ここでは、大規模な皮質梗塞と持続的な赤字を生成するために、頸動脈の同時閉塞と高齢雌ラットの永久遠位中大脳動脈閉塞を生成するためのプロトコルを提示します。私たちは、脳卒中後24時間および8週目に構造的MRIを用いて、病変の大きさの確認を示します。
脳卒中は、一般的に頸動脈(または他の動脈)、アテローム性動脈硬化症、高血圧、肥満や糖尿病などの併存疾患の範囲で高齢者に起こります。動物での脳卒中の治療法を評価する際に、それは優れた表面的妥当性を持つモデルを選択することが重要です。虚血性卒中は、全卒中の80%を占め、これらの大部分は、身体の反対側に永続plegiaまたは麻痺を引き起こし、多くの場合、感覚運動皮質に影響を及ぼす梗塞を誘導し、中大脳動脈(MCA)の領域で起こります。私たちは、このビデオで持続的な感覚障害とかなりの皮質梗塞の原因となる高齢ラットにおける虚血性脳卒中の製造方法を示しています。具体的には、この動脈の短いセグメントを閉塞するジアテルミー鉗子を使用して、高齢雌ラットに永久遠位中大脳動脈閉塞(MCAO)を誘導します。病変と同側の側の頸動脈は、p次いでermanently閉塞および反対頸動脈を一時60分間閉塞しました。我々は、24時間および脳卒中後8週で、構造T2加重磁気共鳴画像(MRI)を用いて梗塞サイズを測定します。この研究では、平均梗塞容積は24時間で同側半球の2.0%(標準偏差)±4.5%であった(Gerrietの式を用いて脳腫脹について補正、N = 5)。このモデルは、病態生理学的メカニズムおよび新規治療法の解明のために重要である、それは持続的な感覚赤字の誘導を可能にするように実現可能と臨床的に関連しています。
脳卒中は、現在、世界中で死亡の第三の最も一般的な原因と障害1の主な原因です。すべてのストロークの80%を占める虚血性脳卒中は、多くの場合、運動機能に影響を受けた側2-4へのこだわりで、( 例えば 、固有受容)感覚の損失を引き起こす皮質梗塞になります。中大脳動脈(MCA)は、ウィリス動脈輪から供給を描画し、内頸動脈5から生じる血管の最大です。 MCAは、この地域でのストロークがすべての虚血性脳卒中6,7の65%を占めて、最も一般的な虚血性脳卒中に影響を受けた脳血管です。 MCAは、閉塞7の正確な場所に応じて異なり皮質と皮質下領域およびMCA脳卒中によって引き起こされる神経学的異常の両方を提供します。近位MCA閉塞はlenticulostriatal動脈を通じて深い領土に影響を与え、コルティの両方を包含する大きな梗塞を引き起こしますCALおよび皮質下の領域。対照的に、血流の単独皮質領域を奪うより遠位の閉塞は、より小さな皮質梗塞を生成する傾向があります。
大集団研究では、ヒト脳卒中病変が同側半球8,9の5から14パーセントの範囲です。悪性のストロークはストロークの10%を占め、頭蓋内圧を減少させるためにhemicraniectomyを必要とする、より大きな梗塞をもたらす、小さい病変を有する患者は、10を生き残る可能性が高いです。我々は、多くの人間のストロークのような半球の同様の割合を占める病変を生成する再現可能なモデルを示しています。
脳卒中は、不均一な疾患です。虚血性脳卒中の75%が(頭蓋内小血管の閉塞から)ラクナ梗塞のいずれかによって誘導されます。心原ストローク;ストロークの30%を占めているか大動脈アテローム性動脈硬化症、。症候性アテローム性動脈硬化症は、最も頻繁に共通のC点で観察されます内部および外部の頸動脈11にarotid動脈(CCA)の支店。
脳卒中の前臨床モデルは、その病態生理をシミュレートするために、できるだけ人間の条件と同様であるべきであり、脳卒中の危険因子を組み込む必要があります。虚血性脳卒中の92%は65歳以上の人々において発生し、以前に12を説明したように、他の危険因子には、肥満、高血圧、およびアテローム性動脈硬化症が挙げられます。より良いこれらの危険因子を表すには、自然状態の病態生理学的特徴のいくつかを共有することができるモデルを使用することをお勧めします。このプロトコルでは、我々は、頸動脈を介して高度な年齢や閉塞血流が含まれています。
中大脳動脈閉塞(MCAO)の古典的なモデルは、前部および中大脳動脈の血流を減少させ、近位MCA閉塞の腔内フィラメントモデルです。このモデルを使用して短い閉塞時間は、Lを集光皮質下の領域にesion、長い閉塞時間は高齢ラットで高い死亡率で、その結果、両方の皮質および皮質下領域の面積を募集大きな病変をもたらすことができる一方。比較では、私たちのグループによって使用されるモデルは、開頭術と双極性焼灼鉗子を使用して、MCAの小さな部分の血と破壊の凝固に続いて硬膜の開口部が実施されます。このジアテルミーモデルは23。田村らにより 1981紙から適応され、頭蓋骨切除術の使用は、閉じ頭蓋骨の特徴である頭蓋内圧亢進を制限し、当社の手術コホートにおいて高い再現性と低い死亡率の結果かもしれいくつかの他のモデル13に比べ。再現性梗塞と持続的な障害を発生させるために、我々は、(Chenら14我々は、使用する非侵襲性のT2強調磁気共鳴画像ごとにMRIを遠位CCAを恒久的に近位CCAを閉塞し、一過性閉塞します)程度と脳梗塞の位置、および感覚皮質において脳腫脹の程度を評価します。
げっ歯類におけるMCAOは、多くの場合、人間のストロークをモデル化するために使用される技術です。このモデルは、プロトコルに注意すべきいくつかの詳細を持っています。第一に、梗塞のサイズおよび研究における死亡数に影響を与えるように実験を通して、動物の体温を維持するために不可欠です。右CCAの一過性閉塞中にイソフルランを中止し、イソフルランへの曝露を減らすことにより、生存率を高めるために温め、静かな環境でラットを維持することが可能です。研究者は、追加の誘導のストレスを上回る短い麻酔期間かどうかを検討する必要があります。ラットの血管系( 例えば 、MCA分岐)は、内および動物22のコホート間で変化します。新しい研究を始めたときには、この点に注意を負担することが重要です。別のCCAの閉塞時間を評価することができる(例えば、30、45、60及び90分)。この研究では60分間の閉塞時間が使用されます。他の研究では、45ことを発見しました分閉塞は、同様のサイズの皮質梗塞を引き起こすが、改善された生存率の事例証拠と。したがって、外科医が得られるだけにして、必要な場合に閉塞時間を増加させるために十分な病変のボリュームかどうかを確認(および/ または行動障害を必要)するために、短い閉塞時間( 例えば 、30分)で開始しています。行動の赤字は、同一の閉塞時間を持つ高齢ラットと比較して成体ラットに持続されていません。
MRI(特に閉塞時間後)病変容積は、研究目的のために適切であるか否かを判断するために使用することができます。小さな病変は(40のうち)10個未満の0.5ミリメートルの冠状スライスにまたがることになります。中規模の病変が10と20の冠状スライスの間にまたがることになります。大きな病変が20と30の冠状スライスの間にまたがることになります。非常に大規模な病変が40スライス以上の30に及ぶことになります。私たちの経験では、非常に大きな病変(以上30スライス)および/またはヘルニアのアクロスの証拠を有するラットsの正中線は通常、予後不良を持っている:短い閉塞時間が考慮されることがあります。 MRIはまた梗塞の位置を評価するために有用である:いくつかは、より尾側に位置しており、一部はより吻側に位置しています。
両方の総頸動脈から迷走神経を分離する際に細心の注意を払ってください。ラ音(ガリガリ)は、脳卒中手術後に発生する可能性があり、原因は現在不明であるが、これは、いくつかの動物では神経損傷に起因することができます:私たちの経験では、予後はこれらの動物のために非常に貧弱であり、それは通常、人道的に彼らを殺すことをお勧めします。
再現性皮質梗塞や高齢ラットにおいて許容術後生存率の恒久的ジアテルミーMCAOモデルの結果。技術は、しかしながら、実体顕微鏡下侵襲手術を必要としません。動物は、手術から十分に回復することである場合、無菌技術を維持することが重要です。ケアは、動脈を露出させ、凝固しながら、MCAを損傷しないように注意する必要があり、皮質表面へのダメージは、そうでなければ皮質の露出面積は、梗塞領域の一部を形成することができる最小にすべきです。手順を確立するために、一貫性梗塞を達成するために、研究は、例えば、候補治療法をテストするために実行される前に、閉塞時間を決定し、できるだけ多くの経験を得ることが推奨されます。実験者は、(「ブロックランダム化」)の可能な手術セッション内の任意の治療をランダム化する必要があります。これは、(過渡MCAライゲーションではなくジアテルミーのに使用されていない限り)このモデルは、MCAの再灌流を伴わないことは注目に値します。死亡率は、これらの大規模な皮質梗塞と高齢ラットにおいて高いことができますが、短い閉塞時間を使用し、可能な場合( 例えば 、閉塞中に)全身麻酔への暴露を最小限に抑えることにより、死亡率を減少させることが可能であるべきです。イソフルランの低いレベルを可能にすることができる担体として70%N 2 Oおよび30%O 2の使用は、使用される:isofluこの縮小露光をRANEは、より高い生存率をもたらすことができます。
考慮すべきもう一つのポイントは、このプロトコルでは、我々は急性CCA閉塞とそれをシミュレートするのに対し、アテローム性動脈硬化症は、漸進的なプロセスであることです。しかし、血流と持続的な赤字の大幅な削減は、多くの脳卒中患者で発生するタンデム閉塞をシミュレートします。ラットにおける永久遠位MCAOタンデムCCAのない閉塞は、再現性14ストロークを誘導するために失敗します。また、タンデムCCA閉塞することなく、我々はかなりの自発的回復はそれが8週間にわたって脳卒中治療の長期的な行動の評価を妨げる発生を発見しました。これとは対照的に、我々はタンデムCCA閉塞遠位MCAOは、高齢ラットにおける長期的な赤字を誘導することを示しています。
結論として、ラットでこの手順では、持続的な1は、新規治療法のテストを可能にするために使用することができます障害や再の解明と、人間の状態で見られるものにサイズと位置が似ているストロークを引き起こし虚血性脳卒中後のペアメカニズム。
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. I Mhairi Macrae and Dr. Debbie Dewar, University of Glasgow, who kindly hosted CW and DD for training in this procedure. The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM. This work was also supported by a “Serendipity Grant” from The Dunhill Medical Trust to LM [grant number: SA21/0512].
Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Isoflurane | Abbott | B506 | |
Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
Cautery system | Eschmann | ||
0.25 mm Jeweler caurtery forceps | Eschmann | 8330349 | |
fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Thumb driven saline drip system | |||
Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
16 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
Vascular clip and applicator | |||
Operating microscope | Zeiss | ||
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
25g needles | Terumo | NN-2525R | |
syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
gauze | sterilize before use | ||
Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |