Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Stanford University Menschliche Probanden Richtlinien durchgeführt und genehmigt Institutional Review Board-Protokoll.
1. Articular Chondrozyten Isolation
- Erhalten Knorpel von Gewebe während der Knieendoprothetik verworfen und sezieren wie zuvor 8 beschrieben.
- Visuell wählen Sie die medialen oder lateralen Femurkondylen Knorpelproben für glatte Oberflächen und machen Schnitt an der Oberfläche des Knorpels durch ein Skalpell, um 4-5 mm Knorpelbiopsien, ohne den subchondralen Knochen zu entfernen.
- Isolieren Chondrozyten aus der extrazellulären Matrix durch enzymatische Dissoziation des Gewebes mit O / N Behandlung mit gereinigter Collagenase. Verwendung 1: 1-Verhältnis von Collagenase II (125 U / ml) und Collagenase IV (160 U / ml) in Chondrozyten Wachstumsmedien bei 37 ° C.
- Am folgenden Tag, filtern das verdaute Gewebe, das die dissoziierten Zellen durch eine 70mm Porengröße Nylon-Mesh. Zweimal Waschen mit 20 ml DMEM / F12 und zentrifugiert bei 600 g für 5 min.
- Plate Die isolierten Chondrozyten in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / 60 mm Kulturschale nach Resuspension in DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 25 ug / ml Ascorbat, 2 mM L-Glutamin, antimikrobielle Mittel (100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 ug / ml Fungizon). Halten die Platten bei 37 ° C und der Primär Chondrozytenkulturen als hochdichten Monoschicht aufrechtzuerhalten vor der Verkapselung in biomimetischen Hydrogelen.
2. Biomimetic Hydrogel Fabrication
Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht die Synthese eines biomimetischen Hydrogel Poly (ethylenglykoldiacrylat) (PEGDA, MW 5000 g / mol), Chondroitinsulfat-Methacrylat (CS-MA) in DPBS. Die Zugabe von Photoinitiator ermöglicht photoaktivierten Vernetzung. Die endgültige Hydrogel-Zusammensetzung enthält 7% wiegent / Volumen (w / v) PEGDA, 3% w / v des CS-MA und 0,05% w / v des Photoinitiators.
- Synthetisieren CS-MA durch Funktionalisierung CS Polymers mit Methacrylatgruppen.
- Vorbereitung gepufferte Lösung von 50 mM 2-Morpholinoethansulfonsäure (MES) und 0,5 M Natriumchlorid (NaCl) durch Auflösen von 1,952 g MES und 5,84 g NaCl in 200 ml entionisiertem Wasser (DiH 2 O). Aufzulösen 5 g Chondroitinsulfat-Natriumsalz in der gepufferten Lösung.
- Hinzufügen von 0,532 g (4,62 mmol) N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 1.771 g (9.24 mmol) 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) (Molverhältnis von NHS-EDC = 1: 2) die Lösung und rühren für 5 min.
- Hinzufügen 0,765 g (4,62 mmol) 2-Aminoethyl-Methacrylat (AEMA) (Molverhältnis von NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) zu der Lösung und Aufrechterhaltung der Reaktion bei RT für 24 h.
- Reinigt das Gemisch durch Dialyse gegen deionisiertes Wasser (DIH 2 O) für 4 Tage unter Verwendung eines Dialyseschlauches (12-14 kDa MWCO).
- Filtern Sie die purified Lösung durch ein 0,22 um-Filter und setzen Sie die offenen Röhrchen, die die Lösung in dem Exsikkator und Vakuum O / N. Stellen Sie sicher, dass alle Rohre werden vor Licht geschützt. Bewahren Sie die gelösten Polymers bei -20 ° C vor Licht und Feuchtigkeit geschützt.
3. Zell Encapsulation
- Autoklaven werden die PCR Film und zylindrische Stäbe (zum Ausstanzen der zellbeladene Hydrogele 3D) und zu sterilisieren die maßgeschneiderte zylindrischen Gelform durch Eintauchen in 0,2 um gefiltert 70% Ethanol in Gewebekultur Haube unter UV-Licht.
- Verschließen Sie den Boden des Gels Form mit autoklaviert PCR Folie ohne Luftblasen oder Lücken, um Lecks zu verhindern. Halten Sie es in einer sterilen 150 mm Platte.
- Der Tag vor der Verkapselung von Zellen in biomimetischen Hydrogel, distanzieren die High-Density-Chondrozyten-Monoschicht mit O / N-Behandlung in Collagenase II und Collagenase IV-Lösung. Verwenden 125 U / ml Collagenase II und 160 U / ml Kollagenase VI jeweils in Chondrozyten Nährmedienbei 37 ° C.
- Nehmen Sie einen 50-ml-Röhrchen und geben Sie 5% Gewicht / Volumen (w / v) Poly (Ethylenglykoldiacrylat) (PEGDA, MW = 5000 g / mol), 3% w / v Chondroitinsulfat-Methacrylat (CS-MA), und 0,05% w / v-Photoinitiator in DPBS. Das Röhrchen vortexen, um die Lösung zu mischen und halten Sie sie beiseite. Schützen Sie den Schlauch vor Licht.
- Sammeln Sie die dissoziierten Zellen in einem 50 ml Falcon-Röhrchen, zählen und Zentrifuge bei 460 xg für 5 min. Saugen Sie alle Medien aus den Zellen Rohr und fügen Sie die obigen gemischten Gel-Material zu resuspendieren Zellen in einer Dichte von 15 x 10 6 Zellen / ml. Mischen Sie es 30 Mal gründlich unter Vermeidung von Luftblasen-Bildung.
- Pipette 72 ul der Zellsuspension-Hydrogel oder Hydrogel allein in die maßgeschneiderte zylindrischen Gelform an und beeinflussen die Gelierung durch Bestrahlung mit UV-Licht (365 nm Wellenlänge) bei 3 mW / m 2 für 5 min. Bereiten Sie eine Hydrogel-Lösung ohne Zellinhalt. Verwenden Sie diese Konstrukte als Negativkontrollen für die Zukunft biochemische und mechanische Prüfungen. Measure der Intensität der UV-Licht mit einer UV-Intensität Meter. So passen Intensität, ändern Sie den Abstand zwischen der UV-Lichtquelle und dem Hydrogel Gerüst während der Gelierung.
HINWEIS: Da das Hydrogel CS wird die azelluläre Beitrag der biochemischen GAG-Gehalt der zellbeladenen Hydrogele abgezogen, um nur die Zell GAG darzustellen. - Verwenden Sie ein Skalpell, um den Film für leicht entfernen abgeschnitten und ziehen Sie sie vorsichtig. Mit Hilfe der zylindrischen Stangen, Push-out des Gels in einer 6-Well-Platte mit 5 ml sterilem DPBS abzuwaschen nicht polymerisierten Gel und lose Zellen.
- Kultur die Zellbeladene Hydrogele in 24-Well-Platten mit 1,5 ml Knorpelzellwachstumsmedien in jedes Well. Verwenden Sie eine Einweg-Spatel, um die gewaschenen Hydrogele in den Brunnen zu übertragen.
- Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch Live tot-Färbung von 24 Stunden nach der Einkapselung mit einem Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Kit. Kultur die Zellbeladene Hydrogele und die leeren Hydrogele für 3-6 Wochen zu ändern, um frische Chondrozyten growth Medien alle 2 Tage vor der Ernte für Analysen.
4. RNA-Extraktion und Genexpressionsanalysen
- Die Medien sorgfältig absaugen und legte sterilem PBS 1X auf dem Cell-beladenen als auch die leeren Steuer Hydrogele.
- Mit Hilfe eines sterilen Spatels Übertragung jedes Hydrogel in ein sauberes 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen und füge 250 ul Tri-Reagenz in jedes Röhrchen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um RNA zu isolieren.
- Nach RNA-Isolierung und Quantifizierung Verwendung 1 ug es von jeder Probe und führen Sie eine umgekehrte Transkription in cDNA unter Verwendung des High Capacity cDNA umge Transcription Kit.
- Für die quantitative PCR verwenden TaqMan Gene Expression Arrays zur Untersuchung der Expression von Ihren Genen von Interesse. Normalisieren die Genexpression intern auf GAPDH.
- Für die PCR-Bedingungen sind eine 2-minütige Inkubation bei 50 ° C zur vorherigen Amplicons mit Uracil-DNA-Glycosylase inaktivieren, gefolgt von einer 1060; min Inkubation bei 95 ° C, um die Taq-Polymerase zu aktivieren. Führen dann vierzig Zyklen PCR, bestehend aus 15 Sekunden bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C.
5. Biochemische Analysen
- Für jede Zelle-Hydrogel-Konstrukte zu quantifizieren DNA und sulfatiertes Glykosaminoglykan (SGAG) Produktion wie folgt.
- Die Medien sorgfältig absaugen und legte sterilem PBS 1X auf dem Cell-beladenen als auch die leeren Steuer Hydrogele. Wiegen Sie eine leere Hülse und legte das Hydrogel im Inneren nach dem Blotten auf Tissue-Papier und das Gewicht aufgezeichnet oder Nassgewicht der Hydrogele.
- Gefriert jedes Hydrogel bei -20 ° C in einem getrennten 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen zur enzymatischen Verdauung und späteren Verwendung ein Aliquot der verdauten Produkt Picogreen Assay (für DNA) und Dimethyl-Methylenblau-Test (GAG) laufen.
- Bereiten Sie die papainase Lösung für die enzymatische Verdauung der Hydrogele.
- Bereiten Sie zuerst die PBE-Puffer durch Auswiegen 7,1 g Natrium-phosphate zweibasigen (Na 2 HPO 4) und 1,6 g Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA-Na 2). Lösen sich in 500 ml dH 2 O, der pH-Wert auf 6,5 eingestellt und filtriert die gereinigte Lösung durch ein 0,22-mm-Filter.
- Aufzulösen 0,035 g L-Cystein in 20 ml PBE Puffer. Die Lösung wird filtriert, und 100 ul steriles Enzym Papain.
- Wenn Sie bereit sind, um die Tests durchzuführen, nehmen Sie die Schläuche von -20 ° C und 300 ul der bereit Papain Lösung der eingefrorenen Hydrogele. Crush das Gel mit einem Mörser und Stößel und mischen Sie es gut mit dem Motor Stößel.
- Bringen Sie das Volumen auf 500 ul mit zusätzlichen Papain-Lösung. Führen Sie das gleiche Verfahren für die Steuer Gele. Inkubieren bei 60ºC für 16 Stunden 3,9. Die Lösung, die verdaut Hydrogel kann daher für die DNA- und GAG Quantifizierung verwendet. Messen Sie den DNA-Gehalt unter Verwendung des Picogreen Assay mit Lambda-Phagen-DNA als Standard folgende Hersteller protocol.
- Quantifizierung der sulfatierten-GAG-Gehalt unter Verwendung des 1,9-Dimethylmethylen blau (DMMB) Farbstoffbindungsassay mit Hai Chondroitinsulfat als Standard 10. Bestimmen Sie die GAG-Gehalt durch Division der Menge an GAG für den entsprechenden Nassgewicht.
6. Mechanische Prüfung
- Führen einaxialen Druckversuche unter Verwendung eines Instron 5944-Testsystem mit einem 10 N Wägezelle ausgestattet.
- Nach der gewünschten Tagen der in vitro-Kultur, führen Sie den Druckversuch auf dem Cell-Hydrogel-Gerüst und die azellulären Steuer Hydrogele.
- Tauchen Sie die Proben in einem PBS-Bad bei RT und Komprimieren in einer Rate von 1% Dehnung / sec zu einer maximalen Dehnung von 15% 11,12 da die physiologische Belastung von Knorpelgewebe unter Beladungszustand erfahren hat, wurde berichtet, dass 10-20% betragen 13,14.
- Erstellen Sie Stress gegen Dehnungskurven und Kurvenanpassung mit einem Polynom dritter Ordnung Gleichung. Bestimmen Sie die comprEssiv Tangentenmodul aus der Kurvengleichung bei Dehnungswerte von 15%.
Representative Results
Bioaktive Hydrogele, die PEG und CS-Einheiten (Abbildung 1) stellen eine ideale Plattform für Kultur und Reifung von menschlichen Chondrozyten 2,3,5,7. Chondrozyten aus unterschiedlichem Alter und Krankheitszustände können mit dem beschriebenen Verfahren kultiviert und auf ihren Phänotyp, der Genexpression und biochemische und mechanische Eigenschaften des erzeugten Knorpelgewebe zu analysieren. Drei Chondrozyten-Proben, juvenile- 6 Monate, Erwachsenen- 34 Jahre und osteoarthritic- 74 Jahre, wurden nach 3 Wochen Kultur in 3D biomimetische Hydrogele geerntet. Genexpressionsanalysen der normalen Chondrozyten, sowohl jugendlichen und erwachsenen, zeigten einen Anstieg der Expression der Chondrozyten-Genen COL2A1 und Col6a1. Im Gegensatz dazu zeigten erkrankten Chondrozyten eine dramatische Abnahme der COL2A1, während die Expression von Col6a1 (Abbildung 2), die einen Verlust von chondrogenen Phänotyp, obwohl sie in einem günstigen biomimetischen Umgebung kultiviert.
Die CS-PEG Hydrogele auch als ein dynamisches Umfeld für die Chondrozyten zur Proliferation zu dienen, verdauen die bereits bestehenden Matrix von PEG und CS und legen ihre perizellulären und der extrazellulären Matrix, die Hauptbestandteile des reifen Knorpelgewebe. Angesichts dieser Möglichkeiten, Chondrozyten Expansion nach 3 Wochen in vitro-Kultur kann durch Quantifizierung der DNA mit dem Picogreen Farbstoff geschätzt werden. Vergleichsanalyse der drei Gruppen von Zellen zeigen, dass die Zelldichte von jugendlichen und erwachsenen Bevölkerung war unverändert, während OA Chondrozyten zeigte einen dramatischen Abfall im Vergleich zu Tag 1 der Kultur. Ein Verlust von DNA-Gehalt wurde auch für OA, aber keine anderen Chondrozyten Eingabe mögliche Zelltod während der Langzeit-Kultur (Abbildung 3) beobachtet. Das sezernierte Matrix wurde als sulfatiertes GAG-Gehalt von DMMB Farbstoffbindungstest am Endpunkt Stufe nach 3 Wochen der Kulturen quantifiziert. GAG-Gehalt wird durch das Feuchtgewicht des Hydrogels als recor normalisiertded vor dem enzymatischen Abbau und dem azellulären Beitrag subtrahiert. Wie in 4 gezeigt, abgeschieden Chondrozyten eine ähnliche signifikante Menge an GAG während 3 Wochen Kultur in 3D Hydrogelen.
Die Anwesenheit eines physikalischen Gerüst ermöglicht die Auswertung der biomechanischen Eigenschaften der Proben durch einaxialen Druckversuch 2,3. Während azellulären Hydrogele werden einer Abnahme der Druckmoduln gehalten zellbeladene Konstrukte die Druckmodule nach 3 Wochen in Kultur (Abbildung 4). Die phänotypische, hier beschriebenen biochemischen und biomechanischen Analysen sind daher nützlich für die Bewertung und das Verständnis des Potenzials der verschiedenen Knorpelzellpopulationen für Engineering Knorpel.
Abbildung 1. PEG-CS biomimetische Hydrogele für 3D-Chondrozyten-cultur. Chondrozyten werden in einer Mischung, die Poly (ethylenglykoldiacrylat) (PEGDA) und Chondroitinsulfat-Methacrylat (CS-MA) und in die maßgeschneiderte zylindrischen Gelform gegossen resuspendiert. Nach der UV-Belichtung, verfestigte Gele werden aus den Formen gesammelt und die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Live-tot-Färbung von 24 Stunden nach der Einkapselung bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Expression von Genen chondrogene in humanen Chondrozyten in 3D biomimetische Hydrogele kultiviert. Quantitative Genexpressionsknorpelmarker COL2A1 und Col6a1 von jugendlichen, erwachsenen und OA Chondrozyten nach 3 Wochen der Kultur in 3D biomimetische Hydrogele. Werte werden auf Genexpressionsebene an Tag 1. Fehler b normiertars stellen Mittelwert ± Standardabweichung. p * <0,05, wie durch einen zweiseitigen Student t-Test bestimmt. Geändert von Smeriglio et al. 2 Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. DNA-Gehalt in humanen Chondrozyten in 3D biomimetische Hydrogele kultiviert. DNA-Quantifizierung durch Picogreen Assay in juvenile, Erwachsenen-und OA Chondrozyten nach 3 Wochen der Kultur in 3D biomimetische Hydrogele. Werte werden auf DNA-Ebene an Tag 1 normiert Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
<br /> Abbildung 4. GAG-Gehalt Messung und einaxialen Druckversuch der menschlichen Knorpelzellen an Tag 1 und nach 3 Wochen der Kultur in 3D biomimetische Hydrogele. (A) GAG Quantifizierung durch DMMB Assay in Chondrozyten an Tag 1 und nach 3 Wochen der Kultur in 3D biomimetische Hydrogele. Die Werte sind normiert auf Gewicht (ww) benetzen und ausgedrückt als & mgr; g / g. (B) Druckmodul (kPa) von azellulären und zellbeladene Hydrogele am Tag 1 und nach 3 Wochen Kultur in 3D biomimetische Hydrogele. Bitte klicken Sie hier, um zu sehen eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Wie in diesem Protokoll angegeben, sind 3D-Hydrogele in der Lage, von Chondrozyten Phänotyp in Kultur zu halten, die Vermeidung der Prozess der Zell Entdifferenzierung in Faserknorpel-Zellen in der Regel mit Monolayer-Kulturen 15 angetroffen. Außerdem Langzeitkulturen der chondrocytes- Hydrogel Konstrukt zeigte eine günstige Umgebung, die die innere Zellfunktionen mit dem Alter und Erkrankung assoziiert beibehält.
Die Verwendung eines 3D biomimetischen Hydrogel hat mehrere Vorteile. Erstens ist die Aufnahme von Chondroitinsulfat (CS), eine wichtige Komponente im Gelenkknorpel gefunden, aktivieren Zellen, um die Hydrogelmatrix durch Sekretion von Chondroitinase abbauen und legte sich neu synthetisierte Knorpelextrazellulären Matrix 5, 16. Darüber hinaus CS hat sich gezeigt, In den entzündungshemmenden Eigenschaften im arthritischen Gelenk haben. Die biomimetischen Hydrogel kann auch als Gerüstmaterial für Zellabgabe bei der Knorpelreparatur verwendet werden, und können chemisch modifiziert seinum bessere Gewebe-Biomaterial Integration 17,18 zu erleichtern.
Die Verwendung der PEG-CS Hydrogele ermöglicht Langzeitkulturen von Chondrozyten und die Bewertung der biochemischen und mechanischen Eigenschaften. Hier zeigen wir, wie diese Plattform kann nützlich für die vergleichende Analysen der verschiedenen Quellen von differenzierten Chondrozyten, um die optimale Zelltyp für die Knorpeltechnik zu definieren. Interessant ist, dass Chondrozyten in Hydrogele gekapselt lebensfähig bleiben und sich vermehren nach ihrem inneren Fähigkeiten. Hydrogelzusammensetzung Träger, in der Tat, das Wachstum von gesunden jugendlichen und erwachsenen Chondrozyten, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Zusammensetzung und Struktur der beschriebenen Hydrogele fördert auch die Knorpelgewebebildung, wie durch die Abscheidung einer funktionelle extrazelluläre Matrix durch Glycosaminoglycan beurteilt (GAG deutet ) Quantifizierung.
Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass die Chondrozyten-Hydrogel-Konstruktekönnen für die mechanischen Eigenschaften des neu gebildeten Knorpelgewebe zu bewerten. Beachten Sie, dass der einaxialen Drucktest sollte auf der azellulären Hydrogel zum Vergleich durchgeführt werden. Die Hydrogele in der Tat, eine Eigensteifigkeit auf Grund der Steifigkeit der CS-Einheiten. Einaxialen Druckverformung von 5-20% (bei einer Verformungsgeschwindigkeit 1% / s) kann für die mechanische Prüfung von Knorpelgewebe 11,12, da die physiologische Belastung von Knorpelgewebe unter Beladungszustand erlebt anzuwenden wurde berichtet, dass 10 bis 20 sein 13,14%. Die Reaktion der beiden Zellbeladenen und azellulären Hydrogele mechanische Prüfung wurde bei der Kultur Endpunkt ausgewertet. In dem beschriebenen Beispiel über beobachteten wir eine vergleichbare Steifigkeit der Konstrukte, die bei Erwachsenen und Jugendlichen Chondrozyten in Gegensatz zu der geringeren Steifigkeit der Konstrukte enthaltenden OA Chondrozyten. Solche mechanischen Eigenschaften der zell Hydrogel Konstrukt erlauben die Beurteilung der funktionellen Eigenschaften desgebildete Gewebe geben eine eingehende Analyse der Zellreifung Fähigkeit.
Abschließend kann die Verwendung der 3D biomimetischen Hydrogele, um das Potential verschiedener Chondrozytenpopulation studieren, um Knorpelgewebe erzeugen weithin angewandt werden. Neben den hier beschriebenen in vitro-Studien können in vivo Transplantation der Zellen beladene Konstrukten vorgesehen, um die Zellreifung und Regenerationspotential im physiologischen Bereich zu untersuchen. Weitere Modifikationen des Hydrogels Plattform mit zusätzlichen biomimetischen Faktoren können ebenfalls in Betracht gezogen werden, um Chondrozytenproliferation und Reifung zu optimieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System ) | Lonza | CC-2550 | |
| adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System) | Lonza | CC-2550 | |
| poly(ethylene glycol diacrylate) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-1000-1g | |
| 2-morpholinoethanesulfonic acid | Sigma | M5287 | |
| photoinitiator | Irgacure | 2959 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| chondroitin sulfate sodium salt | Sigma | C9819 | |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma | 130672 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride | Sigma | E1769 | |
| 2-aminoethyl methacrylate | Sigma | 516155 | |
| dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132700 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Collagenase 4 | Worthington Biochemical | LS004189 | |
| DMEM/F12 media | HyClone, Thermo Scientific | SH3002301 | |
| live/dead assay | Life Technologies | L3224 | |
| Tri reagent | Life Technologies | AM9738 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt | Sigma | E5134 | |
| L-Cysteine | Sigma | C1276 | |
| 1,9-dimethylmethylene blue | Sigma | 341088 | |
| Instruments | |||
| UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm | UVP | 95-0042-07 | |
| Instron 5944 testing system | Instron Corporation | E5940 |
References
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