Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de los sujetos de Stanford Universidad Humanos y aprobados protocolo Junta de Revisión Institucional.
1. Articular condrocitos aislamiento
- Obtener cartílago de tejidos descartados durante la artroplastia total de rodilla y diseccionar lo descrito previamente 8.
- Visualmente seleccionar los cóndilos femorales medial o lateral de muestras de cartílago para superficies lisas y hacer la incisión en la superficie del cartílago a través de un escalpelo para eliminar 4-5 mm biopsias de cartílago sin afectar el hueso subcondral.
- Aislar los condrocitos de la matriz extracelular por la disociación enzimática del tejido con tratamiento O / N con colagenasa purificada. Use 1: 1 relación de la colagenasa II (125 U / ml) y la colagenasa IV (160 U / ml) en medio de crecimiento de condrocitos a 37 ° C.
- El día siguiente, filtra el tejido digerido que contiene las células disociadas a través de una 70mm poro tamaño de malla de nylon. De lavado dos veces con 20 ml de DMEM / F12 y centrifugar a 600 xg durante 5 min.
- Placa de los condrocitos aislados a una densidad de 1 x 10 6 células / 60 mm placa de cultivo después de re-suspensión en DMEM / F12 suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 25 mg / ml de ascorbato, 2 mM L-glutamina, antimicrobianos (100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,25 mg / ml de Fungizone). Mantener las placas a 37 ° C y mantener los cultivos de condrocitos primarios como una monocapa de alta densidad antes de la encapsulación en hidrogeles biomiméticos.
2. Biomimetic hidrogel Fabrication
NOTA: Este método permite la síntesis de un hidrogel biomimético que contiene poli (etilenglicol diacrilato) (PEGDA, MW 5.000 g / mol), sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA) en DPBS. La adición de fotoiniciador permite reticulación fotoactivado. La composición de hidrogel final contiene 7% de pesajet / volumen (w / v) de PEGDA, 3% w / v de CS-MA, y 0,05% w / v de fotoiniciador.
- Sintetizar CS-MA por la funcionalización del polímero con grupos metacrilato CS.
- Preparar la solución tamponada de 50 mM de ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) y cloruro de 0,5 M de sodio (NaCl) disolviendo 1,952 g de MES y 5,84 g de NaCl en 200 ml de agua desionizada (DiH 2 O). Disolver 5 g de sal sódica de sulfato de condroitina en la solución tamponada.
- Añadir 0,532 g (4,62 mmol) de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 1,771 g (9,24 mmol) de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) (relación molar de NHS: EDC = 1: 2) para la solución y se agita durante 5 min.
- Añadir 0,765 g (4,62 mmol) de metacrilato de 2-aminoetilo (AEMA) (relación molar de NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) a la solución y mantener la reacción a TA durante 24 h.
- Se purifica la mezcla mediante diálisis frente a agua desionizada (DIH 2 O) durante 4 días utilizando un tubo de diálisis (12-14 kDa MWCO).
- Se filtra la purified solución a través de un filtro de 0,22 micras y colocar los tubos abiertos que contienen la solución en el desecador de vacío y O / N. Asegúrese de que todos los tubos están protegidos de la luz. Guarde el polímero disuelto a -20 ° C protegido de la luz y la humedad.
3. La encapsulación de la célula
- Autoclave las películas y cilíndricos varillas de PCR (para la perforación de los hidrogeles 3D de células con carga) y esterilizar el molde de gel cilíndrica medida por inmersión en 0,2 micras filtrada etanol al 70% en el tejido campana de cultivo bajo luz UV.
- Sellar el fondo del molde con la película de gel PCR en autoclave sin burbujas o huecos para evitar fugas de aire. Guárdelo en una placa estéril 150 mm.
- El día antes de la encapsulación de células en hidrogel biomimético, disociar la monocapa de condrocitos de alta densidad con O / N en el tratamiento de colagenasa II y solución de colagenasa IV. Utilice 125 U / ml para la colagenasa II y 160 U / ml para la colagenasa VI en el crecimiento de condrocitos cada mediosa 37 ° C.
- Tomar un tubo de 50 ml y añadir 5% en peso / volumen (w / v) (diacrilato de etilenglicol) poli (PEGDA, MW = 5000 g / mol), 3% w / v sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA), y 0,05% w / v fotoiniciador en DPBS. Vortex el tubo para mezclar la solución y mantener a un lado. Proteja el tubo de la luz.
- Recoger las células disociadas en un tubo Falcon 50 ml, contar y centrifugar a 460 xg durante 5 min. Aspirar todos los medios de comunicación desde el tubo de células y añadir el material de gel mixto anterior a las células volver a suspender a una densidad de 15 × 10 6 células / ml. Mezclar 30 veces a fondo y evitar la formación de burbujas de aire.
- Pipeta 72 l de la suspensión de células de hidrogel o hidrogel solos en el molde de gel cilíndrica a medida e inducir la gelificación través de la exposición a la luz UV (365 nm de longitud de onda) a 3 mW / m 2 durante 5 min. Prepara un poco de solución de hidrogel sin contenido celular. Utilice estas construcciones como controles negativos para el futuro pruebas bioquímicas y mecánicas. Measure la intensidad de la luz UV con un medidor de intensidad de los rayos UV. Para ajustar la intensidad, cambiar la distancia entre la fuente de luz UV y el andamio de hidrogel durante la gelificación.
NOTA: Dado que el hidrogel contiene CS, la contribución acelular se resta del contenido de GAG bioquímica de los hidrogeles de células cargado para representar sólo el GAG celular. - Utilice un bisturí para cortar la película para fácil de despegar y retire con cuidado. Con la ayuda de las varillas cilíndricas, empujar hacia fuera el gel en una placa de 6 pocillos con 5 ml de DPBS estériles para lavar gel no polimerizado y las células sueltas.
- Cultura los hidrogeles cargados de células en placas de 24 pocillos que contenían 1,5 ml de medio de crecimiento de condrocitos en cada pocillo. Use una espátula desechable para transferir los hidrogeles lavadas en el pozo.
- Evaluar la viabilidad celular por muertos viven tinción 24 horas después de la encapsulación utilizando un kit de viabilidad / citotoxicidad. Cultura de los hidrogeles de células cargadas y los hidrogeles vacíos para 3-6 semanas cambiantes de gro condrocitos frescaswth medios cada 2 días antes de la cosecha para los análisis.
4. RNA de extracción y análisis de expresión de genes
- Aspirar con cuidado los medios de comunicación y poner estéril PBS 1X en el teléfono cargado, así como los hidrogeles de control vacías.
- Con la ayuda de una espátula estéril, transferir cada hidrogel a un tubo Eppendorf de 1,5 ml limpio y añadir 250 l de Tri-reactivo a cada tubo. Siga las instrucciones del fabricante para aislar ARN.
- Después de aislamiento de ARN y cuantificación uso 1 g de la misma de cada muestra y realizar una transcripción inversa en ADNc utilizando la alta capacidad de cDNA Transcription Kit inversa.
- Para la PCR cuantitativa TaqMan Arrays utilizar Expresión Génica para el examen de la expresión de los genes de interés. Normalizar los niveles de expresión génica internamente para GAPDH.
- Para las condiciones de PCR incluir una incubación de 2 min a 50 ° C para inactivar amplicones anteriores con uracil-DNA glycosylase, seguido por un 1060; min de incubación a 95 ° C para activar la Taq polimerasa. A continuación, realice ciclos cuarenta de PCR, que consta de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C.
5. Los análisis bioquímicos
- Para cada constructos de células hidrogel cuantificar el ADN y glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) la producción de la siguiente manera.
- Aspirar con cuidado los medios de comunicación y poner estéril PBS 1X en el teléfono cargado, así como los hidrogeles de control vacías. Pesar un tubo vacío y poner el hidrogel en el interior después de secante en papel de seda y registrar el peso o el peso húmedo de los hidrogeles.
- Congelar cada hidrogel a -20 ° C en un tubo eppendorf de 1,5 ml por separado para la digestión enzimática y más tarde utilizar una parte alícuota del producto digerido para ejecutar ensayo de Picogreen (para ADN) y el ensayo de azul de metileno-Dimetil (por GAG).
- Preparar la solución de papainase para la digestión enzimática de los hidrogeles.
- En primer lugar preparar el tampón PBE pesando 7,1 g de sodio phosphate dibásico (Na 2 HPO 4) y 1,6 g de sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA-Na 2). Disolver en 500 ml de dH 2 O, ajustar el pH a 6,5 y filtrar la solución purificada a través de un filtro de 0,22 mm.
- Disolver 0,035 g de L-cisteína en 20 ml de tampón de PBE. Se filtra la solución y 100 l de enzima papaína estéril.
- Cuando esté listo para realizar los ensayos, tomar los tubos de -20 ° C y añadir 300 l de la solución de papaína listo para los hidrogeles congelados. Machacar el gel con un mortero y se mezcla bien con la mano del mortero motor.
- Llevar el volumen a 500 l con solución de papaína adicional. Realice el mismo procedimiento para los geles de control. Se incuba a 60 ° C durante 16 horas 3,9. La solución que contiene el hidrogel digerido por lo tanto se puede utilizar para la cuantificación de ADN y GAG. Mida el contenido de ADN utilizando el ensayo Picogreen con el ADN del fago Lambda de serie siguiente pr del fabricanteotocol.
- Cuantificar el contenido-GAG sulfatados utilizando el azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB) ensayo de unión de tinte con sulfato de condroitina tiburón de serie 10. Determinar el contenido de GAG dividiendo la cantidad de GAG para el peso húmedo correspondiente.
6. Pruebas Mecánicas
- Realizar ensayos de compresión no confinada utilizando un sistema de ensayo Instron 5944 equipado con una célula de carga de 10 N.
- Después de los días deseados de cultivo in vitro, realice la prueba de compresión en el cadalso de células hidrogel y los hidrogeles de control acelular.
- Sumergir las muestras en un baño de PBS a RT y comprimir a una velocidad de 1% de deformación / seg a una cepa máximo de 15% 11,12 ya que el esfuerzo fisiológico experimentado por tejido de cartílago bajo condición de carga ha sido informado de que el 10-20% 13,14.
- Crear estrés vs. curvas de tensión y ajuste de la curva utilizando una ecuación polinómica de tercer orden. Determinar las compressive módulo tangente de la curva de ecuación de ajuste a valores de deformación de 15%.
Representative Results
Hidrogeles bioactivos que contienen PEG y restos CS (Figura 1) representan una plataforma ideal para la cultura y la maduración de los condrocitos articulares humanos 2,3,5,7. Los condrocitos de diferentes edades y estados de enfermedad pueden ser cultivadas con el método descrito y analizado por su fenotipo, la expresión génica y propiedades bioquímicas y mecánicas del tejido de cartílago generado. Tres muestras de condrocitos, juvenile- 6 meses, edad adulta 34 años y osteoarthritic- 74 años, se recogieron después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. La expresión génica de los condrocitos analiza normal, tanto juveniles y adultos, mostró un aumento en la expresión de los genes COL6A1 y condrocitos Col2a1. Por el contrario, los condrocitos enfermas mostraron una disminución dramática en Col2a1 manteniendo al mismo tiempo la expresión de COL6A1 (Figura 2) que muestra una pérdida de fenotipo condrogénica a pesar de ser cultivadas en un medio ambiente favorable biomimético.
Los hidrogeles de PEG-CS también sirven como un entorno dinámico para los condrocitos a proliferan, digieren la matriz pre-existente de PEG y CS y depositan su matriz pericelular y extracelular, los principales componentes del tejido de cartílago maduro. Dadas estas capacidades, la expansión de condrocitos después de 3 semanas de cultivo in vitro se puede estimar mediante la cuantificación de ADN con el tinte Picogreen. Análisis comparativo de los tres grupos de células muestran que la densidad celular de las poblaciones de juveniles y adultos se mantuvo sin cambios, mientras que los condrocitos OA mostraron una disminución dramática en comparación con los días 1 de la cultura. Una pérdida de contenido de ADN también se observó para la OA, pero no otros condrocitos que sugieren la posible muerte celular durante el largo plazo la cultura (Figura 3). La matriz secretada se cuantificó como contenido-GAG sulfatado mediante el ensayo de fijación de colorante DMMB en la etapa de punto final después de 3 semanas de las culturas. Contenido de GAG se normaliza por el peso húmedo del hidrogel como recorded antes de la digestión enzimática y la contribución acelular se resta. Como se muestra en la Figura 4, los condrocitos depositan una cantidad significativa similar de GAG durante 3 semanas de cultivo en hidrogeles 3D.
La presencia de un andamio física permite que la evaluación de las propiedades biomecánicas de las muestras a través de no confinado ensayos de compresión 2,3. Mientras que los hidrogeles acelulares se someten a una disminución en los módulos de compresión, los constructos de células Laden mantienen los módulos de compresión después de 3 semanas en cultivo (Figura 4). El fenotípica, análisis bioquímicos y biomecánicos descritos aquí son por lo tanto útiles para evaluar y comprender el potencial de las diferentes poblaciones de condrocitos para el cartílago ingeniería.
Figura 1. PEG-CS hidrogeles biomiméticos para cul de condrocitos 3Dtura. Los condrocitos se resuspenden en una mezcla que contiene poli (etileno glicol diacrilato) (PEGDA) y sulfato de condroitina-metacrilato (CS-MA) y fundido en el molde de gel cilíndrica a medida. Después de la exposición UV, solidificaron geles se recogen de los moldes y la viabilidad celular se evalúa por tinción muertos en vivo 24 horas después de la encapsulación. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Expresión de genes condrogénicas en condrocitos humanos cultivados en hidrogeles biomiméticos 3D. La expresión génica cuantitativa de marcadores de cartílago Col2a1 y COL6A1 por juveniles, adultos y OA condrocitos después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. Los valores se normalizaron a nivel de la expresión génica en el día 1. Error bars representan media ± DE. * p <0,05 como se determina por una prueba t de Student de dos colas. Modificado de Smeriglio et al. 2 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. contenido de ADN en los condrocitos humanos cultivados en hidrogeles biomiméticos 3D. Cuantificación de ADN por el ensayo Picogreen en juveniles, adultos y OA condrocitos después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. Los valores se normalizaron a nivel de ADN en el día 1. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
<br /> Figura medición de contenido 4. GAG y prueba de compresión no confinada de condrocitos humanos en el día 1 y después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. (A) GAG cuantificación mediante ensayo DMMB en condrocitos en el día 1 y después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. Los valores se normalizan a mojar peso (ww) y se expresaron como mg / g. (B) módulo de compresión (kPa) de acelulares y celulares cargados hidrogeles en el día 1 y después de 3 semanas de cultivo en hidrogeles biomiméticos 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Como se informó en este protocolo, los hidrogeles 3D son capaces de mantener el fenotipo de los condrocitos en la cultura, evitando el proceso de desdiferenciación celular en células fibrocartílago usualmente encontrados con cultivos monocapa 15. Por otra parte, cultivos a largo plazo de la construcción de hidrogel chondrocytes- revelaron un entorno favorable que mantiene las características intrínsecas de células asociadas con la edad y la enfermedad.
El uso de un hidrogel biomimético 3D tiene varias ventajas. En primer lugar, la inclusión de sulfato de condroitina (CS), un componente principal encontrado en el cartílago articular, permiten a las células para degradar la matriz de hidrogel mediante la secreción de condroitinasa y fijar en el cartílago recién sintetizado extra-celular de matriz 5, 16. Además, CS ha demostrado que tienen propiedades anti-inflamatorias en la articulación artrítica. El hidrogel biomimético también puede ser utilizado como un material de andamiaje para la entrega celular en la reparación del cartílago, y puede ser modificado químicamentepara facilitar una mejor integración 17,18 biomaterial-tejido.
El uso de los hidrogeles PEG-CS permite cultivos a largo plazo de los condrocitos y la evaluación de las propiedades bioquímicas y mecánicas. Aquí mostramos cómo esta plataforma puede ser útil para los análisis comparativos de diversas fuentes de condrocitos diferenciados con el fin de definir el tipo de célula óptima para la ingeniería de cartílago. Curiosamente, los condrocitos encapsulados en hidrogeles permanecen viables y proliferan según sus capacidades intrínsecas. Los soportes composición de hidrogel, de hecho, el crecimiento de juveniles y adultos condrocitos sanos como se muestra en la Figura 2. La composición y estructura de los hidrogeles descritos también promueve la formación de tejido de cartílago como se indica por la deposición de una matriz extracelular funcional evaluado por glicosaminoglicanos (GAG ) cuantificación.
Una ventaja adicional es que las construcciones de condrocitos hidrogelse puede evaluar para las propiedades mecánicas del tejido de cartílago recién formado. Tenga en cuenta que la prueba de compresión no confinada se debe realizar en el hidrogel acelular para la comparación. Los hidrogeles, de hecho, tienen una rigidez intrínseca debido a la rigidez de los restos de CS. Esfuerzo de compresión no confinada de 5-20% (a una velocidad de deformación 1% / s) se puede aplicar para el ensayo mecánico del tejido cartilaginoso 11,12 ya que el esfuerzo fisiológico experimentado por tejido de cartílago bajo condición de carga se ha informado a 10-20 13,14%. La respuesta de ambas células cargadas y acelular hidrogeles a ensayos mecánicos se evaluó en el punto final de la cultura. En el ejemplo descrito anteriormente se observó una rigidez comparable de las construcciones que contienen adultos y juveniles condrocitos en contraste con la menor rigidez de las construcciones que contienen condrocitos OA. Tales propiedades mecánicas de la construcción de células-hidrogel permiten la evaluación de las propiedades funcionales de latejido formado dando un análisis en profundidad de la capacidad de maduración de las células.
En conclusión, el uso de los hidrogeles biomiméticos 3D para estudiar el potencial de los diferentes población de condrocitos para generar tejido cartilaginoso puede ser ampliamente aplicada. Además de los estudios in vitro descritos aquí, el trasplante in vivo de los constructos de células cargado se puede prever para estudiar la maduración celular y el potencial regenerativo en el contexto fisiológico. Otras modificaciones de la plataforma de hidrogel con factores biomiméticos adicionales también se pueden prever para optimizar la proliferación de condrocitos y la maduración.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System ) | Lonza | CC-2550 | |
| adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System) | Lonza | CC-2550 | |
| poly(ethylene glycol diacrylate) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-1000-1g | |
| 2-morpholinoethanesulfonic acid | Sigma | M5287 | |
| photoinitiator | Irgacure | 2959 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| chondroitin sulfate sodium salt | Sigma | C9819 | |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma | 130672 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride | Sigma | E1769 | |
| 2-aminoethyl methacrylate | Sigma | 516155 | |
| dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132700 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Collagenase 4 | Worthington Biochemical | LS004189 | |
| DMEM/F12 media | HyClone, Thermo Scientific | SH3002301 | |
| live/dead assay | Life Technologies | L3224 | |
| Tri reagent | Life Technologies | AM9738 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt | Sigma | E5134 | |
| L-Cysteine | Sigma | C1276 | |
| 1,9-dimethylmethylene blue | Sigma | 341088 | |
| Instruments | |||
| UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm | UVP | 95-0042-07 | |
| Instron 5944 testing system | Instron Corporation | E5940 |
References
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