Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att producera permanent distala mitten cerebral artärocklusion hos äldre honråttor med samtidig ocklusion av halspulsåder för att generera stora kortikala infarkter och ihållande underskott. Vi visar bekräftelse av skadestorleken med hjälp av strukturell MRI vid 24 timmar och 8 veckor efter stroke.
Abstract
Stroke typiskt förekommer i äldre personer med en rad andra sjukdomar, inklusive halspulsådern (eller annan arteriell) åderförkalkning, högt blodtryck, fetma och diabetes. Följaktligen vid utvärdering av terapier för stroke hos djur, är det viktigt att välja en modell med utmärkt ansikte giltighet. Ischemisk stroke står för 80% av alla slag, och majoriteten av dessa förekommer i det område av den mellersta cerebral artär (MCA), ofta inducera infarkter som påverkar sensorimotor cortex, orsaka ihållande plegia eller förlamning på den kontralaterala sidan av kroppen. Vi visar i denna video en metod för framställning av ischemisk stroke hos äldre råttor, vilket orsakar ihållande sensomotoriska funktionshinder och betydande kortikala infarkter. Specifikt vi framkallar permanent distala mitten cerebral artärocklusion (MCAO) i äldre honråttor med diatermi pincett för att täppa ett kort segment av denna artär. Karotidartären på den ipsilaterala sidan till lesionen var då permanently ockluderas och den kontralaterala halspulsådern transient ockluderades under 60 min. Vi mäter infarktstorleken med hjälp av struktur T2-viktade magnetisk resonanstomografi (MRT) på 24 timmar och 8 veckor efter stroke. I denna studie var den genomsnittliga infarktvolymen var 4,5% ± 2,0% (standardavvikelse) på den ipsilaterala hemisfären vid 24 h (korrigerat för hjärnsvullnad med användning Gerriet ekvation, n = 5). Denna modell är genomförbar och kliniskt relevant eftersom den tillåter induktion av ihållande sensomotoriska svårigheter, vilket är viktigt för att klarlägga patofysiologiska mekanismer och nya behandlingar.
Introduction
Stroke är för närvarande den tredje vanligaste dödsorsaken i världen och den vanligaste orsaken till handikapp en. Ischemisk stroke, som omfattar 80% av alla slag, resulterar ofta i infarkter i cortex orsakar förlust i känsla (t.ex. proprioception), i motorik och uppmärksamhet på den drabbade sidan 2-4. Den mellersta cerebral artär (MCA) är den största av de fartyg som drar leverans från kretsen av Willis och stjälkar från inre halsartären 5. MCA är den cerebrala kärl mest drabbade i ischemisk stroke, med slag i detta område står för 65% av alla ischemisk stroke 6,7. MCA levererar både kortikala och subkortikala regioner och neurologiska avvikelser orsakade av MCA stroke varierar beroende på den exakta platsen för ocklusion 7. Proximal MCA ocklusioner påverkar djupa territorium genom lenticulostriatal artärerna och orsaka stora infarkter omfattar både Cortical och subkortikala regioner. Däremot mer distala ocklusioner som berövar enbart kortikala regioner av blodflödet tenderar att producera mindre kortikala infarkter.
I stora befolkningsstudier, mänskliga stroke skador varierar från 5 till 14% av den ipsilaterala halvklotet 8,9; malignt slag står för 10% av stroke och ger upphov till större infarkter, kräver en hemicraniectomy att minska intrakraniellt tryck, och patienter med mindre skador är mer benägna att överleva 10. Vi visar en reproducerbar modell som producerar lesioner som upptar en lika stor andel av halvklotet så många mänskliga drag.
Stroke är en heterogen sjukdom; 75% av ischemisk stroke induceras av antingen lakunära infarkter (från obstruktion av intrakraniella små kärl); cardioembolic stroke; eller stor artär ateroskleros, som står för 30% av stroke. Symtomatisk ateroskleros är oftast observerade vid den punkt där den gemensamma carotid artär (CCA) förgrenar sig i de interna och externa halspulsåder 11.
Prekliniska modeller av stroke bör vara så lik människans villkor som möjligt för att simulera dess patofysiologi och bör omfatta riskfaktorer för stroke. 92% av ischemisk stroke inträffar hos personer över 65 år, och andra riskfaktorer inkluderar övervikt, högt blodtryck, och åderförkalkning, som tidigare diskuterats 12. För att bättre representera dessa riskfaktorer, är det rekommenderat att använda en modell som kan dela med sig av de patofysiologiska egenskaperna hos det naturliga tillståndet. I detta protokoll, har vi inkluderat hög ålder och hindras blodflödet genom halspulsåder.
Den klassiska modellen för arteria cerebri media ocklusion (MCAO) är det intraluminala filamentmodell av proximal MCA-ocklusion, vilket minskar blodflödet i den främre och mellersta cerebrala artärer. Korta ocklusion gånger med denna modell fokuserar lesion till subkortikal region, medan längre ocklusion gånger kan resultera i stora skador rekrytera områden av såväl de kortikala och subkortikala områden, vilket resulterar i en högre dödlighet hos äldre råttor. I jämförelse, innefattar den modell som används av vår grupp att utföra en kraniotomi och öppning av dura följt av koagulering av blodet och förstörelse av en liten del av MCA med hjälp av bipolära etsande pincett. Denna diatermi modell är anpassad från 1981 uppsats av Tamura et al. 23 och användningen av den craniectomy kan begränsa förhöjt intrakraniellt tryck, vilket är en funktion av den slutna skalle, och resulterar i högre reproducerbarhet och en lägre dödlighet i vår kirurgi kohort jämfört med vissa andra modeller 13. För att generera reproducerbara infarkter och ihållande funktionsnedsättning vi permanent täppa proximala CCA och tillfälligt täppa distala CCA enligt Chen et al. 14 Vi använder icke-invasiv T2-viktade magnetisk resonanstomografi (MRT) För att utvärdera omfattningen och lokaliseringen av hjärninfarkt, och graden av hjärnan svullnad i sensomotoriska cortex.
Protocol
Detta protokoll godkändes av institutionella riktlinjer som Kings College London, och genomfördes i enlighet med det brittiska inrikesministeriet riktlinjer och djur (Scientific Procedures) Act från 1986. Riktlinjerna kan variera mellan institutionerna; se till att ansluta sig till institutionella riktlinjer innan denna procedur. För att bibehålla aseptisk teknik vid beröring utrustning, autoklav en stor bit av aluminiumfolie och använda detta för att linda runt utrustning hanterar till exempel på mikroskopet och anestesiapparaten. Sterila plastfolie (plastfolie) kan också användas.
1. Beredning
- Bekanta råttor med gel vätskeförpackningar (veterinär återhämtning gel) och mjuka chow minst 48 timmar före stroke kirurgi. Som djur har ofta svårigheter med att äta och dricka efter ingreppet, införa djur till dessa poster före operationen, för att minimera neofobi. Hus äldre råttor med trä tugg blocks för att minska förekomsten av övervuxna tänder (se avsnitt 6).
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg innan kirurgiska ingrepp genom autoklavering (minst 121 ° C, 15 psi, under 15 min). Desinficera alla arbetsytor med hjälp av 1% klorhexidin i 70% etanol och använda operationsdukar och bibehålla aseptisk teknik under hela förfarandet.
- Framkalla skador på halvsfären kontra den föredragna tassen. Fördela skador till antingen vänster eller högra hjärnhalvan beroende på varje råtta föredrar framtassarna, bestäms av de preoperativa baslinjer i Montoya trappa testet 15 (se figur 4). För enkelhets skull, när man beskriver denna procedur i detta manuskript, är den vänstra tassen den föredragna tassen, och operationer utförs på den högra hjärnhalvan. Använd Lister Hooded eller Long Evans-råttor för dessa beteendetester som de lär sig snabbt.
Obs: Trappan Testet är utformat för att mäta förändringar i både fin- och grov skicklig movements efter motorsystem skador. Trappan består av sju steg på vardera sidan av en central plattform. Om utrustning för trappan testet är tillgänglig, är cylindertestet ett lämpligt alternativ för att testa handedness, men observera att det är bara en övergående underskott på detta test i denna modell av stroke, och kommer därför att vara olämpligt att mäta långsiktig återhämtning efter behandling.- Placera tre socker pellets i brunnen för varje steg (21 pellets per sida). Placera råttorna i trappan apparat för 10 min och registrera antalet pelletar som hämtas och antalet pelletar förskjutna på varje sida.
OBS: För att ingå i uppgiften postoperativt måste råttor hämta minst 75% pellets vid baslinjen.
- Placera tre socker pellets i brunnen för varje steg (21 pellets per sida). Placera råttorna i trappan apparat för 10 min och registrera antalet pelletar som hämtas och antalet pelletar förskjutna på varje sida.
2. kirurgi
- Använd kvinnliga äldre Lister-Hooded råttor vid 16-18 månader (250-400 g) och inducera anestesi med 5% isofluran i 1,5 L / min O 2. Efter induktion av anestesi, minskanivån av isofluran och bibehålla den vid en tillräcklig men minimerad djup för kirurgi (t.ex. 1,5-2%). Leverera anestesi till djuret av en ansiktsmask, och använda ett spolningssystem för att begränsa kirurgens exponering för isofluran.
- Utför alla förfaranden upp till, men inte inklusive kraniotomi på simulerade djur, eftersom detta förfarande kan producera beteendestörningar 16. Överväga experimentella mål vid utformningen MCAO experiment, och besluta om en sken grupp att kontrollera för kraniotomi eller inte bör ingå.
- Administrera smärtlindring före eller den peri- operativt (Carprieve, 0,25 mg / kg, s. Skära).
- Tillsätt 1 ml till 19 ml steril 0,9% saltlösning för att göra förrådslösningen och injicera 0,6 ml per 300 g råtta. Användningen av Carprieve föredras framför Karprofen eftersom de förra är stabil vid RT.
- Raka pälsen på ventrala halsregionen och tinningen på den högra hjärnhalvan att exponera huden. Desinficera kirurgiska platser usjunga etanol kompresser. Var noga med att följa lokala IACUC riktlinjer för hårborttagning.
- Utföra detta steg bort från operationsområdet för att minimera mängden av päls på snittstället.
- Placera råttan på en anslagstavlan täckt med en steril duk i ryggläge på en värmedyna. Applicera lidokain kräm till de rakade områden i huvud och hals. Infoga en rektal sond för att övervaka och underhålla djurets temperatur mellan 36,5-37,5 ° C med en homeothermic systemet.
- Sätt lacrilube salva på ögonen för att förhindra uttorkning. Ge råtta en injektion av atropin sulfatlösning (0,05 ml av en 600 mikrogram / ml lösning, subkutant) för att minska luftstrupen sekret.
Obs: Forskare bör överväga att mäta fysiologiska variabler såsom blodgaser och tryck.
- Sätt lacrilube salva på ögonen för att förhindra uttorkning. Ge råtta en injektion av atropin sulfatlösning (0,05 ml av en 600 mikrogram / ml lösning, subkutant) för att minska luftstrupen sekret.
- Innan operation, kontrollera baktassen nypa tillbakadragande och blinka reflexer för att bekräfta fullständig anestesi.
- Enligt en dissekera mikroomfattning, göra en 2 cm central mittlinje snitt på den exponerade halsen med hjälp av en skalpell. Flytta spottkörtlarna försiktigt laterala till luftstrupen på båda sidor.
- Loop icke absorber silkesutur runt huden som ligger över den gemensamma halsartären på ena sidan. Dra försiktigt bort huden från platsen med hjälp av silke sutur och hålla ner dessa till anslagstavlan med hjälp av kirurgtejp för att avslöja den gemensamma halspulsådern. Noggrant trubbigt dissekera artärerna fria från omgivande fascia och vagala nerver med fin pincett.
- Var noga med att inte skada muskel eller Vagusnerv under detta steg, eftersom detta kommer att försämra utfodring, svälja och andas.
- När den gemensamma halspulsådern exponeras, använda icke-absorberbara siden sutur (5/0) för att isolera halspulsådern, först separera halspulsådern från vagusnerven genom omvänd dissekera med fin pincett och försiktigt så att inte komma i kontakt med nerven. När fartyget har en slinga (men inte bunden) med suturen, tapa ändarna av suturen tillsammans med användning av kirurgtejp för att förhindra att detta steg att vara ogjord. Ta bort suturer håller tillbaka den överliggande huden.
- Upprepa för den andra sidan (avsnitt 2,7-2,8)
- Placera en steril koksaltlösning-indränkt gasbinda i såret för att hålla vävnader fuktiga under återstoden av det kirurgiska ingreppet. Löst sutur huden och placera ytterligare saltlösning indränkt gasbinda över området för att förhindra ytterligare uttorkning.
- Placera råttorna i en lateral position och gör ett snitt i huden vid mittpunkten mellan den högra bana och den yttre hörselgången. Dra in huden med upp till fem elastiska 3 mm krok upprullningsdon fästs till anslagstavlan och sedan trubbigt dissekera temporalis muskler för att avslöja skallen.
- Placera en tumhjul justerad gravitationsdriven saltlösning droppa över den öppna platsen (flödeshastighet ca 2 ml / min) och inrätta ett sug för att avlägsna ben skräp och rensa mindre blödning från den exponerade platsen under denna fas av operationen ( Sektjoner 2.13-2.16).
- Placera koksalt utmatningsmunstycket vid den högsta punkten av skallen nära örat, och aspirator munstycke vid den lägsta punkten. Justera ratten under blödningar att leverera mer saltlösning till området för att bättre visualisera källan till någon avtappnings för kauterisation av kärlet, vilket minskar den tid som djuren under anestesi.
Figur 1. Kirurgisk uppsättning av den permanenta distala mitten cerebral artärocklusion modell. Den utrustning som används i uppsättningen för råttan kraniotomi visas för den högra hjärnhalvan, och inlägg, placeringen av sug och salt droppa runt craniectomy platsen. visas är också viktiga inslag i kärlsystemet; den mellersta hjärnartären (röd) och sämre cerebral ven (blå) visas, och det skuggade området visar var koagulering av artären sker.Bekräftelse av ocklusion utförs genom att skära MCA under sämre cerebral ven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Gör en kraniotomi på det exponerade området (cirka 5 mm x 5 mm) med hjälp av en tandläkarborr med en grov 1,6 mm diamantbelagda borr burr vid ungefär 8000 rpm, säkerställa tillämpningen av cirkulär och sidotrycket och inte tryck nedåt samtidigt borra det exponerade området . När benet är tunn nog att det ser helt transparent, bort med pincett.
- Använd en hemmagjord dural krok, genom att böja en spets fin pincett ungefär 180 ° för att bilda en båge, för att öppna försiktigt dura, vara försiktig för att undvika kärlen stora yta blod, eftersom de är känsliga och lätt att brista.
Obs: Den exponerade område i hjärnan kommer att avslöja arteria cerebri media (MCA); det önskade segmentetmäter ungefär 2 mm i längd (se figur 1, inlägg). - Koagulera MCA varifrån sämre cerebral ven korsar, till den grad att artären bifurkationen och sedan längs kaudala grenar av MCA med hjälp av ett par diatermi pincett tills den är helt tilltäppt 17. Använd vinklade juvelerare diatermi pincett med 0,25 mm spetsiga tips.
- När ockluderar artären, förändra saltlösning strömma efter behov för att hålla detta område sval, vilket hindrar den koagulerande pincett från att vidhäfta till blodkärlet. När ockluderad, verkar blodkärlet svart och inga tecken på blodflödet bör vara närvarande; blodflöde kan ses i delvis tilltäppta kärl.
- Skär MCA vid denna tidpunkt för att bekräfta fullständig ocklusion. Använda mikrovaskulära sax, klippa under där sämre cerebral ven korsar MCA.
- Täck det utsatta området med en saltlösning indränkt kompress innan du fortsätter till nästa steg.
- Vrid råtta tillbaka till rygg position och öppna löst bundna sutur på halsen för att återexponera halspulsåder. Ligera karotidartären på samma sida som den ockluderade MCA (höger) som är permanent genom att knyta en knut i silkesutur runt halspulsådern, medan den vänstra karotisartären ockluderas transient med användning av en 13 mm rostfritt stål artärklämma med 125 g tryck under 60 min. Löst sutur upp snittet i halsen under denna tid och placera en steril saltlösning indränkt gasbinda på toppen för att förhindra uttorkning.
- Notera att djurets högra sidan kommer att vara på kirurgens vänstra sidan, med tanke på den liggande positionering.
- För sken djur, öppna ventrala delen av halsen och temporala regioner och separera musklerna för att lokalisera de gemensamma halspulsåder, men inte täppa. Har simulerade djur genomgå förfaranden upp till men inte inräknat kraniotomi, eftersom detta förfarande kan producera beteendestörningar 16. För att bibehålla bländande andra tEAM medlemmar (t.ex. under senare beteendetestning), utföra snitt och suturering.
Figur 2. Tandem karotidocklusion följande arteria cerebri media ocklusion. Den högra gemensamma halsartären (CCA) är permanent ockluderas genom att knyta en silkessutur (5/0) runt blodkärlet (på den vänstra sidan av bilden). Den vänstra CCA (på höger sida) ockluderas under 1 timme med användning av en mikrovaskulär klämma. Dessa operationer utfördes noga med att inte komma i kontakt med vagusnerven på varje sida (vit). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Sutur snittet i tinningsområdet under en timme av vänstra gemensamma karotid ocklusion.
- Ge råttor 20 ml koksaltlösning subkutant (5 ml till två platser på varje flank) för att upprätthålla hydrering (se6,2).
- När 60 minuter har gått bort klippet. Applicera saltlösning lokalt på omgivande muskler och stänga snittet i halsen med hjälp av subkutan kontinuerlig sömnad av absorberbara suturer (4/0).
3. Postoperativ vård
- Placera råttan i en 31 ° C inkubator för att återhämta sig från anestesi under upp till 4 h.
Obs: Forskare kanske föredrar att använda andra temperaturer och varaktig enligt lokal praxis. - Upprepa carprieve (0,25 mg / kg), för smärtlindring vid 24 h. Eftersom alla djur erhåller samma dos av Carprieve, är denna faktor kontrolleras för att systematiskt. Alla nervskyddande effekt av Carprieve kommer sannolikt att vara försumbara.
- Ge saltlösning injektioner dagligen för att förhindra uttorkning under åtminstone de tre första dagarna. Om man antar att en råtta kräver 65 ml vätska per kg kroppsvikt (varje 24 timmar), se till att varje 300 g råtta får ~ 22 ml vätska per dag.
4. Contelse av Infarkt
- För att mäta infarktvolymen använda strukturell MRI.
Obs: En alternativ metod skulle kunna vara att använda histologisk färgning, såsom tetrazoliumklorid (TTC), som tidigare har korrelerad till strukturella MRI data 18. Detta kan dock endast användas vid slutpunkten av studien, och inte i längdriktningen.- Tjugofyra timmar efter induktion av MCAO, söva råttorna med isofluran (5% för inducering, 1-1,5% för underhåll) i 0,9 L / min medicinsk luft och ett L / min O 2, trygg i en kvadratur fågelbur magnetisk resonanspolen (43 mm diameter) och placera i en 7 Tesla horisontell borrning scanner.
- Skaffa T2 viktade skanningar med hjälp av en snabb-spin eko sekvens: ekotiden (TE) 60 ms, repetitionstid (TR) 4000 ms, synfält (FOV) 40 x 40 mm, förvärv matris 128 x 128, förvärvar 40 x 0,5 mm tjocka skivor i ca 8 min. Därefter konvertera 40 skivor i 20 x 1 mm tjocka skivor med hjälp av resamplningsfunktion i medicinsk bildbehandling programvara.
- Erhålla lesion volymer i en medicinsk bildvisnings paketet genom att mäta den tvärsektionsarea av infarkt i 20 volymer. Erhålla den totala volymen genom att multiplicera summan av dessa områden av tjockleken (1 mm). Beräkna gruppens medelvärde volym och standardavvikelse. För procent skada volymberäkningar, även förvärva volymerna av de ipsilesional och contralesional halvklotet.
- För att korrigera för hjärnan svullnad på grund av ödem, justera dessa värden med hjälp av GERRIETS 'formler 18. Omfattar endast skivor som innehåller cortex och inte innehåller lillhjärnan eller lukt glödlampor enligt en standard råtta atlas 19 för att undvika överkorrigering, eftersom detta kan generera negativa skadevolymer.
- Förvärva T2 viktade bilder igen 8 veckor efter stroke operation.
5. Urvalsstorleken Beräkningar för Framtidsstudier Bedömning neuroprotektion och Behavioral Recovery </ P>
- Utför prov storlek beräkningar för att uppskatta den minsta stickprovsstorlek som skulle krävas i framtiden hypotetiska neuroprotektiva experiment med användning av två grupper (kontroll vs. Behandling) för att identifiera behandlingseffekter av tre olika storheter (25% minskning, 50% minskning, 75% minskning) med hjälp av a priori algoritmer implementeras i maktanalys programvara 20.
OBS: För att göra det möjligt för läsaren att göra liknande beräkningar med sina egna uppgifter, finns skärmdumpar från fritt tillgängliga maktanalys programvara (se Representativa resultat). Använd följande parametrar: acceptabel falsk positiv hastighet (dvs typ I fel tröskel, α) ≤0.05 och kraft (vilket motsvarar en-β) ≥0.80 (dvs mer än 80% effekt). Se nedan för förklaring och en diskussion 21.
6. Äldre Animal Welfare efter stroke Kirurgi
- Tillhandahålla ytterligare mjuk chow ennd rehydrering gel förpackningar att råttorna vana vid före operation, förutom vattenflaskor med utökade tips för enklare att nå. Dessutom har en absorber återhämtning dyna i burar i stället för lös sängkläder (dvs undvika flis) för de första 24 h, och ger extra häckande sängar. Använd inte pureed mat (t.ex. barnmat) som råttor med dysfagi kan kvävas.
- Väg djur dagligen under 7 dagar för att övervaka återhämtningen. Viktminskning är en primär indikation på uttorkning och stress. Viktminskning under de första dagarna efter operationen speglar huvudsakligen uttorkning (snarare än viktminskning på grund av minskad matning).
- Där en åldrande råtta visar viktminskning utan samband med kirurgi, ersätta förlorad kroppsvikt med en ekvivalentvikt av fluider och inspektera de övre och nedre tänder. Där tänder är övervuxna, söva råttan med isofluran (som i avsnitt 2.1), och plats i ryggläge
- Placera en 1 ml sprutcylinder bakom teeth att skydda de mjuka vävnaderna. Skär med hjälp av en handhållen cirkelsåg (t.ex. ca 3 cm i diameter) med hög rotationshastighet, men med långsamma, fast handrörelser (t.ex. 3 sek nedskärningar). Tillåt råttans tänder för att kyla ner mellan skärningar. Se till att den roterande sågen är monterad på dornen så att sågens tänder vända i rotationsriktningen. Det är värt att hålla individuellt förpackade, steriliserade roterande sågar redo för sådana eventualiteter.
Obs: överväxt kan uppstå hos äldre råttor även när underhållas på en hård pellet kost. Vi rekommenderar att tänderna kontrolleras hos äldre råttor regelbundet.
- Placera en 1 ml sprutcylinder bakom teeth att skydda de mjuka vävnaderna. Skär med hjälp av en handhållen cirkelsåg (t.ex. ca 3 cm i diameter) med hög rotationshastighet, men med långsamma, fast handrörelser (t.ex. 3 sek nedskärningar). Tillåt råttans tänder för att kyla ner mellan skärningar. Se till att den roterande sågen är monterad på dornen så att sågens tänder vända i rotationsriktningen. Det är värt att hålla individuellt förpackade, steriliserade roterande sågar redo för sådana eventualiteter.
- Om en äldre råtta visar viktminskning och piloerektion samband med kirurgi, diskutera behandlingsalternativ med en veterinär. Överväga humant döda djuret. MRT av sådana djur kan visa en tumör i hypofysen (ofta hos äldre honråttor) som är oanvändbara och dödlig.
Representative Results
Permanent kortex inducerades genom att utföra kraniotomi, följt av koagulering och förstörelse av den mellersta hjärnartären genom diatermi kombineras med permanent ocklusion av ipsilesional gemensamma halspulsådern och 60 min ocklusion av contralesional gemensamma halsartären. En schematisk bild av installationen av utrustningen och tilltäppt MCA visas i figur 1, och av halspulsåder i figur 2 (ovan).
Stroke resultatet bedömdes 24 h och 8 veckor efter stroke genom att mäta infarktvolymen på 40 x 0,5 mm skivor (från rostralt slutet av luktbulben till rostralt slutet av ryggmärgen) med intresseområdet verktygslåda i en medicinsk bildvisnings paket. Ett representativt T2 viktade strukturella MR-undersökning visas för samma djur vid 24 timmar och 8 veckor (Figur 3A). Den infarktvolymen identifierades genom de områden i råtthjärna som visar en hypersignal; som T2 vikted bilder visar vatten eller plasma som en ljus vita området. Det är känt att det finns en ökning av ödem och hjärnsvullnad efter stroke, och detta kan mätas från en T2-viktade scan som har satts i samband med histologiska mätningar av infarktvolymen 18. Men ödem närvarande tidigt efter stroke (t.ex. vid 24 h) kan leda till en överskattning av den slutliga skadan volym (t.ex. vid 8 veckor) och därför kan vi också föremedelinfarkt volymer justeras med Gerriet formler. Figur 3B visar genomsnittliga data från rå (ojusterade) lesion volym vid 24 timmar som 62,8 mm 3 (± 25,4 mm 3 SD, övre diagrammet); detta upptar 9,8% av de drabbade hemisfären (± 4,2% SD, mellersta diagrammet). När korrigerat för hjärnsvullnad använder GERRIETS 'formler detta värde minskas till 4,5% (± 2,0% SD, nedre grafen).
Stroke svårighetsgrad mättes också med hjälp av Montoya trapptestet 15. I korthet, ennimals var pre-utbildade för att hämta socker pellets under 4 veckor före kortex stroke kirurgi, och testas för 8 veckor efter stroke (Figur 4) för att bekräfta en varaktig underskott. Råttor placerades i trapphuset apparat för 10 min och antalet pellets hämtas registrerades (av 21 pellets) och visas som en procentandel (grupp betyder ± standardfel). En regressionsanalys utfördes för att passa linjen till data.
Figur 5 visar beräkningen av provstorleken med hjälp av infarktvolymdata (för potentiella effekter av terapikandidater), analyseras med hjälp av en algoritm i maktanalys programvara för en t-test med hjälp av "Skillnad mellan två oberoende organ (två grupper)" och med hjälp av (okorrigerade ) medelvärden och standardavvikelser från figur 3B. Informationen i figur 5 och tabell 1 visar att 12 råttor skulle krävas per grupp för att detektera en terapi som reducerad infARCT volymen med 50% på 24 timmar, medan figur 6 visar en "XY plot" av makt uppnås med hjälp av varierande antal djur. Tabell 1 sammanfattar provstorlek beräkningar för alla tidpunkter.
Figur 3. T2-viktade strukturella MRI används för att mäta storleken på infarkten och hjärnan svullnad efter stroke. (A) En T2-viktade magnetresonansbild av samma råtthjärna 24 timmar och 8 veckor efter induktion av stroke. Det vita området representerar skadan, men innehåller också några vasogent ödem som löser av 8 veckor. (B) infarktvolymer mättes med användning av en medicinsk bild skyltförpackning intresseområdet Toolkit, och är plottade på en graf som representerar medelvärdet ± SD för de 3 tidpunkter som används (n = 6). Raw skada volym (ej korrigerad för hjärnan svullnad på grund av edEMA), är procent skada av påverkade hemisfären (okorrigerat för svullnad), och procentuell skada i halvklotet korrigerat för hjärnsvullnad använder GERRIETS 'formler som visas här. SD användes i stället för SEM för att utföra provstorlek beräkningar (se figur 5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Trappan Testet visar försämringar i greppa och hämta pellets. I detta slag modell det fanns mycket lite spontan återhämtning. Stroke hos äldre råttor försämrar envist skicklighet, visad genom att testa varje vecka med "trappa test" av pellet gående. Infällt: En bild av en råtta som utför beteendetest. Diagrammet visar medelvärdet (± standard fel) Antalet pellets hämtas (av 21, uttryckt i procent) per vecka av den drabbade tassarna. n = 5. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Urvalsstorlek beräkningar för att bestämma gruppnummer av råttor som krävs för att detektera en önskad terapeutisk effekt. Denna skärm skott, tas från effektanalysmjukvara, visar att 12 råttor per grupp skulle krävas för att detektera en terapi som reducerad infarktvolymen med 50% vid 24 h. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Effekt uppnås med hjälp av olika totala antalet djur. En "XY plot för ett intervall av värden" från maktanalys programvara visar den kraft som skulle erhållas för experiment med olika (totalt) antalet äldre råttor, med tanke på de parametrar visas i figur 5. Tabell 1 sammanfattar alla våra resultat. klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tid efter stroke: | Antal råttor per grupp krävs för att detektera en minskning i lesions-volymen av: | ||
| 75% | 50% | 25% | |
| 24 tim | 6 | 12 | 42 |
| 8 veckor | 4 | 5 | 17 |
Tabell 1. Beräkningar av urvalsstorlekar per grupp för hypotetiska framtida experiment. Beräknat med maktanalys programvara (se fig 5 och 6). Tabellen visar antalet råttor per grupp som krävs för en två-grupp experiment för att detektera en 25%, 50% och 75% minskning i lesions-volym vid var och en av tidpunkterna i denna studie.
Discussion
MCAO hos gnagare är en teknik som ofta används för att modellera mänskliga stroke. Denna modell har ett par detaljer att notera i protokollet. För det första är det viktigt att upprätthålla djurets kroppstemperatur genom hela experimentet, eftersom detta påverkar storleken på infarkten och antalet döda i en studie. Det kan vara möjligt att avbryta isofluran under den transienta tilltäppning av rätt CCA och hålla råttor i en uppvärmd, lugn miljö för att öka överlevnaden genom att minska exponeringen för isofluran. Forskare bör överväga om en kortare anestesi period uppväger stressen ytterligare induktion. Kärl (t.ex. MCA förgrening) av råttorna varierar inom och mellan grupper av djur 22. Det är viktigt att ha detta i åtanke när du börjar en ny studie. Olika CCA ocklusion gånger kan utvärderas (t.ex. 30, 45, 60 och 90 min). I denna studie en ocklusion av 60 min används. I andra studier har vi funnit att 45min ocklusioner orsaka en liknande storlek kortikala infarkt men med anekdotiska bevis för förbättrad överlevnad. Följaktligen har kirurger börjar med en kort ocklusion tid (t.ex. 30 min) för att se om tillräckliga lesion volymer (och / eller nödvändiga beteendestörningar) erhålls och först därefter öka ocklusion gånger vid behov. Beteende underskott inte upprätthållas i vuxna råttor jämfört med äldre råttor med identiska ocklusion gånger.
MRT kan användas för att bedöma om (efter en viss ocklusion tid) lesion volymer är lämpliga för studie mål. En liten skada skulle sträcka sig mindre än tio 0,5 mm koronala skivor (av 40). Ett medium lesion storlek skulle sträcka sig mellan tio och tjugo coronal skivor. En stor skada skulle sträcka sig mellan tjugo och trettio coronal skivor. En mycket stor skada skulle sträcka sig över mer än trettio av de fyrtio skivor. I vår erfarenhet, råttor med mycket stora skador (mer än trettio skivor) och / eller tecken på diskbråck Across mittlinjen har oftast dålig prognos: kortare ocklusion tider kan övervägas. MRT är också användbar för att bedöma infarkt plats: vissa är mer kaudalt beläget och vissa är mer rostrally belägna.
Var extra försiktig när separera vagusnerven från både vanliga halspulsåder. Rassel (rasping) kan förekomma efter stroke operation och detta kan bero på nervskador hos vissa djur, även om orsaken är för närvarande oklart: i vår erfarenhet, är mycket dålig för dessa djur prognos och det är oftast rekommenderas att humant döda dem.
De permanenta diatermi kortex modellresultat i reproducerbara kortikala infarkter och godtagbara postoperativa överlevnad hos äldre råttor. Tekniken har dock kräva invasiv kirurgi under ett stereomikroskop. Det är viktigt att bibehålla aseptisk teknik om djuren att återhämta sig väl från kirurgi. Man måste vara försiktig att inte skada MCA men utsatte och koagulerar artären,och skada på kortikala ytan bör minimeras annars det exponerade området av hjärnbarken kan utgöra en del av infarktområdet. Det rekommenderas att få så mycket erfarenhet som möjligt för att fastställa förfarandet och för att uppnå konsekventa infarkter och bestämma ocklusion gånger innan en studie utförs för att testa terapikandidater, till exempel. Praktiker bör slumpmässigt alla behandlingar inom kirurgi sessioner ( "block randomisering") där så är möjligt. Det är värt att notera att denna modell inte innebär MCA reperfusion (om inte övergående MCA ligation används istället för diatermi). Dödligheten kan vara hög i äldre råttor med dessa stora kortikala infarkter men det bör vara möjligt att minska dödligheten genom att använda kortare ocklusion gånger och genom att minimera exponeringen för narkos där så är möjligt (t.ex. under ocklusion). Användning av 70% N 2 O och 30% O 2 som en bärare kan tillåta lägre nivåer av isofluran som skall användas: denna reducerade exponering för isoflurane kan resultera i högre överlevnad.
En annan sak att tänka på är att åderförkalkning är en gradvis process, medan i detta protokoll vi simulera det med akut CCA ocklusion. Men den kraftiga minskningen av blodflödet och ihållande underskott simulera tandem ocklusioner som förekommer i många strokepatienter. Permanent distala MCAO utan tandem CCA ocklusion hos råttor misslyckas att inducera stroke reproducerbart 14: dessutom utan tandem CCA ocklusion, har vi funnit betydande spontan återhämtning inträffar som utgör hinder för en långsiktig beteende utvärdering av stroke terapier under 8 veckor. Däremot visar vi att distal kortex med tandem CCA ocklusion inducerar långvariga underskott hos äldre råttor.
Sammanfattningsvis, detta förfarande hos råttor orsakar linjer som har liknande storlek och läge för de som ses i människans villkor, med bibehållen funktionshinder som man kan använda för att möjliggöra testning av nya behandlingar och klarläggande av repar mekanismer efter ischemisk stroke.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
| Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
| Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
| Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Isoflurane | Abbott | B506 | |
| Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Cautery system | Eschmann | ||
| 0.25 mm Jeweler cautery forceps | Eschmann | 8330349 | |
| fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Thumb driven saline drip system | |||
| Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
| 1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
| Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
| Vascular clip and applicator | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
| Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
| 25 g needles | Terumo | NN-2525R | |
| syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
| gauze | sterilize before use | ||
| Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
| Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
| Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |
References
- Pendlebury, S. T., et al. Underfunding of stroke research: a Europe-wide problem. Stroke. 35, 2368-2371 (2004).
- Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke. Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331 (2010).
- Reep, R. L., et al. A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect. Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).
- Carey, L. M., et al. Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions. Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).
- Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management. Mohr, J. P., et al. , Elsevier. 384-424 (2011).
- Sacco, R. L., et al. Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study. Neurology. 34, 847-847 (1984).
- Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 1-27 (2009).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. N Engl J Med. 333, 1581-1587 (1995).
- Brott, T., et al. Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
- Lövblad, K. O., et al. Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome. Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).
- Norrving, B. Ch. 2. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 28-39 (2009).
- Truelsen, T., et al. Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data. Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).
- Ord, E. N., et al. Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats. J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).
- Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate? Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).
- Macrae, I. M. Ch. 5. Rodent Models of Stroke, Neuromethods. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).
- Gerriets, T., et al. Noninvasive Quantification of Brain Edema and the Space-Occupying Effect in Rat Stroke Models Using Magnetic Resonance Imaging. Stroke. 35, 566-571 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).
- Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses. Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).
- Button, K. S., et al. Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).
- Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat. Stroke. 24, 2087-2093 (1993).
- Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
