Her præsenterer vi en protokol til at producere permanent distal midterste cerebral arterie okklusion hos ældre hunrotter med samtidig okklusion af carotis arterierne til at generere store kortikale infarkter og vedvarende underskud. Vi viser bekræftelse af læsionens størrelse under anvendelse strukturel MRI ved 24 timer og 8 uger efter slagtilfælde.
Slagtilfælde typisk forekommer hos ældre mennesker med en række følgesygdomme herunder carotis (eller anden arteriel) atherosklerose, forhøjet blodtryk, fedme og diabetes. Derfor når de evaluerer terapier for slagtilfælde hos dyr, er det vigtigt at vælge en model med fremragende ansigt gyldighed. Iskæmisk slagtilfælde tegner sig for 80% af alle slagtilfælde, og størstedelen af disse forekommer i det område af den midterste cerebrale arterie (MCA), ofte fremkalde infarkter, der påvirker sensomotoriske cortex, der forårsager vedvarende plegia eller lammelse på den kontralaterale side af kroppen. Vi demonstrerer i denne video en fremgangsmåde til fremstilling iskæmisk slagtilfælde hos ældre rotter, som forårsager vedvarende sensomotoriske handicap og betydelige corticale infarkter. Specifikt vi give varige distale mellem-cerebral arterieokklusion (MCAO) hos ældre hunrotter ved hjælp diatermi pincet til at okkludere et kort segment af denne arterie. Carotidarterien på den ipsilaterale side til læsionen blev derefter permanently okkluderet og den kontralaterale halspulsåre blev transient okkluderet i 60 minutter. Vi måler infarkt størrelse ved hjælp af strukturelle T2-vægtet magnetisk resonans imaging (MRI) ved 24 timer og 8 uger efter slagtilfælde. I denne undersøgelse var den gennemsnitlige infarktvolumen var 4,5% ± 2,0% (standardafvigelse) på den ipsilaterale hemisfære efter 24 timer (korrigeret for hævelse af hjernen under anvendelse Gerriet ligning, n = 5). Denne model er mulig og klinisk relevant, da den tillader induktionen af vedvarende sensomotoriske mén, hvilket er vigtigt for belysning af patofysiologiske mekanismer og nye behandlinger.
Slagtilfælde er for tiden den tredje mest almindelige dødsårsag på verdensplan og den hyppigste årsag til invaliditet 1. Iskæmisk slagtilfælde, der omfatter 80% af alle slagtilfælde, resulterer ofte i infarkter i cortex forårsager tab i sensation (f.eks proprioception), i motorik og i opmærksomhed på den ramte side 2-4. Den midterste cerebrale arterie (MCA) er den største af de fartøjer, der trækker forsyning fra kredsen af Willis og stammer fra den interne halspulsåre 5. MCA er den cerebrale kar mest berørt i iskæmisk slagtilfælde, med slag på dette område tegner sig for 65% af alle iskæmisk slagtilfælde 6,7. MCA leverer både kortikale og subkortikale regioner og neurologiske abnormaliteter forårsaget af MCA slagtilfælde varierer afhængigt af den nøjagtige placering af okklusionen 7. Proksimal MCA okklusioner påvirker den dybe område gennem lenticulostriatal arterier og forårsage store infarkter der omfatter både cortical og subkortikale regioner. I modsætning hertil mere distale okklusioner, der fratager udelukkende kortikale regioner af blodgennemstrømningen tendens til at producere mindre kortikale infarkter.
I store befolkningsundersøgelser, menneskelige slagtilfælde læsioner spænder fra 5-14% af de den ipsilaterale hemisfære 8,9; malign slagtilfælde tegner sig for 10% af slag og giver anledning til større infarkter, der kræver en hemicraniectomy at reducere intrakranielt tryk, og patienter med mindre læsioner er mere tilbøjelige til at overleve 10. Vi demonstrerer en reproducerbar model, der producerer læsioner, der optager en tilsvarende andel af halvkuglen som mange humane slagtilfælde.
Slagtilfælde er en heterogen sygdom; 75% af iskæmisk slagtilfælde er fremkaldt af enten lakunære infarkter (fra obstruktion af intrakranielle små fartøjer); cardioembolic slagtilfælde; eller stor arterie åreforkalkning, som tegner sig for 30% af slagtilfælde. Symptomatisk atherosklerose er hyppigst observeret ved det punkt, hvor den fælles carotid arterie (CCA) filialer i de interne og eksterne halspulsårer 11.
Prækliniske modeller af slagtilfælde skal være så lig den menneskelige tilstand som muligt at simulere sin patofysiologi og bør indarbejde risikofaktorer for slagtilfælde. 92% af iskæmisk slagtilfælde opstår i mennesker over en alder af 65, og andre risikofaktorer omfatter fedme, forhøjet blodtryk, og åreforkalkning, som tidligere diskuteret 12. For bedre at repræsentere disse risikofaktorer, anbefales det at bruge en model, der kan dele nogle af de patofysiologiske funktioner i den naturlige tilstand. I denne protokol, har vi inkluderet fremskreden alder og blokeret blodgennemstrømning gennem carotis arterierne.
Den klassiske model af mellem-cerebral arterieokklusion (MCAO) er den intraluminale filament model af proximal MCA-okklusion, hvilket reducerer blodtilførslen i den forreste og midterste cerebrale arterier. Korte okklusion gange ved hjælp af denne model fokuserer lesion til subkortikale region, hvorimod længere okklusion tider kan resultere i store læsioner rekruttere områder i begge de kortikale og subkortikale områder, hvilket resulterer i en højere dødelighed hos ældre rotter. Til sammenligning indebærer den model, som vores gruppe udfører en kraniotomi og åbning af dura efterfulgt af koagulation af blod og ødelæggelse af en lille del af MCA hjælp bipolære ætsende pincet. Denne diatermi model er tilpasset fra 1981 papir ved Tamura et al. 23 og anvendelse af kraniektomi kan begrænse forhøjet intrakranielt tryk, hvilket er et træk ved den lukkede kraniet, og resulterer i højere reproducerbarhed og en lavere dødelighed i vores kirurgi kohorte i forhold til nogle andre modeller 13. For at generere reproducerbare infarkter og vedvarende handicap vi permanent lukke den proksimale CCA og forbigående okkludere den distale CCA som pr Chen et al. 14 Vi bruger ikke-invasiv T2-vægtet magnetisk resonans imaging (MRI) At vurdere omfanget og placeringen af cerebralt infarkt, og graden af hævelse af hjernen i sensomotoriske cortex.
MCAO i gnavere er en teknik, der ofte anvendes til at modellere humant slagtilfælde. Denne model har et par detaljer at bemærke i protokollen. For det første er det vigtigt at opretholde dyrets kropstemperatur hele forsøget da dette påvirker størrelsen af infarktet og antallet af døde i en undersøgelse. Det kan være muligt at afbryde isofluran under forbigående okklusion af den højre CCA og holde rotter i et opvarmet, roligt miljø at øge overlevelsesprocenten ved at reducere eksponering for isofluran. Forskerne bør overveje, om en kortere anæstesi periode opvejer stress af ekstra induktion. Vaskulaturen (f.eks MCA forgrening) af rotterne varierer i og mellem kohorter af dyr 22. Det er vigtigt at huske dette, når der begynder en ny undersøgelse. Forskellige CCA okklusion gange kan evalueres (fx 30, 45, 60 og 90 min). I denne undersøgelse anvendes en okklusion på cirka 60 minutter. I andre undersøgelser har vi fundet, at 45min okklusioner forårsage en tilsvarende størrelse kortikal infarkt, men med anekdotiske beviser af forbedrede overlevelse. Følgelig har de kirurger begynder med en kort occlusionstid (f.eks, 30 min) for at se, om der opnås tilstrækkelige læsioner volumener (og / eller krævede adfærdsmæssige mangler) og først derefter at øge okklusion gange om nødvendigt. Adfærdsmæssige underskud er ikke opretholdt i voksne rotter sammenlignet med ældre rotter med identiske okklusion gange.
MR kan bruges til at vurdere, om (efter en bestemt okklusion tid) læsion mængder er passende for undersøgelsen mål. En lille læsion ville spænde mindre end ti 0,5 mm koronale skiver (ud af 40). En medium størrelse læsion ville spænde mellem ti og tyve koronale skiver. En stor læsion ville spænde mellem tyve og tredive koronale skiver. En meget stor læsion ville spænde mere end tredive af de fyrre skiver. Det er vores erfaring, rotter med meget store læsioner (mere end tredive skiver) og / eller dokumentation for brok akroers midterlinjen normalt har dårlig prognose: kortere okklusion gange kan overvejes. MR er også nyttigt til vurdering af infarkt placering: nogle er mere kaudalt placeret og nogle er mere rostrally placeret.
Vær ekstra forsigtig, når adskillelse vagusnerven fra både almindelige halspulsårer. Rales (raspende) kan forekomme efter slagtilfælde kirurgi og dette kunne være på grund af nerveskader i nogle dyr, selv om årsagen er endnu uklart: i vores erfaring, prognose er meget dårlig for disse dyr, og det er normalt anbefales til humant dræbe dem.
De permanente diatermi MCAO modelresultater i reproducerbare kortikale infarkter og acceptable postoperative overlevelse hos ældre rotter. Teknikken gør dog kræve invasiv kirurgi under et stereomikroskop. Det er vigtigt at opretholde aseptisk teknik, hvis dyrene skal genoprettes godt fra kirurgi. Der skal udvises forsigtighed for ikke at beskadige MCA mens udsætter og koagulering arterien,og beskadigelse af kortikale overflade bør minimeres ellers blotlagte område af cortex kan udgøre en del af infarktområde. Det anbefales at få så meget erfaring som muligt at etablere proceduren og opnå ensartede infarkter og bestemme okklusion gange før en undersøgelse er udført for at teste kandidat terapier, f.eks. Eksperimentatorer bør randomisere nogen behandlinger indenfor kirurgi sessioner ( "blok randomisering"), hvor det er muligt. Det er værd at bemærke, at denne model ikke omfatter MCA reperfusion (medmindre transient MCA ligering anvendes i stedet for diatermi). Dødeligheden kan være høj i ældre rotter med disse store kortikale infarkter, men det skulle være muligt at nedbringe dødeligheden ved at bruge kortere okklusion gange, og ved at minimere eksponeringen for generel anæstesi hvor det er muligt (fx under okklusion). Anvendelsen af 70% N 2 O og 30% O2 som en bærer kan tillade lavere niveauer af isofluran skal anvendes: denne reducerede eksponering for isoflurane kan resultere i højere overlevelsesrater.
Et andet punkt at overveje, er, at åreforkalkning er en gradvis proces, mens vi i denne protokol simulere det med akut CCA okklusion. Men den betydelige reduktion i blodgennemstrømningen og vedvarende underskud simulere tandem okklusioner, der forekommer i mange patienter med slagtilfælde. Permanent distale MCAO uden tandem CCA okklusion hos rotter formår at fremkalde slagtilfælde reproducerbart 14: øvrigt uden tandem CCA okklusion, har vi fundet betydelig spontan helbredelse indtræffer som udelukker langsigtede adfærdsmæssige evaluering af slagtilfælde terapier over 8 uger. I modsætning hertil viser vi, at distal MCAO med tandem CCA okklusion inducerer langsigtede underskud hos ældre rotter.
Afslutningsvis denne procedure i rotter forårsager streger, der er ens i størrelse og placering til dem, der ses i den menneskelige tilstand, med vedvarende handicap, at man kan bruge til at aktivere afprøvning af nye behandlinger og udredning af remekanismer par efter iskæmisk slagtilfælde.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. I Mhairi Macrae and Dr. Debbie Dewar, University of Glasgow, who kindly hosted CW and DD for training in this procedure. The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM. This work was also supported by a “Serendipity Grant” from The Dunhill Medical Trust to LM [grant number: SA21/0512].
Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Isoflurane | Abbott | B506 | |
Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
Cautery system | Eschmann | ||
0.25 mm Jeweler caurtery forceps | Eschmann | 8330349 | |
fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Thumb driven saline drip system | |||
Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
16 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
Vascular clip and applicator | |||
Operating microscope | Zeiss | ||
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
25g needles | Terumo | NN-2525R | |
syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
gauze | sterilize before use | ||
Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |