Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med Stanford University mennesker retningslinjer og godkendt Institutional Review Board protokol.
1. Artikulær Chondrocyt Isolation
- Opnå brusk fra væv kasseret under total knæalloplastik og dissekere som tidligere beskrevet 8.
- Visuelt vælge den mediale eller laterale femurkondyler af brusk prøver til glatte overflader og gøre indsnit ved overfladen af brusk ved hjælp af en skalpel for at fjerne 4-5 mm brusk biopsier uden at påvirke den subchondrale knogle.
- Isoler chondrocytter fra den ekstracellulære matrix ved enzymatisk dissociation af vævet med O / N behandling med renset collagenase. Brug forholdet 1: 1 collagenase II (125 U / ml) og Collagenase IV (160 U / ml) i chondrocytter vækstmedier ved 37 ° C.
- Den følgende dag, filtrere det fordøjede væv, der indeholder de dissocierede celler gennem en 70mm porestørrelse nylonnet. Vask to gange med 20 ml DMEM / F12 og centrifugeres ved 600 xg i 5 min.
- Plate de isolerede chondrocytter ved en densitet på 1 x 10 6 celler / 60 mm dyrkningsskål efter resuspension i DMEM / F12 suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS), 25 ug / ml ascorbat, 2 mM L-glutamin, antibiotika (100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 0,25 ug / ml fungizon). Hold pladerne ved 37 ° C og holdes de primære chondrocytter kulturer som en high-density monolag før indkapsling i biomimetiske hydrogeler.
2. Biomimetic Hydrogel Fabrication
BEMÆRK: Denne fremgangsmåde muliggør syntesen af en biomimetisk hydrogel indeholdende poly (ethylenglycoldiacrylat) (PEGDA, MW 5000 g / mol), chondroitinsulfat-methacrylat (CS-MA) i DPBS. Tilsætningen af fotoinitiator giver fotoaktiveret tværbinding. Den endelige hydrogel sammensætning indeholder 7% vejert / volumen (w / v) af PEGDA, 3% vægt / volumen af CS-MA og 0,05% w / v fotoinitiator.
- Syntetisere CS-MA ved funktionalisere CS polymer med methacrylatgrupper.
- Forbered bufret opløsning af 50 mM 2-morpholinoethansulfonsyre acid (MES) og 0,5 M natriumchlorid (NaCl) ved at opløse 1,952 g MES og 5,84 g NaCl i 200 ml deioniseret vand (DIH 2 O). 5 g chondroitinsulfat natriumsalt opløses i bufferopløsning.
- Tilføj 0,532 g (4,62 mmol) N-hydroxysuccinimid (NHS) og 1.771 g (9,24 mmol) 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimidhydrochlorid (EDC) (molforhold af NHS: EDC = 1: 2) til opløsningen og omrør i 5 minutter.
- Tilføj 0,765 g (4,62 mmol) 2-aminoethylmethacrylat (AEMA) (molforhold af NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) til opløsningen, og reaktionen holdes ved stuetemperatur i 24 timer.
- Renses blandingen ved dialyse mod deioniseret vand (DIH 2 O) i 4 dage under anvendelse af dialyserør (12-14 kDa MWCO).
- Foretage purified løsning gennem et 0,22 um filter og placere de åbne rør, der indeholder opløsningen i ekssikkator og vakuum O / N. Sørg for, at alle rør er beskyttet mod lys. Opbevar opløste polymer ved -20 ° C beskyttet mod lys og fugt.
3. celleindkapsling
- Autoklaver PCR film- og cylindriske stænger (til stansning ud celle-laden 3D hydrogeler), og sterilisere skræddersyet cylindrisk gel formen ved nedsænkning i 0,2 um filtreret 70% ethanol i vævskultur hætte under UV-lys.
- Forsegl bunden af gelen formen med autoklaveret PCR film uden luftbobler eller huller for at forhindre lækager. Hold det i et sterilt 150 mm plade.
- Dagen før celleindkapsling i biomimetiske hydrogel, dissociere high-density chondrocyt monolag med O / N behandling i collagenase II og IV collagenase opløsning. Brug 125 U / ml for collagenase II og 160 U / ml for collagenase VI hver chondrocytter vækstmedierved 37 ° C.
- Tag en 50 ml rør og der tilsættes 5% vægt / volumen (w / v) poly (ethylenglycoldiacrylat) (PEGDA, MW = 5.000 g / mol), 3% vægt / volumen chondroitinsulfat-methacrylat (CS-MA), og 0,05% w / v fotoinitiator i DPBS. Vortex røret for at blande opløsningen og holde den til side. Beskytte røret mod lys.
- Saml de dissocierede celler i et 50 ml Falcon-rør, ud og der centrifugeres ved 460 xg i 5 min. Aspirer alle medier fra celler, hældes den ovennævnte blandede gelmateriale at resuspendere celler i en densitet på 15 × 10 6 celler / ml. Bland det 30 gange grundigt samtidig undgå luftbobler formation.
- Pipette 72 ul af celle-hydrogel suspension eller hydrogel alene ind i custom-made cylindrisk gel mug og fremkalde gelering gennem udsættelse for UV-lys (365 nm bølgelængde) ved 3 mW / m 2 i 5 min. Forberede nogle hydrogel løsning uden celleindhold. Brug disse konstruktioner som negative kontroller for fremtiden biokemiske og mekanisk prøvning. Measure intensiteten af UV-lyset med en UV-intensitet meter. For at justere intensiteten, ændre afstanden mellem UV-lyskilden og hydrogel stillads under gelering.
BEMÆRK: Da hydrogel indeholder CS, er acellulær bidrag trækkes fra den biokemiske GAG indholdet af celle-belæsset hydrogeler at repræsentere kun den cellulære GAG. - Brug en skalpel til at skære filmen for nem skalle og forsigtigt fjerne det. Ved hjælp af de cylindriske stænger, skubbe gelen i en 6 brønds plade med 5 ml sterilt DPBS at vaske polymeriseret gel og løse celler.
- Kultur celle-laden hydrogeler i plader med 24 brønde indeholdende 1,5 ml chondrocytter vækstmedier i hver brønd. Brug en engangs spatel til at overføre de vaskede hydrogeler i brønden.
- Vurdere levedygtighed celle ved levende døde farvning 24 timer efter indkapsling ved hjælp af en levedygtighed / cytotoksiciteten kit. Kultur celle-laden hydrogeler og de tomme hydrogeler til 3-6 uger skifter til friske chondrocyt groGJ medier hver 2 dage før høst til analyser.
4. RNA-ekstraktion og genekspression Analyser
- Aspireres forsigtigt medierne og sætte sterilt PBS 1X på cellen-laden samt de tomme kontrol hydrogeler.
- Ved hjælp af en steril spatel, overføre hver hydrogel til et rent 1,5 ml Eppendorf-rør, og der tilsættes 250 pi Tri-reagens til hvert rør. Følg producentens anvisninger for at isolere RNA.
- Efter RNA isolering og kvantificering brug 1 ug det fra hver prøve og udføre en omvendt transskription til cDNA ved hjælp af høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit.
- Til kvantitativ PCR bruger TaqMan Gene Expression Arrays til undersøgelse af ekspressionen af dine gener af interesse. Normalisere genekspressionsniveauer internt til GAPDH.
- For PCR indbefatter en 2 minutters inkubation ved 50 ° C for at inaktivere tidligere amplikoner med uracil-DNA-glycosylase, efterfulgt af en 1060; minutters inkubering ved 95 ° C for at aktivere Taq-polymerase. Derefter udfører fyrre cyklusser af PCR, der består af 15 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C.
5. Biokemiske analyser
- For hver celle-hydrogel konstruktioner kvantificere DNA og sulfateret glycosaminoglycan (sGAG) produktion som følger.
- Aspireres forsigtigt medierne og sætte sterilt PBS 1X på cellen-laden samt de tomme kontrol hydrogeler. Et tomt rør vejes og sætte hydrogel inde efter blotting det på silkepapir og registrere vægt eller våd vægt af hydrogelerne.
- Frys hver hydrogel ved -20 ° C i et separat 1,5 ml eppendorfrør for enzymatisk fordøjelse og senere benytte en portion af det fordøjede produkt til at køre Picogreen assay (for DNA) og dimethyl-Methylenblåt assay (for GAG).
- Forbered papainase løsning til enzymatisk fordøjelse af hydrogelerne.
- Først forberede PBE buffer ved at afveje 7,1 g Natrium Phosphate dibasisk (Na 2 HPO 4) og 1,6 g ethylendiamintetraeddikesyredinatriumsalt (EDTA-Na 2). Opløses i 500 ml dH2O, justere pH til 6,5 og filtrere rensede opløsning gennem et 0,22 mm filter.
- 0,035 g L-cystein opløses i 20 ml PBE buffer. Opløsningen filtreres og 100 pi sterilt papain enzym.
- Når den er klar til at udføre assayene, tage rørene fra -20 ° C og tilsæt 300 pi klar papain løsning på de frosne hydrogeler. Knuse gelen med en morter og støder og bland det godt med motoren støder.
- Bring lydstyrken til 500 pi med ekstra papain løsning. Udfør den samme procedure for kontrol geler. Der inkuberes ved 60 ° C i 16 timer 3,9. Opløsningen indeholdende det fordøjede hydrogel kan derfor anvendes til DNA og GAG kvantificering. Mål DNA indhold ved hjælp af Picogreen assay med Lambda fag-DNA som standard efter producentens PRotocol.
- Kvantificere indholdet sulfateret-GAG ved hjælp af 1,9-dimethylmethylen blå (DMMB) farvestof-bindingsassay med haj chondroitin sulfat som standard 10. Bestemme indholdet GAG ved at dividere mængden af GAG for den tilsvarende vådvægt.
6. Mekanisk testning
- Udfør unconfined kompression tests med en Instron 5944 testsystem udstyret med en 10 N vejecelle.
- Efter de ønskede dage in vitro kultur, udføre komprimering test på celle- hydrogel stillads og acellulære kontrol hydrogeler.
- Nedsænkes prøver i en PBS bad ved stuetemperatur og komprimere med en hastighed på 1% deformation / sek til en maksimal belastning på 15% 11,12 siden fysiologisk belastning opleves af bruskvæv under belastningstilstand er blevet rapporteret at være 10-20% 13,14.
- Opret stress vs. strain kurver og kurvetilpasning ved hjælp af en tredje polynomium ligning. Bestem kompressive tangent modulus fra kurven ligning ved belastningsværdier på 15%.
Representative Results
Bioaktive hydrogeler indeholdende PEG og CS-dele (Figur 1) udgør en ideel platform for kultur og modning af humane ledchondrocytter 2,3,5,7. Chondrocytter fra forskellige aldre og sygdomstilstande kan dyrkes med den beskrevne fremgangsmåde og analyseret for deres fænotype, genekspression og biokemiske og mekaniske egenskaber af bruskvæv genereret. Tre chondrocyt prøver, juvenile- 6 måneder, voksen- 34 år og osteoarthritic- 74 år, blev høstet efter 3 ugers kultur i 3D biomimetiske hydrogeler. Genekspression analyser af normale chondrocytter, både unge og voksne, viste en stigning i forekomsten af de chondrocyt generne COL2A1 og Col6a1. Tværtimod syge chondrocytter viste en dramatisk nedgang i COL2A1 samtidig med at ekspressionen af Col6a1 (figur 2), der viser et tab af chondrogen fænotype trods dyrket i et gunstigt biomimetiske miljø.
CS-PEG hydrogeler også tjene som et dynamisk miljø for chondrocyterne at formere, fordøje den allerede eksisterende matrix af PEG og CS og deponere deres pericellulær og ekstracellulær matrix, de vigtigste komponenter i den modne bruskvæv. I betragtning af disse evner, chondrocytter ekspansion efter 3 ugers dyrkning in vitro kan estimeres ved kvantificering af DNA med Picogreen farvestof. Sammenlignende analyse af de tre grupper af celler viser, at celledensitet på unge og voksne populationer var uforandret, mens OA chondrocytter udviste et dramatisk fald i forhold til dag 1 i kultur. Et tab af DNA-indholdet blev også observeret for OA, men ikke andre chondrocytter foreslår mulige celledød under den langsigtede kultur (figur 3). Det secernerede matrix blev kvantificeret som sulfateret-GAG indhold ved DMMB dye-bindingsassay ved slutpunktet fase efter 3 ugers kulturer. GAG indhold normaliseres ved den våde vægt af hydrogelen som RECORDED før enzymatisk fordøjelse og acellulær bidrag subtraheres. Som vist i figur 4, chondrocytter aflejret en tilsvarende betydelig mængde GAG i 3 ugers dyrkning i 3D hydrogeler.
Tilstedeværelsen af en fysisk stillads tillader evaluering af biomekaniske egenskaber af prøverne gennem unconfined trykforsøg 2,3. Mens acellulære hydrogeler undergå et fald i kompressionskraft moduli, vedligeholdes celle-laden konstruktioner kompressionsribberne moduler efter 3 uger i kultur (figur 4). Den fænotypiske, biokemiske og biomekaniske analyser er beskrevet her, er derfor nyttige til at evaluere og forstå potentialet i forskellige populationer chondrocyt til mekanik brusk.
Figur 1. PEG-CS biomimetiske hydrogeler til 3D chondrocyt cultur. Chondrocytter resuspenderes i en blanding indeholdende Poly (ethylenglycoldiacrylat) (PEGDA) og chondroitin sulfat-methacrylat (CS-MA) og støbt ind i custom-made cylindrisk gel mug. Efter UV-eksponering, størknede geler er indsamlet fra formene og celleviabilitet vurderes ved levende døde farvning 24 timer efter indkapsling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Ekspression af chondrogene gener i menneskelige chondrocytter dyrket i 3D biomimetiske hydrogeler. Kvantitativ genekspression af bruskmarkører COL2A1 og Col6a1 af unge, voksne og OA chondrocytter efter 3 ugers kultur i 3D biomimetiske hydrogeler. Værdierne er normaliseret til genekspression niveau på dag 1. Error bars repræsenterer middelværdi ± SD. p * <0,05 som bestemt ved en to-halet Student t-test. Modificeret fra Smeriglio et al. 2 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. DNA-indholdet i humane chondrocytter dyrket i 3D biomimetiske hydrogeler. DNA-kvantificering af Picogreen assay i unge, voksne og OA chondrocytter efter 3 ugers kultur i 3D biomimetiske hydrogeler. Værdier er normaliseret til DNA-niveau på dag 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
<br /> Figur 4. GAG indhold måling og unconfined kompression test af menneskelige chondrocytter på dag 1 og efter 3 ugers dyrkning i 3D biomimetiske hydrogeler. (A) GAG kvantificering af DMMB assay i chondrocytter på dag 1 og efter 3 ugers dyrkning i 3D biomimetiske hydrogeler. Værdier er normaliseret til våd vægt (WW) og udtrykt som pg / g. (B) Trykstyrke modul (kPa) i acellulære og celle-lastet hydrogeler på dag 1 og efter 3 ugers dyrkning i 3D biomimetiske hydrogeler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Som rapporteret i denne protokol, 3D hydrogeler er i stand til at opretholde chondrocyt fænotype i kultur, så man undgår processen med celle dedifferentiation i fiberbrusk celler normalt støder på med monolagskulturer 15. Desuden langsigtede kulturer i chondrocytes- hydrogel konstruktion afslørede et gunstigt miljø, der fastholder de iboende celle træk forbundet med alder og sygdom.
Anvendelsen af en 3D biomimetiske hydrogel har flere fordele. Først optagelse af chondroitinsulfat (CS), en hovedkomponent findes i ledbrusk, aktivere celler til at nedbryde hydrogelmatriksen ved at udskille chondroitinase og fastsætte nyligt syntetiserede brusk extracellulære matrix 5, 16. Desuden har CS påvist at have anti-inflammatoriske egenskaber i arthritiske led. Den biomimetiske hydrogel kan også anvendes som et stillads materiale til celle levering i reparation af brusk, og kan være kemisk modificeretat fremme en bedre væv-biomateriale integration 17,18.
Anvendelsen af PEG-hydrogeler CS tillader langvarige kulturer af chondrocytter og evalueringen af biokemiske og mekaniske egenskaber. Her viser vi, hvordan denne platform kan være nyttige for de komparative analyser af forskellige kilder af differentierede chondrocytter med henblik på at fastlægge den optimale celletype til brusk teknik. Interessant chondrocytter indkapslet i hydrogeler forblive levedygtig og formere henhold til deres iboende evner. Hydrogelsammensætningen understøtninger, i virkeligheden, væksten af sunde unge og voksne chondrocytter som vist i figur 2. Sammensætningen og strukturen af de beskrevne hydrogeler fremmer også bruskvæv dannelse som angivet ved aflejring af en funktionel ekstracellulær matrix vurderet af glycosaminoglycan (GAG ) kvantificering.
En yderligere fordel er, at chondrocyt-hydrogel konstruktionerkan vurderes for de mekaniske egenskaber af det nydannede bruskvæv. Bemærk, at den unconfined kompression testen skal udføres på acellulær hydrogel til sammenligning. Hydrogelerne, faktisk har en iboende stivhed på grund af stivheden af CS dele. Unconfined komprimering stamme af 5-20% (ved en belastning på 1% / s) kan anvendes til mekanisk afprøvning af bruskvæv 11,12 siden fysiologisk belastning opleves af bruskvæv under belastningstilstand er blevet rapporteret at være 10-20 % 13,14. Svaret fra både celle-lastet og acellulære hydrogeler til mekanisk prøvning blev evalueret ved kulturen endepunkt. I det beskrevne eksempel ovenfor har vi observeret en sammenlignelig stivhed af konstruktioner indeholdende voksen og unge chondrocytter i modsætning til den nedre stivhed af konstruktioner indeholdende OA chondrocytter. Sådanne mekaniske egenskaber af cellen-hydrogel konstruktion mulighed for at vurdere de funktionelle egenskaber afdannede væv giver en dybtgående analyse af cellemodning evne.
Som konklusion kan i vid udstrækning anvendes brugen af 3D biomimetiske hydrogeler at undersøge mulighederne for forskellige chondrocytpopulation at generere bruskvæv. Udover de in vitro-undersøgelser, der beskrives her, kan in vivo transplantation af cellen lastet konstruktioner kan forestille sig at studere celle modning og regenerativ potentiale i fysiologiske kontekst. Yderligere modifikationer af hydrogel platform med yderligere biomimetiske faktorer kan også forestille sig at optimere chondrocyt proliferation og modning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System ) | Lonza | CC-2550 | |
| adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System) | Lonza | CC-2550 | |
| poly(ethylene glycol diacrylate) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-1000-1g | |
| 2-morpholinoethanesulfonic acid | Sigma | M5287 | |
| photoinitiator | Irgacure | 2959 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| chondroitin sulfate sodium salt | Sigma | C9819 | |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma | 130672 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride | Sigma | E1769 | |
| 2-aminoethyl methacrylate | Sigma | 516155 | |
| dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132700 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Collagenase 4 | Worthington Biochemical | LS004189 | |
| DMEM/F12 media | HyClone, Thermo Scientific | SH3002301 | |
| live/dead assay | Life Technologies | L3224 | |
| Tri reagent | Life Technologies | AM9738 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt | Sigma | E5134 | |
| L-Cysteine | Sigma | C1276 | |
| 1,9-dimethylmethylene blue | Sigma | 341088 | |
| Instruments | |||
| UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm | UVP | 95-0042-07 | |
| Instron 5944 testing system | Instron Corporation | E5940 |
References
- Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation. Knee. 16, 398-404 (2009).
- Smeriglio, P., et al. Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels. Tissue engineering. Part A. , (2014).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Scientific reports. 3, 3553 (2013).
- Taipale, J., Keski-Oja, J. Growth factors in the extracellular matrix. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).
- Varghese, S., et al. Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta. Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).
- Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness. Tissue engineering. Part A. , (2014).
- Smith, R. L., et al. Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro. J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).
- Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).
- Lai, J. H., Levenston, M. E. Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).
- Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression. Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).
- Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load. The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).
- Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. Cartilage stresses in the human hip joint. Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).
- Wang, D. A., et al. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration. Nat Mater. 6, 385-392 (2007).
- Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive. Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).
