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Bioengineering

जोड़ उपास्थिकोशिका संस्कृति और उपास्थि पीढ़ी के लिए 3 डी हाइड्रोजेल Scaffolds

doi: 10.3791/53085 Published: October 7, 2015
* These authors contributed equally

Protocol

सभी प्रयोगों स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय मानव विषयों के दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन और संस्थागत समीक्षा बोर्ड प्रोटोकॉल अनुमोदित किया गया।

1. जोड़ उपास्थिकोशिका अलगाव

  1. कुल घुटने संधिसंधान दौरान खारिज कर दिया ऊतक से उपास्थि प्राप्त करते हैं और पहले से 8 वर्णित के रूप में काटना।
  2. दिखने में चिकनी सतहों के लिए उपास्थि नमूनों की औसत दर्जे का या पार्श्व ऊरु condyles चयन और subchondral हड्डी को प्रभावित किए बिना 4-5 मिमी उपास्थि बायोप्सी हटाने के क्रम में एक छुरी के माध्यम से उपास्थि की सतह पर चीरा बनाते हैं।
  3. शुद्ध कोलैजिनेज़ साथ हे / एन उपचार के साथ ऊतक के enzymatic हदबंदी द्वारा बाह्य मैट्रिक्स से chondrocytes अलग। 37 डिग्री सेल्सियस पर उपास्थिकोशिका विकास मीडिया में कोलेजिनेस द्वितीय (125 यू / एमएल) और कोलेजिनेस चतुर्थ (160 यू / एमएल) का अनुपात 1: 1 का प्रयोग करें।
  4. अगले दिन, एक 70 के माध्यम से अलग कोशिकाओं से युक्त पचा ऊतक को फ़िल्टरमिमी आकार नायलॉन जाल ताकना। 5 मिनट के लिए 600 XG पर DMEM / F12 और सेंट्रीफ्यूज के 20 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं।
  5. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक DMEM / F12 में फिर से निलंबन, 25 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बेट, 2 मिमी एल glutamine, antimicrobials निम्नलिखित 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / 60 मिमी संस्कृति डिश के घनत्व पर पृथक chondrocytes प्लेट (100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.25 माइक्रोग्राम / एमएल fungizone)। प्रायर biomimetic हाइड्रोजेल में encapsulation के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों रखें और एक उच्च-घनत्व monolayer के रूप में प्राथमिक उपास्थिकोशिका संस्कृतियों को बनाए रखने।

2. Biomimetic हाइड्रोजेल निर्माण

नोट: इस विधि की अनुमति देता पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल diacrylate) (PEGDA, मेगावाट 5000 ग्राम / तिल), DPBS में chondroitin सल्फेट-मेथाक्रिलेट (सीएस-एमए) युक्त एक biomimetic हाइड्रोजेल के संश्लेषण। photoinitiator के अलावा photoactivated तिर्यक सक्षम बनाता है। अंतिम हाइड्रोजेल रचना 7% का वजन होता हैटी / मात्रा (w / v) PEGDA की, 3% सीएस-एमए की वी / डब्ल्यू, और photoinitiator के वी डब्ल्यू / 0.05%।

  1. मेथाक्रिलेट समूहों के साथ सीएस बहुलक functionalizing द्वारा सीएस एमए synthesize।
    1. एमईएस के 1.952 ग्राम और विआयनीकृत पानी की 200 मिलीलीटर में सोडियम क्लोराइड की 5.84 ग्राम (Dih 2 ओ) भंग द्वारा 50 मिमी 2-morpholinoethanesulfonic एसिड (एमईएस) और 0.5 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl) के बफर समाधान तैयार है। बफर समाधान में chondroitin सल्फेट सोडियम नमक के 5 ग्राम भंग।
    2. (: ईडीसी = 1: 2 एनएचएस की दाढ़ अनुपात) के लिए 0.532 ग्राम (4.62 mmol) एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) और 1.771 ग्राम (9.24 mmol) 1-इथाइल-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी) जोड़ें 5 मिनट के लिए समाधान और हलचल।
    3. समाधान के लिए और 24 घंटे के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया बनाए रखने (: 2: 1: ईडीसी: AEMA = 1 एनएचएस की दाढ़ अनुपात) 0.765 ग्राम (4.62 mmol) 2-aminoethyl मेथाक्रिलेट (AEMA) जोड़ें।
    4. डायलिसिस ट्यूबिंग (12-14 केडीए MWCO) का उपयोग 4 दिनों के लिए विआयनीकृत पानी के खिलाफ डायलिसिस (Dih 2 ओ) द्वारा मिश्रण शुद्ध।
    5. पी फ़िल्टरएक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम urified समाधान और desiccator और वैक्यूम हे / एन में समाधान युक्त खुला ट्यूबों की जगह। सभी ट्यूबों प्रकाश से संरक्षित कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। प्रकाश और नमी से सुरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर भंग बहुलक स्टोर।

3. सेल संपुटीकरण

  1. (सेल से लदी 3 डी हाइड्रोजेल बाहर छिद्रण के लिए) पीसीआर फिल्म और बेलनाकार छड़ आटोक्लेव और पराबैंगनी प्रकाश के तहत टिशू कल्चर हुड में 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर्ड 70% इथेनॉल में डुबकी द्वारा कस्टम बनाया बेलनाकार जेल ढालना बाँझ।
  2. हवा के बुलबुले या लीक को रोकने के अंतराल के बिना autoclaved पीसीआर फिल्म के साथ जेल आचारण के नीचे सील। एक बाँझ 150 मिमी प्लेट में रखें।
  3. प्रायर biomimetic हाइड्रोजेल में सेल encapsulation के दिन, कोलेजिनेस द्वितीय में हे / एन उपचार और कोलेजिनेस चतुर्थ समाधान के साथ उच्च-घनत्व उपास्थिकोशिका monolayer अलग कर देना। कोलेजिनेस छठी प्रत्येक उपास्थिकोशिका विकास में मीडिया के लिए कोलेजिनेस द्वितीय के लिए 125 यू / एमएल और 160 यू / एमएल का प्रयोग करें37 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब ले लो और जोड़ने के 5% वजन / मात्रा (डब्ल्यू / वी) पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल diacrylate) (PEGDA, मेगावाट = 5000 ग्राम / तिल), डब्ल्यू 3% / वी chondroitin सल्फेट-मेथाक्रिलेट (सीएस-एमए), और DPBS में वी photoinitiator w / 0.05%। समाधान मिश्रण और अलग रखने के लिए यह ट्यूब भंवर। प्रकाश से ट्यूब को सुरक्षित रखें।
  5. एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में अलग कोशिकाओं लीजिए 5 मिनट के लिए 460 XG पर गिनती और सेंट्रीफ्यूज। महाप्राण सभी कोशिकाओं ट्यूब से मीडिया और 15 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए ऊपर मिश्रित सामग्री जेल जोड़ें। हवा से बचने के गठन के बुलबुले, जबकि 30 बार इसे अच्छी तरह से मिलाएं।
  6. पिपेट 72 कस्टम बनाया बेलनाकार जेल मोल्ड में सेल-हाइड्रोजेल निलंबन या अकेले हाइड्रोजेल की μl और 5 मिनट के लिए 3 मेगावाट / 2 मीटर पर पराबैंगनी प्रकाश (365 एनएम तरंगदैर्ध्य) से संपर्क के माध्यम जमाना प्रेरित। कोई सेल सामग्री के साथ कुछ हाइड्रोजेल समाधान तैयार है। भविष्य जैव रासायनिक और यांत्रिक परीक्षण के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इन निर्माणों का प्रयोग करें। Measuएक यूवी तीव्रता मीटर के साथ पराबैंगनी प्रकाश की तीव्रता रहे हैं। तीव्रता को समायोजित करने के लिए, यूवी प्रकाश स्रोत और जमाना दौरान हाइड्रोजेल पाड़ के बीच की दूरी बदल जाते हैं।
    नोट: हाइड्रोजेल सीएस होता है, अकोशिकीय योगदान केवल सेलुलर भूमिकाः का प्रतिनिधित्व करने के लिए सेल से लदी हाइड्रोजेल के जैव रासायनिक भूमिकाः सामग्री से घटाया जाता है।
  7. बंद आसान छील के लिए फिल्म में कटौती करने के लिए एक छुरी का प्रयोग करें और इसे ध्यान से हटा दें। बेलनाकार छड़ की मदद से, unpolymerized जेल और ढीली कोशिकाओं को धोने के लिए बाँझ DPBS के 5 मिलीलीटर के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली में जेल से बाहर धक्का।
  8. संस्कृति में अच्छी तरह से प्रत्येक में उपास्थिकोशिका विकास मीडिया के 1.5 मिलीग्राम से युक्त 24 अच्छी तरह से प्लेट में सेल से लदी हाइड्रोजेल। कुएं में धोया हाइड्रोजेल हस्तांतरण करने के लिए एक डिस्पोजेबल रंग का प्रयोग करें।
  9. एक व्यवहार्यता / cytotoxity किट का उपयोग लाइव मृत धुंधला 24 घंटा के बाद encapsulation के द्वारा सेल व्यवहार्यता का आकलन करें। संस्कृति ताजा उपास्थिकोशिका gro के बदलते 3-6 सप्ताह के लिए सेल से लदी हाइड्रोजेल और खाली हाइड्रोजेलहर 2 दिन विश्लेषण के लिए कटाई से पहले मीडिया wth।

4. शाही सेना निकालना और जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण

  1. ध्यान से मीडिया महाप्राण और सेल से लदी के साथ ही खाली नियंत्रण हाइड्रोजेल पर बाँझ पीबीएस 1X डाल दिया।
  2. एक बाँझ रंग की मदद से, एक साफ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब करने के लिए प्रत्येक हाइड्रोजेल हस्तांतरण और प्रत्येक ट्यूब त्रिकोणीय अभिकर्मक के 250 μl जोड़ें। शाही सेना को अलग करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  3. शाही सेना अलगाव और मात्रा का ठहराव उपयोग प्रत्येक नमूने से इसके बारे में एक माइक्रोग्राम और बाद उच्च क्षमता सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग सीडीएनए में एक उलट प्रतिलेखन प्रदर्शन करते हैं।
  4. मात्रात्मक पीसीआर के लिए अपने हित के जीनों की अभिव्यक्ति की परीक्षा के लिए TaqMan जीन एक्सप्रेशन सारणियों का उपयोग करें। GAPDH करने के लिए आंतरिक रूप से जीन अभिव्यक्ति का स्तर सामान्य।
  5. पीसीआर की स्थिति के लिए एक 10 के द्वारा पीछा uracil डीएनए glycosylase के साथ पिछले amplicons निष्क्रिय करने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर एक 2 मिनट ऊष्मायन शामिल60, 95 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन मिनट Taq पोलीमरेज़ सक्रिय करने के लिए। फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड से मिलकर पीसीआर के चालीस चक्र, प्रदर्शन, और 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट।

5. बायोकेमिकल विश्लेषण

  1. प्रत्येक कोशिका-हाइड्रोजेल निर्माणों के लिए डीएनए और पालन के रूप में सल्फेटकृत ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन (sGAG) उत्पादन यों।
  2. ध्यान से मीडिया महाप्राण और सेल से लदी के साथ ही खाली नियंत्रण हाइड्रोजेल पर बाँझ पीबीएस 1X डाल दिया। एक खाली ट्यूब वजन और टिशू पेपर पर यह सोख्ता के बाद अंदर हाइड्रोजेल डाल दिया और हाइड्रोजेल का वजन या गीला वजन रिकॉर्ड।
  3. Enzymatic पाचन के लिए एक अलग 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक हाइड्रोजेल रुक और बाद में (भूमिकाः के लिए) (डीएनए के लिए) Picogreen परख और डाइमिथाइल-Methylene नीले परख चलाने के लिए पचा उत्पाद के एक विभाज्य का उपयोग करें।
  4. हाइड्रोजेल के enzymatic पाचन के लिए papainase समाधान तैयार है।
    1. सबसे पहले सोडियम phosphat की 7.1 ग्राम वजन द्वारा PBE बफर तैयारई द्विक्षारकीय (ना 2 HPO 4) और ethylenediaminetetraacetic एसिड Disodium नमक (EDTA-ना 2) के 1.6 छ। , DH 2 हे की 500 मिलीलीटर में भंग 6.5 पीएच को समायोजित करने और एक 0.22 मिमी फिल्टर के माध्यम से शुद्ध समाधान फ़िल्टर।
    2. PBE बफर के 20 मिलीलीटर में एल सिस्टीन की 0.035 ग्राम भंग। समाधान और बाँझ papain एंजाइम के 100 μl फ़िल्टर।
  5. तैयार assays के प्रदर्शन करने के लिए करते हैं, -20 डिग्री सेल्सियस से ट्यूबों ले और जमे हुए हाइड्रोजेल करने के लिए तैयार papain समाधान के 300 μl जोड़ें। एक मोर्टार और मूसल के साथ जेल को कुचलने और मोटर मूसल के साथ अच्छी तरह से मिश्रण।
  6. अतिरिक्त papain समाधान के साथ 500 μl मात्रा लाओ। नियंत्रण जैल के लिए एक ही प्रक्रिया को पूरा करें। 16 घंटा 3,9 के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पच हाइड्रोजेल युक्त समाधान इसलिए डीएनए और झूठ मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। निर्माता के जनसंपर्क निम्न मानक के रूप में लैम्ब्डा फेज डीएनए के साथ Picogreen परख का उपयोग डीएनए सामग्री को मापनेotocol।
  7. 1,9-dimethylmethylene नीला (DMMB) मानक के रूप में 10 शार्क chondroitin सल्फेट के साथ डाई बाध्यकारी परख का उपयोग सल्फेटकृत-भूमिकाः सामग्री को यों। इसी गीला वजन के लिए भूमिकाः की राशि को विभाजित करके भूमिकाः सामग्री का निर्धारण।

6. यांत्रिक परीक्षण

  1. एक 10 एन लोड सेल के साथ लगे एक Instron 5944 परीक्षण प्रणाली का उपयोग करते हुए गैरपरिरूद्ध संपीड़न परीक्षण प्रदर्शन करते हैं।
    1. इन विट्रो संस्कृति के वांछित दिनों के बाद, सेल-हाइड्रोजेल पाड़ और अकोशिकीय नियंत्रण हाइड्रोजेल पर संपीड़न परीक्षण प्रदर्शन करते हैं।
    2. आरटी पर एक पीबीएस स्नान में नमूनों डूब और लदान शर्त के तहत उपास्थि ऊतक द्वारा अनुभवी शारीरिक तनाव के बाद से 15% 11,12 की एक अधिकतम तनाव को 1% तनाव / सेकंड की दर से सेक 10-20% होने की सूचना दी गई है 13,14।
  2. एक तीसरे क्रम बहुपद समीकरण का उपयोग तनाव घटता है और वक्र फिट बनाम तनाव पैदा करते हैं। Compr का निर्धारण करें15% के तनाव मूल्यों पर वक्र फिट समीकरण से essive स्पर्श करने मापांक।

Representative Results

खूंटी और सीएस moieties (चित्रा 1) युक्त बायोएक्टिव हाइड्रोजेल मानव जोड़ chondrocytes 2,3,5,7 की संस्कृति और परिपक्वता के लिए एक आदर्श मंच प्रतिनिधित्व करते हैं। अलग अलग उम्र और बीमारी राज्यों से Chondrocytes वर्णित विधि के साथ सुसंस्कृत और उनके फेनोटाइप, जीन अभिव्यक्ति और उत्पन्न उपास्थि ऊतक के जैव रासायनिक और यांत्रिक गुणों के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। तीन उपास्थिकोशिका नमूने, juvenile- 6 महीने, adult- 34 वर्ष और osteoarthritic- 74 वर्ष, 3 डी biomimetic हाइड्रोजेल में संस्कृति के 3 सप्ताह के बाद काटा गया। जीन अभिव्यक्ति सामान्य chondrocytes, किशोर और वयस्क दोनों का विश्लेषण करती है, उपास्थिकोशिका जीन Col2a1 और Col6a1 की अभिव्यक्ति में वृद्धि देखी गई। Col6a1 (चित्रा 2) की अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए एक अनुकूल biomimetic वातावरण में सुसंस्कृत होने के बावजूद chondrogenic phenotype के एक नुकसान दिखा रहा है जबकि इसके विपरीत, रोगग्रस्त chondrocytes Col2a1 में एक नाटकीय कमी देखी गई।

सीएस खूंटी हाइड्रोजेल भी, chondrocytes पैदा करना के लिए एक गतिशील वातावरण के रूप में सेवा खूंटी और सीएस के पूर्व मौजूदा मैट्रिक्स को पचाने और उनके pericellular और बाह्य मैट्रिक्स, परिपक्व उपास्थि ऊतक के मुख्य घटक जमा। इन विट्रो संस्कृति के 3 सप्ताह बाद उपास्थिकोशिका विस्तार, इन क्षमताओं को देखते हुए Picogreen डाई के साथ डीएनए की मात्रा का ठहराव से अनुमान लगाया जा सकता है। कोशिकाओं के तीन समूहों का तुलनात्मक विश्लेषण OA chondrocytes संस्कृति के 1 दिन की तुलना में एक नाटकीय कमी का प्रदर्शन किया है, जबकि किशोर और वयस्क आबादी का घनत्व सेल अपरिवर्तित रहा था कि पता चलता है। डीएनए सामग्री का नुकसान भी लंबे समय तक संस्कृति (चित्रा 3) के दौरान संभव कोशिका मृत्यु का सुझाव अन्य chondrocytes OA के लिए नहीं बल्कि मनाया गया। स्रावित मैट्रिक्स संस्कृतियों के 3 सप्ताह के बाद अंत बिंदु चरण में DMMB डाई बाध्यकारी परख द्वारा सल्फेटकृत-भूमिकाः सामग्री के रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था। भूमिकाः सामग्री को recor रूप हाइड्रोजेल का गीला वजन द्वारा सामान्यीकृत हैदेद enzymatic पाचन और अकोशिकीय योगदान से पहले घटाया जाता है। चित्रा 4 में दिखाया गया है, chondrocytes 3 ​​डी हाइड्रोजेल में संस्कृति के 3 सप्ताह के दौरान भूमिकाः की एक ऐसी ही महत्वपूर्ण राशि जमा किया।

एक भौतिक पाड़ की उपस्थिति गैरपरिरूद्ध संपीड़न परीक्षण 2,3 के माध्यम से नमूनों की biomechanical गुणों के मूल्यांकन की अनुमति देता है। अकोशिकीय हाइड्रोजेल compressive moduli में कमी से गुजरना है, वहीं सेल से लदी निर्माणों संस्कृति में 3 सप्ताह (चित्रा 4) के बाद compressive moduli बनाए रखा। प्ररूपी, यहाँ वर्णित जैव रासायनिक और बायोमैकेनिकल विश्लेषण के मूल्यांकन और इंजीनियरिंग उपास्थि के लिए अलग उपास्थिकोशिका आबादी की क्षमता को समझने के लिए इसलिए उपयोगी होते हैं।

चित्र 1
3 डी उपास्थिकोशिका संस्कृति के लिए 1. खूंटी सीएस biomimetic हाइड्रोजेल चित्रासंरचना। Chondrocytes पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल diacrylate) (PEGDA) और chondroitin सल्फेट मेथाक्रिलेट (सीएस-एमए) और कस्टम बनाया बेलनाकार जेल मोल्ड में casted युक्त एक मिश्रण में resuspended हैं। यूवी जोखिम के बाद, जैल नए साँचे से एकत्र कर रहे हैं और सेल व्यवहार्यता लाइव मृत धुंधला 24 घंटा के बाद encapsulation के द्वारा मूल्यांकन किया है जम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 3 डी biomimetic हाइड्रोजेल में सुसंस्कृत मानव chondrocytes में chondrogenic जीन की 2. अभिव्यक्ति। 3 डी biomimetic हाइड्रोजेल में संस्कृति के 3 सप्ताह बाद किशोर, वयस्क और OA chondrocytes द्वारा उपास्थि मार्कर Col2a1 और Col6a1 के मात्रात्मक जीन अभिव्यक्ति। मूल्यों दिन 1. त्रुटि B में जीन अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्यीकृत कर रहे हैंएआरएस ± एसडी मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। पी * <एक दो पूंछ छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित रूप में 0.05। Smeriglio एट अल से संशोधित। 2 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
3 डी biomimetic हाइड्रोजेल में सुसंस्कृत मानव chondrocytes में चित्रा 3. डीएनए सामग्री। 3D biomimetic हाइड्रोजेल में संस्कृति के 3 सप्ताह बाद किशोर, वयस्क और OA chondrocytes में Picogreen परख द्वारा डीएनए मात्रा। मूल्यों 1 दिन में डीएनए के स्तर को सामान्यीकृत कर रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4 <br /> चित्रा 4. भूमिकाः सामग्री को माप और 1 दिन में और 3 डी biomimetic हाइड्रोजेल में संस्कृति के 3 सप्ताह के बाद मानव chondrocytes की गैरपरिरूद्ध संपीड़न परीक्षण। 1 दिन में chondrocytes में और संस्कृति के 3 सप्ताह में बाद DMMB परख द्वारा (ए) भूमिकाः मात्रा का ठहराव 3 डी biomimetic हाइड्रोजेल। मानों वजन (ww) गीला करने के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं और माइक्रोग्राम / ग्राम के रूप में व्यक्त किया। 1 दिन में और 3 डी biomimetic हाइड्रोजेल में संस्कृति के 3 सप्ताह बाद अकोशिकीय और सेल से लदी हाइड्रोजेल (बी) संपीडित मापांक (केपीए)। देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में सूचना दी, 3 डी हाइड्रोजेल आमतौर पर monolayer संस्कृतियों 15 के साथ सामना करना तंतुपास्थि कोशिकाओं में सेल dedifferentiation की प्रक्रिया से बचने, संस्कृति में उपास्थिकोशिका फेनोटाइप बनाए रखने में सक्षम हैं। इसके अलावा, chondrocytes- हाइड्रोजेल निर्माण के लिए लंबी अवधि संस्कृतियों उम्र और बीमारी के साथ जुड़े आंतरिक सेल सुविधाओं का कहना है कि एक अनुकूल वातावरण का पता चला।

एक 3 डी biomimetic हाइड्रोजेल के उपयोग के कई फायदे हैं। सबसे पहले, chondroitin सल्फेट का समावेश (सीएस), जोड़ कार्टिलेज में पाया जाने वाला एक प्रमुख घटक है, chondroitinase स्रावित द्वारा हाइड्रोजेल मैट्रिक्स नीचा और अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स 5, 16 नए संश्लेषित उपास्थि नीचे रखना करने के लिए कोशिकाओं को सक्रिय करें। इसके अलावा, सीएस दिखाया गया है गठिया के संयुक्त में विरोधी भड़काऊ गुण है। biomimetic हाइड्रोजेल भी उपास्थि की मरम्मत में सेल डिलीवरी के लिए एक मचान सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और रासायनिक संशोधित किया जा सकता हैबेहतर ऊतक biomaterial एकीकरण 17,18 सुविधा के लिए।

खूंटी-सीएस हाइड्रोजेल के उपयोग के लिए लंबी अवधि के chondrocytes की संस्कृतियों और जैव रासायनिक और यांत्रिक गुणों के मूल्यांकन की अनुमति देता है। यहाँ हम इस मंच उपास्थि इंजीनियरिंग के लिए इष्टतम सेल प्रकार परिभाषित करने के क्रम में भेदभाव chondrocytes के विभिन्न स्रोतों का तुलनात्मक विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है कि कैसे दिखा। दिलचस्प बात यह है हाइड्रोजेल में समझाया chondrocytes अपने आंतरिक क्षमता के अनुसार व्यवहार्य बने हुए हैं और पैदा करना। हाइड्रोजेल रचना का समर्थन करता है, वास्तव में, स्वस्थ किशोर और वयस्क chondrocytes के विकास चित्रा 2 में दिखाया गया है। वर्णित हाइड्रोजेल की संरचना और संरचना भी उपास्थि ऊतक गठन को बढ़ावा ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन द्वारा मूल्यांकन एक कार्यात्मक बाह्य मैट्रिक्स के बयान (भूमिकाः द्वारा संकेत के रूप में ) मात्रा।

एक अतिरिक्त लाभ यह है कि उपास्थिकोशिका-हाइड्रोजेल निर्माणों हैनवगठित उपास्थि ऊतक के यांत्रिक गुणों के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। गैरपरिरूद्ध संपीड़न परीक्षण की तुलना के लिए अकोशिकीय हाइड्रोजेल पर किया जाना चाहिए कि ध्यान दें। हाइड्रोजेल, वास्तव में, कारण सीएस moieties की कठोरता के लिए एक आंतरिक कठोरता है। (एक तनाव दर / एस 1% से कम) 5-20% की गैरपरिरूद्ध संपीड़न तनाव लदान शर्त के तहत उपास्थि ऊतक द्वारा अनुभवी शारीरिक तनाव के बाद से उपास्थि ऊतक 11,12 के यांत्रिक परीक्षण के लिए लागू किया जा सकता 10-20 होने की सूचना दी गई है % 13,14। यांत्रिक परीक्षण करने के लिए सेल से लदी और अकोशिकीय दोनों हाइड्रोजेल की प्रतिक्रिया संस्कृति अंत बिंदु पर मूल्यांकन किया गया था। वर्णित उदाहरण में हम OA chondrocytes युक्त निर्माणों के निचले कठोरता के विपरीत वयस्क और किशोर chondrocytes युक्त निर्माणों की एक तुलनीय कठोरता मनाया ऊपर। सेल-हाइड्रोजेल निर्माण के इस तरह के यांत्रिक गुणों के कार्यात्मक संपत्तियों के मूल्यांकन की अनुमतिसेल परिपक्वता की क्षमता का एक में गहराई से विश्लेषण देने का गठन ऊतक।

अंत में, उपास्थि ऊतक उत्पन्न करने के लिए अलग अलग उपास्थिकोशिका आबादी की क्षमता का अध्ययन करने के लिए 3 डी biomimetic हाइड्रोजेल का उपयोग व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है। यहाँ वर्णित इन विट्रो अध्ययन में इसके अलावा, सेल से लदी निर्माणों के vivo प्रत्यारोपण शारीरिक संदर्भ में सेल परिपक्वता और पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए कल्पना की जा सकती है। अतिरिक्त biomimetic कारकों के साथ हाइड्रोजेल मंच के आगे संशोधन भी उपास्थिकोशिका प्रसार और परिपक्वता का अनुकूलन करने की कल्पना की जा सकती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System ) Lonza CC-2550
adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System) Lonza CC-2550
poly(ethylene glycol diacrylate) Laysan Bio ACRL-PEG-ACRL-1000-1g
2-morpholinoethanesulfonic acid Sigma M5287
photoinitiator Irgacure  2959
sodium chloride  Sigma S9888
chondroitin sulfate sodium salt  Sigma C9819
N-hydroxysuccinimide  Sigma 130672
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride Sigma E1769
2-aminoethyl methacrylate Sigma 516155
dialysis tubing Spectrum Laboratories  132700
Collagenase 2 Worthington Biochemical  LS004177
Collagenase 4 Worthington Biochemical  LS004189
DMEM/F12 media HyClone, Thermo Scientific  SH3002301 
live/dead assay Life Technologies L3224
Tri reagent Life Technologies AM9738
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496
Sodium phosphate dibasic  Sigma S3264
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt  Sigma E5134
L-Cysteine Sigma C1276
1,9-dimethylmethylene blue  Sigma 341088
Instruments
UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm UVP 95-0042-07
Instron 5944 testing system  Instron Corporation E5940

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Smeriglio, P., Lai, J. H., Yang, F., Bhutani, N. 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation. J. Vis. Exp. (104), e53085, doi:10.3791/53085 (2015).More

Smeriglio, P., Lai, J. H., Yang, F., Bhutani, N. 3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation. J. Vis. Exp. (104), e53085, doi:10.3791/53085 (2015).

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