten og resuspender pellet i 14 ml S komplet efter hver centrifugering. Efter sidste vask, resuspender æg pellet i 14 ml S complete.
- Overfør lydstyrken til en konisk glaskolbe. Inkuber 18-24 timer ved 20 ° C, 160 rpm.
BEMÆRK: Høstet klækkes æggene O / N og hæmme udviklingen på det første stadie larver (L1) på grund af mangel på fødevarer, og derfor vil de alle være på samme vækststadium.
- Dag 5 opgave: oprettet synkroniserede orm kulturer i narkotika-analyser.
BEMÆRK: Worms suspenderet i sult medium tendens til at klæbe til hydrofobe plastoverflader såsom pipettespidser og rør. 0,01% Tween-20 er et overfladeaktivt middel anvendes her til at gøre plastoverflader mere hydrofile og giver større nøjagtighed i tællingen (0,01% Triton-X100 kan også bruges). Når nematoder er i den bakterielle suppleret medium, de ikke har tendens til at holde sig til plast.- Bestem antallet af udklækkede L1 er i kolben, holde kolben på ryste platform (160 rpm).
- Tag 3 x 100 prøver pi fra kolbe (brug en ren spids hver gang) i separate 1,7 ml mikrorør med 900 pi væske medium 0,01% Tween-20.
BEMÆRK: Aspire 100 pi prøve i den rene spids én gang. Så når dispensering, pipette op og ned et par gange i Tween suppleret medie til at frigive eventuelle orme klæber til spidsen. - Tæl nematoder i 4x 10 dråber ul fra hvert tredobbelt fortynding rør. Beregn middelværdi og anslå antallet af orme til stede i den koniske glaskolbe.
- Tag 3 x 100 prøver pi fra kolbe (brug en ren spids hver gang) i separate 1,7 ml mikrorør med 900 pi væske medium 0,01% Tween-20.
- Beregn mængden af udklækkede nematode suspension kræves for at etablere en 2 x 20 ml kultur med 10 nematoder per 10 pi. Forøg beregnede volumen med 10% for at tage højde for nogle efterfølgende nematode tab under centrifugering trin.
- Dekanter nødvendige mængde i 2 x 15 ml centrifugeringsrør (vejet på forhånd). Rør vejer at opnå faktiske volumen dispenseres, vortex forsigtigt og justere at målrette volumen ved at fjerne overskydende volumen med en 5 ml pipette (kun den sterile spids bør træde i røret).
- Fyldes op volumen til 14 ml med friske S komplet til varh nematoder. Centrifuge (1 min, 600 g). Fjern og kassér supernatanten med omhu for ikke at forstyrre nematode pillen.
- Der tilsættes 5 ml S komplet med 30 g / l E. coli OP50 til pelleteret nematoder. Overfør 5 ml i hvert rør for at en konisk glaskolbe indeholdende 15 ml S komplet med 30 g / L E. coli OP50. Notere tid nematoder blev først forsynet med mad.
- Ryst kolben forsigtigt (160 rpm), tage 9 x 10 dråber ul på mikroskopiske dias (bruge friske tips hver gang) til at tælle nematoder og bekræft gennemsnit på ca. 10 (± 2) per 10 pi.
- Placer nematode kolber i rysteinkubator ved 20 ° C, 160 rpm i 42-44 timer.
- Bestem antallet af udklækkede L1 er i kolben, holde kolben på ryste platform (160 rpm).
- Dag 7 opgave: transfer nematoder til plader med 96 brønde og initiere narkotika eksponering.
- Kombiner nematode kulturer i en enkelt kolbe, holde hvirvlende kolbe forsigtigt og læg 3 x 4 ml nematoder kultur i et 60 ml sterilt truget. Placer trug på et rystebord (160 rpm).
- Brug 8 channel pipette at udportionerer 25 ul suspenderede nematoder per brønd af 96 godt sorte mikrotiterplader med en flad gennemsigtig bund (til at tage både luminescens og fluorescens aflæsninger, eller hvide plader til luminescens kun). Dæk med plade låg og der er afsat.
- Efter opsætning af hver 2 plader, placere yderligere 2 x 2,5 ml nematoder i truget for at erstatte tabt volumen (holde et "dødt volumen" i trug på ca. 7 ml).
- Opsætning 13/14 plader med nematoder. 11 nematode plader vil være forpligtet til at teste to 96-brønds narkotika plader. Den 12. nematode plade vil blive indlæst udelukkende med bærer som en kontrol. Den 13. Pladen vil blive brugt til at etablere baggrundsfluorescens på dag 8 (se nedenfor). En ekstra plade kan være forberedt til brug bør fejltagelser forekomme under opsætning.
- Alikvote 74 ul S komplet til hver brønd og sted plade i en fugtig kammer (se materialer listen) i en rysteinkubator (20 ° C, 160 rpm) UNTil klar til alikvot testforbindelser på det forvalgte udviklingsmæssige tid (fx 45 timer 30 min efter et måltid forudsat). [Volumen pr brønd er nu 99 pi].
- Tø stof plade (r) til test.
- Brug multikanalpipette at oprette nematode plader med narkotika, skiftende tip hver gang. Tillad 5 min pr plade med 96 brønde til alikvotere lægemiddel.
- Tag 1 pi fra 1. søjle af narkotika plade og tilføje til søjlerne 1-5 af en plade, der indeholder nematoder; gentag fra 2. kolonne i stoffet plade i kolonner 8-12 af pladen indeholder nematoder. Tilsæt 1 pi køretøjet til kolonne 6 og 7 i nematode pladen.
BEMÆRK: Det totale volumen per brønd i nematoden pladen er 100 pi resulterer i en 1: 100 fortynding af forbindelse / køretøj. - Gentag processen ved tilsætning af 1 pi af 3. / 4 th kolonne af lægemidlet pladen til kolonnerne 1-5 / 8-12 i den anden nematode plade; tilføj køretøjet til kolonne 6 og 7 i nematode pladen.
- Fortsæt med at teste resterende stof plade kolonner. Opsætning mindst en nematode plade med køretøjet i alle brønde ved prøvetagning fra kolonne 12 af narkotika plade. Placer pladerne tilbage i fugtige kamre i rysteinkubator (20 ° C, 160 rpm) i 20-22 timer (se note til dag 8).
- Tag 1 pi fra 1. søjle af narkotika plade og tilføje til søjlerne 1-5 af en plade, der indeholder nematoder; gentag fra 2. kolonne i stoffet plade i kolonner 8-12 af pladen indeholder nematoder. Tilsæt 1 pi køretøjet til kolonne 6 og 7 i nematode pladen.
- Varenr forberede luminescens buffer for næste dag: tilføj DMSO og 10% Triton-X-100 til den nødvendige mængde S fuldstændigt til opnåelse af 1% DMSO og 0,15% Triton X-100. Tillad 5 ml per plade læse for luminescens, plus 1 ml til priming luminometer injektor.
- Dag 8 opgave: Læs eksperimentelle endpoints - fluorescens og bioluminescens. (GFP fluorescensaflæsninger anbefales som et middel til at normalisere bioluminescens data.)
BEMÆRK: Sigt at læse endpoints ved 66-67 timer efter mad leveres til nematoder for at forhindre betydelig afkom produktion under de eksperimentelle betingelser, der er beskrevet.- Opsæt plade til at bruge som baggrund kontrol for GFP aflæsninger. Combine godt indhold fra 13 th plade ind i en 15 ml rør. Tillad nematoder at bosætte (2-3 min). Brug supernatanten til at indlæse en mikroplade (sort med transparent nederst) med 100 pi bakteriesuspension per brønd.
- Baggrund kontrol plade observere under mikroskop bemærke ned boringer, hvor nematoder kan ses. Udelukke disse fra baggrunden estimat anvendes i efterfølgende analyse af data.
- Læs fluorescensen af hver plade med 96 brønde, herunder baggrunden kontrol. (Indstillinger: optik fra bunden af pladen, filtre 485/20 excitation; 528/20 emission.)
- Forbered buffer for luminescens aflæsninger: tilføj luciferin (20 mM) til del-fremstillet puffer (fra den foregående dag), til opnåelse af luminescens buffer med 1% DMSO (1x), 0,15% Triton-X100 (3x) og 0,3 mM luciferin (3x ). Prime luminometer injektor 6x med 150 pi luminescens buffer.
- Foregående trin antager 1% DMSO som køretøjet under narkotika eksponering. Når køretøjet er vand, justere concentration af DMSO i luminescens buffer til 3% (dvs. 3x).
- Arbejde med én plade ad gangen. Dispensere 50 pi luminescens buffer per brønd. (150 pi endelige volumen i godt, 3x fortynding af luminescens buffer: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 og 0,1 mM luciferin endelige koncentrationer.) Sted umiddelbart på ryste platform og starte timeren.
- Efter 3 min på at ryste platform (160 rpm), læse luminescens (1 sek pr måling).
- Opsæt plade til at bruge som baggrund kontrol for GFP aflæsninger. Combine godt indhold fra 13 th plade ind i en 15 ml rør. Tillad nematoder at bosætte (2-3 min). Brug supernatanten til at indlæse en mikroplade (sort med transparent nederst) med 100 pi bakteriesuspension per brønd.
4. Data Analysis
- Trække gennemsnitlige GFP baggrund læsning fra fluorescens resultater. Divider bioluminescens ved respektive GFP læsning.
- Når der registreres en høj GFP værdi for nematoder, der udsættes for en forbindelse, måle fluorescens af forbindelsen på egen hånd at tage højde for enhver forbindelse fluorescens. Hvis højere end gennemsnittet, bruge dette som baggrund i stedet.
- Express bioluminescens, GFP normaliseret bioluminescens ennd GFP-fluorescens data som en procentdel af den gennemsnitlige værdi for køretøjets styring i hver plade.
- Plot gennemsnitsværdier og fejllinjer for hver koncentration.
- Test for statistisk signifikans ved hjælp af 2-vejs variansanalyse (ANOVA) med effekter af 'Koncentration', 'Experiment', og deres interaktion (hvert datapunkt refererer til en enkelt brønd), og bruge Dunnett testen som post-hoc test (vs . køretøj kontrol).
BEMÆRK: Hvis "eksperimentet" eller de "interaktion" vilkår er betydelige, kan yderligere forsøg kræves for at bekræfte respons. Hvis der ikke variabilitet mellem forsøgene fremgår observation af data plots, kan en en-vejs ANOVA udføres på samlede data fra uafhængige forsøg.- Til den statistiske analyse af plade (r) med kun køretøj, vælge alle brønde i kolonne 6 -7 og alle brønde i række H som kontrolgruppe (disse er de holdninger rutinemæssigt tildelt køretøjet under sammensatte test).
Representative Results
Repræsentative resultater illustrerer metoden blev opnået for rotenon (figur 1), paraquat (figur 2), oxaloacetat (figur 3), og 4 forbindelser, der blev samlet op som ildflueluciferase hæmmere under screening af et lægemiddel bibliotek 13 (figur 4). Eksponeringen stof blev startet på L4 stadium i alle tilfælde, men eksponering eksperimenter paraquat blev startet ved 41 timer efter mad først leveres til nematoder i forhold til 45-46 timer for de andre forbindelser. Protokollen giver mulighed for en vis fleksibilitet i valget af tidspunkt for indledningen af lægemidlet eksponering og eksponeringen længde. Men for screening formål, der er tider bør overholdes når de er udvalgt, for reproducerbarhed mellem forsøgene. Endepunkter bør måles ved 66-67 timers udviklingsmæssige tid for at undgå omfattende æglægning og klækning af afkom i brønde. Retningslinjer for tider findes i Tstand 1.
Rotenon, en mitokondrie kompleks I-inhibitor, reducerede bioluminescens efter både relativt korte (2 timer), og længere eksponeringer (24 timers) til en række koncentrationer (figur 1). I dette tilfælde blev der ikke GFP målinger, men antallet af tekniske replikater anvendt (n = 6) er tilstrækkelig til at udjævne eventuelle forskelle i ormen tal mellem brønde 3. Den 24 timers eksponering er et vindue af tid, i hvilken nematoder vokser, og langsommere udvikling som et resultat af komplekse jeg hæmning blev forventes at bidrage til faldet i bioluminescens. Dette blev bekræftet ved visuel observation under stereoskop med forsinket udvikling set, især ved koncentrationer på 20 uM og derover; derudover nogle letalitet blev bemærket fra 40 pM (kvalitative observationer ikke kvantificeret). Ingen letalitet blev observeret efter 2 timers udsættelse, men effekter på orm bevægelse blev set. En skarp nedgang i bioluminescens i forhold til kontrol occurred ved den laveste koncentration af rotenon testede 2,5 uM, for hvilke effekter ikke var let afsløres ved hurtig visuel observation ved 2 timers udsættelse. Denne nedgang i bioluminescens er i overensstemmelse med reduceret cellulær ATP. Maksimal hæmning blev opnået med den laveste koncentration af rotenon anvendte (2,5 uM) indikerer, at alle efterfølgende eksperimenter specifikt er rettet mod rotenon skal udføres mellem 0 og 5 uM [koncentrationsområdet 0-160 uM blev valgt som en del af en sammenligning med andre lægemidler oprindeligt identificeret som havende signifikante virkninger ved 10 uM (offentliggøres andre steder)].
Herbicidet paraquat påvirker mitokondrisk funktion gennem forøgelse af reaktive oxygenarter. Her vil vi vise sin virkning på bioluminescens C. elegans stammen PE254 efter udsættelse for en række koncentrationer i 24 timer (figur 2). Som stammen bærer en luc :: GFP-fusion, GFP-fluorescens var also måles som et middel til normalisering. 6,9 Paraquat faldt bioluminescens, GFP-fluorescens og normaliseret bioluminescens betydeligt. Den Dunnet post-hoc test viste, at koncentrationerne af paraquat med betydelige forskelle i forhold til køretøjets styring var 4 og 8 mm for bioluminescens og normaliseret bioluminescens, samt 2 mM for normaliseret bioluminescens. Det eneste koncentration markant nedsættelse GFP-fluorescens var 8 mm, en koncentration, ved hvilken vækst effekter og lejlighedsvis døde orm blev set (kvalitative observationer). Faldet i bioluminescens (og normaliseret bioluminescens) var større end den af fluorescens, i overensstemmelse med nedsat mitokondriefunktion og virkninger på ATP-produktion.
Citronsyrecyklus mellemliggende oxalacetat testet på C. elegans stammen PE254 ved en enkelt koncentration på 8 mm, førte til en stigning i bioluminescens (figur 3). Ingen GFP fluorescererNCE målinger blev opnået eller yderligere visuel observation udført; dog sådan reaktion på en enkelt koncentration fortjener yderligere bekræftende eksponering for en række koncentrationer, og mere detaljerede observationer af effekter. En forøgelse af bioluminescens af denne forbindelse er ikke overraskende, da det kan postuleres at føre til øget aktivitet af citronsyre cyklus med i sidste ende større produktion af ATP (men det ville være tilrådeligt at kontrollere for eventuelle virkninger på luciferase niveauer ved at vurdere GFP-fluorescens i efterfølgende eksperimenter). Oxalacetat datasæt vist afslører omfanget af variation i respons ses i luciferase baseret eksperimenter. Det er vores erfaring denne variation er en funktion i testsystemet især for betingelser mindre skadelige eksponering.
Den ildflueluciferase hæmmende forbindelser DDD00001434 blev DDD0001477, DDD00000635 og DDD00023047 testet både in vitro ved at se på effekter på purified enzym og in vivo ved anvendelse af C. elegans luc: GFP udtrykke stamme. Der var ingen tegn på, at nogen af de testede forbindelser forårsagede nematode død under forhold for eksponering. Alle 4 forbindelser påvirkede luciferaseaktivitet in vitro ved de 2 testede koncentrationer 25 og 100 pM (figur 4A). DDD00001434 dræbte aktiviteten af det rensede luciferase næsten helt, som gav en troværdig begrundelse for den store nedgang i in vivo bioluminescens (figur 4B). Selv om in vitro og in vivo assays er ikke direkte sammenlignelige, responsen på DDD00023047 var ens i begge analyser. DDD0001477 og DDD00000635 forårsagede en større nedgang i vivo end i in vitro. Disse forbindelser blev leveret til de levende orme 22 timer forud for luciferin substrat, og resultater kan afspejle, at de ikke var let forskudt fra luciferase aktive websted, når luciferin blev avaietiket. Alternativt kan DDD0001477 og DDD00000635 har en yderligere effekt på cellulære ATP niveauer. Dette vil skulle vurderes af midler, der ikke involverer ildflueluciferase. Notatet var den stærke forøgelse af GFP signal i levende orme udsat for sammensatte DDD00000635. Dette vil blive diskuteret nedenfor.
Figur 1. mitochondrial kompleks I inhibitor rotenon faldt energien status C. elegans målt ved bioluminescens af stamme PE254. Synchronized L4 fase orme (45-46 timer efter indtagelse af mad leveres til L1 larver) eksponeret for 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 og 160 uM rotenon i 1% DMSO for 2 hr (korte) eller 24 timer (lang eksponering) tidligere aflæsninger af bioluminescens henholdsvis 48 og 69 timer af ormen udvikling efter mad forudsat. Bioluminescens (unit relative lysenheder, RLU) blev udtrykt som en procentdel af køretøjets (1% DMSO) værdier. Fejlsøjler skildrer SEM af tekniske gentagelser ved hver koncentration rotenon (n = 6). Alle testede koncentrationer resulterede i en statistisk højsignifikant forskel i forhold til vehikelkontrol (p <0,001).
Figur 2. Den oxidative stressfaktor paraquat faldt energien status C. elegans stamme PE254 på en koncentrationsafhængig måde (målt ved bioluminescens). Synchronized L4 stage orme (for nemheds skyld i dette tilfælde ved 41 timer efter et måltid leveres til L1 larver) blev eksponeret til 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 eller 8 mM paraquat i 24 timer. GFP-fluorescens (enhed Relative fluorescensenheder, RFU) blev brugt til at normalisere bioluminescens data (enhed RLU), begge endepunkter opnået ved 65 timers udvikling. Data er udtrykt som en procentdel af kontrol (1% DMSO). Fejlsøjler skildrer SEM af tekniske gentagelser(n = 5 for forskellige koncentrationer; n = 18 for kontrollen). En-vejs ANOVA: *** p <0,001 i forhold til køretøjets kontrol.
Figur 3. citronsyre cyklus mellemprodukt oxalacetat (8 mM) forbedret bioluminescens C. elegans stammen PE254. synkroniseret L4 fase orme (45-46 timer efter mad leveres til L1 larver) blev udsat for frisklavet 8 mM oxaloacetat i 18 timer ± 30 minutter. Bioluminescens (enhed RLU) blev aflæst ved en udviklingsmæssig cirka 63,5 timer ± 1 time, og blev udtrykt som en procentdel af vehikelkontrol (Hedeselskabet 2 O). Forskellige kolonner repræsenterer forskellige datasæt af 8 tekniske replikater tildelt til forskellige 96-brønds plader i det samme eksperiment. Fejlsøjler skildrer SEM af tekniske replikater (n = 8). 2 vejs-ANOVA med "sæt" og "koncentration" som faktorer: ̵6 Set 'p> 0,05, "koncentration" p <0,001 og interaktion sigt p> 0,05.
En 
B 
Figur 4. Test af reaktioner på 4 forbindelser fra Dundee lægemiddelforskning stofbibliotek 13 (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 og C4: DDD00023047) med kendt hæmmende aktivitet på ildflueluciferase luminescens. (A) Effekt af forbindelser på aktiviteten af renset ildflue-luciferase (målt som lysenheder, RLU), udtrykt som en procentdel af vehikelkontrol. ATP bioluminescens CLSII kit (Roche, Manheim, Tyskland) blev anvendt i henhold til vejledningen med den samme mængde luciferaseenzymet alikvoteret til brønde (hvid 96-wEll mikrotiterplader). ATP blev tilvejebragt ved en slutkoncentration på 10 uM og 1 pi af forbindelse (slutkoncentration angivet) eller DMSO (1%) blev tilsat. Luminescence signal blev integreret i 10 sek. Fejlsøjler skildrer SEM af tekniske replikater (n = 4). Analyse: En-vejs ANOVA; * p <0,05 eller *** p <0,001 i forhold til køretøjets kontrol. Forskelle mellem 25 og 100 um højsignifikante for C1 (DDD00001434; p <0,001), og signifikant for C2 og C3 (hhv DDD0001477 og DDD00000635; p <0,05). (B) In vivo målinger af bioluminescens, bioluminescens normaliseret til GFP-fluorescens og GFP-fluorescens C. elegans stammen PE254 ved 67 timers udviklingsmæssige tid efter udsættelse for testforbindelser i 22 timer. Fejlsøjler skildrer SEM af tekniske replikater (n = 8). Statistisk analyse (En måde-ANOVA) udført på poolede data fra 3 datasæt (3 Xn = 8). * p <0,05 eller *** p <0,001 i forhold til respektive vehikelkontrol. Differences mellem 25 og 100 uM kun statistisk signifikant (p <0,05) for normaliseret bioluminescens efter eksponering for C4 (DDD00023047).
| Tid på dagen | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | Dag 7 | Dag 8 |
| 9-10 | Trin 5 | |||||||
| 10-11 | Trin 5 | |||||||
| 11-12 | Trin 4 | Trin 5 | ||||||
| 12-13 | Trin 4 | |||||||
| 13-14 | ||||||||
| 14-15 | ||||||||
| 15-16 | ||||||||
| 16-17 | Trin 1 | Trin 3 | ||||||
| 17-18 | ||||||||
| 18-19 | Trin 2 |
Tabel 1. Oversigt over protokol skridt, der skal udføres på hver dag af nematoder eksperimenter (afsnit 3), og foreslog tider.
Discussion
Modelorganismen C. elegans giver et stærkt eksperimentelt system. Det er let at dyrke og producerer rigelige genetisk identisk afkom med en 3,5 dagen livscyklus fra æg til voksen gengivelse (via juvenile larvestadier L1 til L4 til). På grund af sin lille størrelse, kan det være hensigtsmæssigt dyrket i 96-brønds plader, hvilket letter forbindelse screening. Vi præsenterer en fænotypisk screening protokol baseret på stammer af C. elegans, der fungerer som in vivo sensorer energiniveauer. 14 Protokollen gælder for alle laboratorier, selv om der kræves en 96-brønds plade luminometer og en steril kabinet. Det er vigtigt at undgå forurening i assays ved anvendelse af god laboratorieteknik. Hvis arbejdet manuelt, det maksimale antal nematoder plader opnåelige er 13 per forsøg tillader afprøvning af 2x 96-brønds plader narkotika og med to køretøjer plader. Repræsentative resultater er præsenteret for mitokondrie kompleks I inhibitoren rotenone, superoxid generator paraquat, citronsyrecyklus mellemliggende oxalacetat og fire forbindelser med kendt ildflueluciferase inhiberende aktivitet. De første to forbindelser førte til et fald i bioluminescens som forudsagt mens oxaloacetat førte til en forbedring, sandsynligvis resultere af større generation af ATP. Oxalacetat datasæt viser også den iboende variabilitet i eksperimenter baseret på ildflueluciferase som en reporter. Mindst tre uafhængige forsøg er tilrådeligt at fastslå robusthed af svarene til ukendte forbindelser.
Inhibering af ildflue-luciferase-aktivitet blev identificeres med et in vitro assay ved anvendelse af et kommercielt kit. 3 en af forbindelserne resulterede i en betydelig stigning i GFP-fluorescens i overensstemmelse med inhibitoren øge niveauet af GFP-mærkede ildflueluciferase ved binding til luciferase enzymets aktive site, og gøre det mere stabilt. 15 I nogle tilfælde(ikke i dette tilfælde) kan føre til øgede niveauer af bioluminescens, når inhibitoren fortrænges af overskud af substrat. 15 Det er derfor vigtigt ikke at fortolke resultater fejlagtigt ud fra forbindelser, der interagerer med ildflue enzym som nedsat eller forøget ATP-niveauer / mitokondriefunktionen. Ændringer i luminescenssignal ganske ofte korrelerer med yderligere målinger af sundhed, såsom bevægelse, udvikling og vækst. Som et eksempel, en forbindelse er en mistænkt luciferase-hæmmer, hvis en dramatisk nedgang i bioluminescens signal findes, men er orme er ikke skelnes fra kontroller ved mikroskopisk observation. En stigning i GFP-fluorescens, kan ikke forklares med vækst eller forbindelse autofluorescens, kan også pege på en inhibitor. En række luciferase hæmmere 15 er kendt og er blevet indgået pubchem. Derfor vil der i første omgang, er det god praksis at konsultere oplysninger om luciferase inhibitorer, som pubchem; efterfulgt af tsante af sammensatte effekter i in vitro-assays med det oprensede enzym 3 og / eller bekræftelse af virkningerne på mitokondriefunktion ved yderligere midler. 16,17
GFP-fluorescens målinger muliggøre påvisning af ildflue luciferase niveauer (og den potentielle opdagelse af nogle luciferaseenzymet hæmmere som diskuteret ovenfor), hvilket gør en stærk sag til måling dette endepunkt sammen bioluminescens hvor det er muligt. Normalisering af bioluminescens aflæsninger til GFP er også et middel til regnskabsmæssig behandling af variationer i orm tal mellem brønde (selv om dette også kan opnås ved inklusion af flere tekniske gentagelser). For større følsomhed, er det vigtigt at trække baggrundsfluorescens fra aflæsninger. Protokollen vurderer bidrag bakteriesuspensionen til baggrunden fluorescens, men nematode autofluorescens ikke tegnede sig for (en begrænsning af den aktuelle analyse, særlig kritisk for enhver aldrende studør givet at nematode autofluorescens stiger med alderen). Autofluorescens af testforbindelser bør også vurderes parallelt. GFP normalisering synes uundværlig hvor forskere ønsker at tilpasse protokol til at sammenligne cellulære ATP puljer i forskellige genetiske mutanter eller efter tavshed af forskellige gener, for at styre for eventuelle strain forskelle på niveauet af ekspressionen af bioluminescens transgen.
Kritiske parametre i protokollen omfatter udviklingsmæssige stadium, hvor eksponeringen initieres, længden af eksponeringen, og opnåelse af et tilsvarende antal nematoder i forskellige brønde. Eksponering kan starte på noget tidspunkt i udviklingen af nematoder, men L3 fase eller ældre er at foretrække. Fra dette tidspunkt på, nematoder afhængige af oxidativ fosforylering til udvikling ind i voksenalderen, hvilket fremgår af en meget betydelig stigning i mtDNA indhold, iltforbrug og ATP-niveauer. 18,19,20 Denne protokol indleder udstillingerure på L4 fase. Årsagen til alikvotere nematoder til 96 brønde kun på dette tidspunkt (i stedet for når de først var forsynet med mad på L1 fase), er, at selv om pladerne placeres i fugtige kamre for at minimere fordampning, en grad af fordampning stadig forekommer i vores rysteinkubator, betragtes som meget små dråber, som dannes på lågene (kan ikke være et problem med andre rystende væksthuse). Ved alikvotere nematoder til plader lige før tilsætning af narkotika standarder, er den faktiske koncentration lægemidlet ikke påvirkes af enhver lille variation i volumen på grund af fordampning. Indlæsning af en nematode plade med køretøjet alene er nyttigt at kontrollere, at nematoder jævnt fordelte mellem brønde. Eventuelle væsentlige forskelle fundet for køretøjet kun pladen ville være tegn på dårlig teknik i dispensering nematoderne til brønde.
Længden af eksponering er en vigtig faktor til at overveje. Hvis virkninger på energi status uafhængigt af væksten er af interesse, proprotokol kan ændres til at rumme kortere eksponeringer (fra næsten øjeblikkelige svar på for eksempel 2 timer). På den anden side, optagelse af forbindelser i C. elegans væv kan tage noget tid. For eksempel 12-24 timer er nødvendige for at opnå maksimale interne koncentrationer af resveratrol og 5-fluor-2'-deoxyuridin (FUDR). 21. Derfor kan en længere eksponering (18 til 24 timer) være berettiget til at maksimere eksponeringsniveauer. Eksponeringstiden bør begrænses til tider, der ikke tillader signifikante niveauer af reproduktion at finde sted i brønden. Vi anbefaler, at den samlede udviklingsmæssige tid af nematoder holdes under 66-67 timer. Selvom praktisk, er nematoder den drægtige ved derefter, og har indledt egglaying. Vi fandt alligevel bioluminescens aflæsninger fra æg forberedelser til at være ubetydelig (ikke vist). Den sur-5-promotor drevne transgenekspression er først opdaget to til to og en halv timer efter befrugtningen på 100 celletrin 22 og Chitinous æggeskal vil kunne begrænse indtrængen af luciferin. Andre har fundet, at befrugtede æg ikke bidrog væsentligt til metabolisme drægtige voksne. 23. Dog betingelser giver mulighed for betydelige afkom produktion skal undgås. Hvis man foretrækker, kan den eksperimentelle tidsskala forskydes tilbage: Vi har tidligere igangsat udsættelse for en miljømæssig toksin på det sene L3 larvestadiet (36 timer) og udført bioluminescens og GFP målinger ved 55 t 2 Alternativt genetiske baggrunde, der er betinget sterile. kan anvendes til at forhindre afkom produktion, som for eksempel fer-15 (B16) II; five-1 (hc17) IV dobbelt mutant, som kan opretholdes ved 15 ° C, men er sterilt ved 25 ° C. 24. Anvendelse af FUDR at inducere sterilitet anbefales ikke, da dette i sig selv kan påvirke nematode metabolisme. 25 Assayet kunne også udføres i stammer med mere permeable neglebånd såsom delvis tab af-funktionion bus-8 mutanter som er multidrug-følsomme på grund af øget permeabilitet af narkotika. 26. Dette vil lette kortere eksponeringer og lavere sammensatte koncentrationer. Betingelserne for at tilføje luciferin til disse nematoder kan også være nødvendigt at justere dvs 1% DMSO og 0,05% Triton-X100 i luminescens bufferen ikke være forpligtet til at forbedre luciferin tilgængelighed.
Protokollen anvender 1% DMSO som køretøjet for forbindelse levering. Selvom det ikke er dødelig, denne koncentration af DMSO har nogle biologiske virkninger, som vi har diskuteret i en tidligere publikation. 3 Mange af de tilgængelige lægemidler biblioteker fremstilles i 100% DMSO, ved koncentrationer, som vil være egnet til cellebaserede assays efter fortynding af køretøjet til 0,1%. Højere sammensatte koncentrationer nødvendige for at fremkalde reaktioner i C. elegans sammenlignet med humane celler, således at det ofte ikke er muligt at gennemføre assays på mindre end 1% DMSO. Igen, anvendelsen af stammer medmere permeable neglebånd kan føre til testning med lavere koncentrationer af køretøjet. Koncentrationer af DMSO højere end 1% anbefales ikke.
Et sæt inkubationstid med luciferin før aflæsninger skal overholdes. Som tidligere vist, luminescens når sin maksimale niveauer i det andet minut efter tilsætning luciferin, forbliver relativt stabil i de første 5 minutter, efterfulgt af en langsom gradvist fald i luminescens løbet af de næste 30 minutter 1. Kinetiske reaktioner på et bestemt kemikalie kan udføres i løbet af denne første fase af 30 minutter efter første dosering af luciferin.
Protokollen indebærer en sult skridt efter indsamling af æg for at opnå synkronisering af nematoden befolkning. Vi anbefaler synkronisering af nematodeforsøget populationer da forskellige udviklingsstadier afviger i cellulære ATP-niveauer og kan reagere forskelligt på testforbindelserne. Ved at udføre sult i S kompletmedium i modsætning til M9, er skraveringen nematoder forsynet med en carbonkilde (ethanol), således at larverne ikke udvikler, men er ikke helt udsultes. 27,28 Det er også blevet vist, at standset L1 s er primet for hurtig reaktion på fødevarer og normal L1 vækstrate opnås inden 3 timer efter et måltid bliver tilgængelig. 29 Men det muligheden for, at sult trin kan ændre metabolismen af C. elegans kan ikke udelukkes. 30 Af denne grund længden af sult bør ikke overstige 24 timer (18 timer er tilstrækkelig til synkronisering). Visse laboratorier kan have mulighed for at bruge en Copas Biosorter for alder synkronisering uden om sult skridt helt. Andre laboratorier kan har en præference for at udvide nematode befolkning på faste medier (NGM plader med OP50) før blegning (trin 3.1), og dette vil fungere godt også. Vi bruger S mediet under sammensatte eksponering som en standard medium for nematode dyrkning, However kan vælges andre medier, for eksempel K medium eller EPA moderat hårdt vand er ofte brugt til økotoksikologiske undersøgelser. 31,32
Protokollen giver et middel til at screene og identificere kandidater til yderligere test i form af virkningerne på mitokondriefunktionen. På tidspunktet for den primære screening er det sandsynligt, at nogle forbindelser vil være blevet nået på grund af kun én koncentration, der testes, således lægemiddelscreeninger bør ikke betragtes som udtømmende. Hits kan valideres ved brug af teknikker til vurdering forskellige aspekter af mitokondrie-funktion for eksempel iltforbrug, C. elegans stammer med GFP udtrykke mitokondrier, pletter for mitokondriemembranpotentiale og / eller ROS målinger. 16,33,34 den største betydning af metoden er at have et middel til screening af store antal forbindelser og / eller betingelser på flercellede organismal plan, og vigtigere at være i stand til at drage fordel af the genetisk sporbarhed C. elegans at undersøge virkningsmekanismer. Teknikken kan bidrage til at fremskynde og finde nye veje til opdagelsen af interessante forbindelser og mål. Det forudses, at kombinationen af føleren med genetiske baggrunde forbundet med human sygdom til screening af sammensatte biblioteker i en sygdom relevant sammenhæng vil have meget at tilbyde.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
| Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
| Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15 ml tubes) | |
| Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
| Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
| Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
| Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
| Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
| Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
| 0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
| Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
| Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
| Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
| Reservoir reagent 60 ml | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1 |
| Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
| Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4 °C, seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
| D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
| DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
| Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH2O |
| Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
| C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
| E. coli OP50 | CGC | ||
| General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |
References
- Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans. BMC Physiol. 8, 7 (2008).
- Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor. Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).
- McLaggan, D., et al. Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor. PloS one. 7, e46503 (2012).
- Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells. Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).
- Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
- Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans. Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).
- Leung, M. C., et al. Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).
- Kuang, J. J., Ebert, P. R. The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism. Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).
- Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors. FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Brenk, R., et al. Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases. ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).
- Lagido, C. Nematodes as environmental indicators. Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. , CABI. 225-251 (2009).
- Thorne, N., et al. Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter. Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).
- Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497, 451-457 (2013).
- Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Pharmacological approaches to restore mitochondrial function. Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).
- Tsang, W. Y., Lemire, B. D. Mitochondrial genome content is regulated during nematode development. Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).
- Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans. Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).
- Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
- Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods. PloS one. 8, e56877 (2013).
- Yochem, J., Gu, T., Han, M. A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis. Genetics. 149, 1323-1334 (1998).
- Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans. J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev Biol. 317, 549-559 (2008).
- Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae. PloS one. 7, (2012).
- Baugh, L. R. To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest. Genetics. 194, 539-555 (2013).
- Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest. Science. 324, 92-94 (2009).
- Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans. Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).
- Cressman, C. P., Williams, P. L. Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media. Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).
- Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media. Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).
- Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response. Genetics. 174, 229-239 (2006).
- Yang, W., Hekimi, S. A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans. Plos Biol. 8, (2010).
