هنا نقدم بروتوكول لإنتاج دائم البعيدة انسداد الشريان الدماغي الأوسط في إناث الفئران المسنة مع انسداد في وقت واحد من الشرايين السباتية لتوليد عوائق القشرية الكبيرة والعجز المستمر. وتبين لنا تأكيدا لحجم الآفة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي الهيكلي في 24 ساعة و 8 أسابيع بعد السكتة الدماغية.
السكتة الدماغية يحدث عادة في كبار السن مع مجموعة من التواكب المرضي بما في ذلك الشريان السباتي (أو الشرايين الأخرى) تصلب الشرايين، وارتفاع ضغط الدم والبدانة ومرض السكري. وفقا لذلك، عند تقييم علاجات للسكتة الدماغية في الحيوانات، من المهم تحديد نموذج مع وجه ممتازة الصلاحية. حسابات السكتة الدماغية عن 80٪ من كل السكتات الدماغية، وغالبية هذه تحدث في أراضي الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر)، وكثيرا ما حمل عوائق التي تؤثر على القشرة الحسية، مما تسبب في plegia المستمر أو شلل جزئي في الجانب المقابل من الجسم. علينا أن نظهر في هذا الفيديو طريقة لإنتاج السكتة الدماغية لدى الفئران المسنة، والذي يسبب مستمرة الإعاقة الحسية وعوائق القشرية كبيرة. على وجه التحديد، ونحن تحفز دائم البعيدة انسداد المتوسطة الدماغية الشريان (MCAO) في إناث الفئران المسنة باستخدام ملقط الإنفاذ الحراري لتسد قطعة صغيرة من هذا الشريان. كان الشريان السباتي على الجانب المماثل لآفة ثم pالمغطي ermanently والشريان السباتي المقابل المغطي عابر لمدة 60 دقيقة. نقيس حجم احتشاء باستخدام الهيكلي التصوير بالرنين المغناطيسي T2 المرجحة (MRI) في 24 ساعة و 8 أسابيع بعد السكتة الدماغية. في هذه الدراسة، كان حجم احتشاء متوسط 4.5٪ ± 2.0٪ (الانحراف المعياري) في نصف الكرة المماثل في 24 ساعة (تصحيح لتورم في الدماغ باستخدام معادلة Gerriet ون = 5). هذا النموذج هو ممكن عمليا وذات الصلة سريريا لأنه يتيح تحريض العجز الحسي مستدامة، وهو أمر مهم لتوضيح الآليات المرضية في جسم المريض والعلاجات الجديدة.
السكتة الدماغية هي حاليا ثالث السبب الأكثر شيوعا للوفاة في العالم والسبب الرئيسي للعجز 1. السكتة الدماغية، التي تضم 80٪ من مجمل السكتات الدماغية، وغالبا ما يؤدي إلى عوائق في القشرة تسبب فقدان في الإحساس (على سبيل المثال، استقبال الحس العميق)، في وظيفة الحركة والانتباه إلى الجانب المصاب 2-4. الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر) هو أكبر من السفن التي توجه العرض من دائرة ويليس وينبع من الشريان السباتي الداخلي 5. قانون اللجان العسكرية هي السفينة الدماغية المتضررة الأكثر شيوعا في السكتة الدماغية، والسكتات الدماغية في هذه المنطقة يمثل 65٪ من السكتات الدماغية 6،7. لمولودية الجزائر تمد كلتا المنطقتين القشرية وتحت القشرية والتشوهات العصبية الناجمة عن السكتة الدماغية MCA تختلف حسب المكان المحدد من انسداد 7. انسداد القريبة MCA تؤثر على أراضي عميقة من خلال الشرايين lenticulostriatal وتسبب عوائق كبيرة تشمل كلا كورتيكال والمناطق تحت القشرية. في المقابل، انسداد أكثر البعيدة التي تحرم المناطق القشرية فقط من تدفق الدم تميل إلى إنتاج عوائق القشرية الصغيرة.
في الدراسات السكانية الكبيرة، وتتراوح الآفات السكتة الدماغية الإنسان 5-14٪ من نصف الكرة المماثل 8،9. حسابات السكتة الدماغية الخبيثة لمدة 10٪ من السكتات الدماغية ويثير عوائق أكبر، الأمر الذي يتطلب استئصال شق القحف لتخفيف الضغط داخل الجمجمة، والمرضى الذين يعانون من آفات أصغر هم أكثر عرضة للبقاء على قيد الحياة 10. علينا أن نظهر نموذجا استنساخه التي تنتج الآفات التي تحتل نسبة مماثلة من نصف الكرة الأرضية إلى العديد من السكتات الدماغية الإنسان.
السكتة الدماغية هي مرض غير متجانسة. وبفعل 75٪ من السكتات الدماغية الإقفارية من قبل أي عوائق الجوبي (من انسداد الأوعية الصغيرة داخل الجمجمة)؛ السكتة الدماغية cardioembolic. أو تصلب الشرايين الشريان كبير، وهو ما يمثل 30٪ من السكتات الدماغية. في معظم الأحيان لوحظ تصلب الشرايين أعراض عند نقطة حيث ج المشتركةالشريان arotid (CCA) فروع في الشرايين السباتية الداخلية والخارجية 11.
وينبغي أن تكون نماذج ما قبل السريرية من السكتة الدماغية مماثلة لحالة الإنسان ممكن لمحاكاة الفيزيولوجيا المرضية وينبغي أن تتضمن عوامل خطر الاصابة بالجلطة الدماغية. 92٪ من السكتة الدماغية تحدث في الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 65 عاما، وتشمل عوامل الخطر الأخرى السمنة، وارتفاع ضغط الدم، وتصلب الشرايين، كما نوقش سابقا 12. لتمثيل أفضل عوامل الخطر هذه، فمن المستحسن استخدام نموذج التي قد تشارك بعض الميزات المرضية للحالة الطبيعية. في هذا البروتوكول، أدرجنا سن متقدمة وتدفق الدم من خلال عرقلة الشرايين السباتية.
نموذج كلاسيكي لانسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) هو النموذج خيوط داخل اللمعة انسداد MCA القريبة، مما يقلل من تدفق الدم في الشرايين الدماغية الأمامية والوسطى. مرات انسداد قصيرة باستخدام هذا النموذج تركز لesion إلى المنطقة تحت القشرية، في حين مرات انسداد أطول يمكن أن يؤدي إلى إصابات كبيرة تجنيد المناطق في كل من المناطق القشرية وتحت القشرية، مما أدى إلى ارتفاع معدل الوفيات في الفئران المسنة. في المقارنة، فإن النموذج المستخدم من قبل مجموعتنا القيام حج القحف وفتح الجافية تليها تخثر الدم وتدمير جزء صغير من MCA باستخدام ملقط الكي ثنائي القطب. ويتم تكييف هذا النموذج الإنفاذ الحراري من ورقة عام 1981 من قبل تامورا وآخرون. (23) واستخدام قطع القحف قد تحد من رفع الضغط داخل الجمجمة، والذي هو سمة من سمات الجمجمة المغلقة، وينتج عنه ارتفاع في استنساخ وانخفاض معدل وفيات في منطقتنا الفوج جراحة بالمقارنة مع بعض نماذج أخرى 13. لتوليد عوائق استنساخه والعجز المستمر نحن تسد بشكل دائم القريبة التقييم القطري المشترك وتسد عابر التقييم القطري المشترك القاصي وفقا تشن وآخرون (14). ونحن نستخدم غير الغازية التصوير بالرنين المغناطيسي T2 المرجحة (MRI) لتقييم مدى ومكان احتشاء الدماغ، ودرجة من تورم في الدماغ في القشرة الحسية.
MCAO في القوارض هو أسلوب يستخدم كثيرا لنموذج السكتة الدماغية الإنسان. لا يكون هذا النموذج بعض التفاصيل أن نلاحظ في البروتوكول. أولا، لا بد من الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في كافة مراحل التجربة لأن ذلك يؤثر على حجم احتشاء وعدد من وفيات في الدراسة. قد يكون من الممكن وقف الأيزوفلورين خلال انسداد عابر الصحيح التقييم القطري المشترك والحفاظ على الفئران في بيئة هادئة استعد لزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة عن طريق الحد من التعرض للالأيزوفلورين. يجب على الباحثين النظر في ما إذا كانت فترة التخدير أقصر يفوق الضغط الحث إضافية. الأوعية الدموية (على سبيل المثال، MCA المتفرعة) من الفئران تختلف داخل وبين أفواج من الحيوانات (22). من المهم أن تضع هذا في الاعتبار عند بداية دراسة جديدة. مختلف الأوقات انسداد التقييم القطري المشترك يمكن تقييم (على سبيل المثال، 30، 45، 60 و 90 دقيقة). في هذه الدراسة تم استخدام الوقت انسداد 60 دقيقة. في دراسات أخرى وجدنا أن 45انسداد دقيقة تسبب احتشاء القشرية الحجم مشابه ولكن مع الادلة من تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة. وفقا لذلك، لديها الجراحين يبدأ مع فترة زمنية قصيرة انسداد (على سبيل المثال، 30 دقيقة) لمعرفة ما إذا كان يتم الحصول على كميات كافية الآفة (و / أو العجز السلوكية المطلوبة) وبعد ذلك فقط إلى زيادة مرات انسداد عند الضرورة. لا تستند العجز السلوكية في الفئران البالغين بالمقارنة مع الفئران المسنة مع أوقات انسداد متطابقة.
التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن استخدامها للحكم على ما إذا كانت (بعد وقت انسداد معين) مجلدات الآفة مناسبة لأهداف الدراسة. ومن شأن آفة صغيرة تمتد أقل من عشرة 0.5 مم شرائح الاكليلية (من أصل 40). ومن شأن حجم الآفة المتوسطة تمتد ما بين عشرة وعشرين شرائح الاكليلية. ومن شأن آفة كبيرة تمتد بين عشرين وثلاثين شرائح الاكليلية. ومن شأن آفة كبيرة جدا تمتد أكثر من ثلاثين من أربعين شرائح. في تجربتنا، والفئران مع آفات كبيرة جدا (أكثر من ثلاثين شرائح) و / أو أدلة من ACROS فتقالصورة خط الوسط وعادة ما يكون بسوء التشخيص: يمكن النظر مرة انسداد أقصر. التصوير بالرنين المغناطيسي هو أيضا مفيد لتقييم الموقع احتشاء: تقع بعض أكثر caudally وبعض وتقع أكثر rostrally.
مزيد من الحذر عند فصل العصب المبهم من كل من الشرايين السباتية. Rales (صرير) قد تحدث بعد الجراحة السكتة الدماغية، وهذا يمكن أن يكون راجعا إلى تلف الأعصاب في بعض الحيوانات، على الرغم من أن السبب غير واضح حاليا: في تجربتنا، التكهن فقيرة جدا لهذه الحيوانات، وعادة ما يوصى بقتلهم إنسانية.
ودائمة نتائج النموذج الإنفاذ الحراري MCAO في عوائق القشرية استنساخه ومقبولة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة في الفئران المسنة. هذه التقنية لا، ومع ذلك، تتطلب جراحة تحت مجهر تشريحي. فمن المهم للحفاظ على تقنية العقيم إذا الحيوانات على التعافي بشكل جيد من الجراحة. يجب الحرص على عدم الإضرار MCA في حين كشف والتخثر في الشريان،والأضرار التي لحقت سطح القشرية ينبغي التقليل إلا فإن المنطقة المكشوفة من القشرة قد تشكل جزءا من منطقة احتشاء. فمن المستحسن للحصول على أكبر قدر من الخبرة ممكن لتحديد الإجراء وتحقيق عوائق ثابتة وتحديد الأوقات انسداد قبل إجراء دراسة لاختبار علاجات مرشح، على سبيل المثال. يجب المجربون بطريقة عشوائية أي علاج داخل جلسات عملية جراحية ( "كتلة العشوائي") حيثما أمكن ذلك. ومن الجدير بالذكر أن هذا النموذج لا تنطوي على MCA ضخه (ما لم يتم استخدام عابرة MCA ربط بدلا من الإنفاذ الحراري). وفيات يمكن أن تكون عالية في الفئران المسنة مع هذه عوائق القشرية كبيرة ولكن يجب أن يكون من الممكن للحد من وفيات باستخدام مرات انسداد أقصر والتقليل من التعرض للتخدير العام حيثما كان ذلك ممكنا (على سبيل المثال، خلال الانسداد). استخدام 70٪ N 2 O و 30٪ O 2 باعتبارها الناقل قد تسمح مستويات أقل من الأيزوفلورين لاستخدامها: هذا خفض التعرض للisofluRANE قد يؤدي إلى ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة.
وثمة نقطة أخرى للنظر هو أن تصلب الشرايين هو عملية تدريجية، في حين أن هذا البروتوكول ومحاكاة مع انسداد CCA الحاد. ومع ذلك، فإن انخفاض كبير في تدفق الدم والعجز مستمرة محاكاة انسداد جنبا إلى جنب التي تحدث في كثير من مرضى السكتة الدماغية. يحدث علاوة على ذلك، دون جنبا إلى جنب التقييم القطري المشترك انسداد، وجدنا الشفاء التلقائي الكبير الذي يحول دون تقييم سلوكي على المدى الطويل من علاجات السكتة الدماغية أكثر من 8 أسابيع: فشل دائم البعيدة MCAO دون جنبا إلى جنب التقييم القطري المشترك انسداد في الفئران للحث على السكتات الدماغية بتكاثر 14. في المقابل، وتبين لنا أن القاصي MCAO مع جنبا إلى جنب التقييم القطري المشترك انسداد يدفع العجز على المدى الطويل في الفئران المسنة.
في الختام، هذا الإجراء في الفئران يسبب السكتات الدماغية التي تشبه في حجمها وموقعها لتلك التي ظهرت في حالة الإنسان، مع العجز المستدامة التي يمكن للمرء أن استخدام لتمكين اختبار علاجات جديدة وتوضيح إعادةآليات الزوج بعد السكتة الدماغية.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. I Mhairi Macrae and Dr. Debbie Dewar, University of Glasgow, who kindly hosted CW and DD for training in this procedure. The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM. This work was also supported by a “Serendipity Grant” from The Dunhill Medical Trust to LM [grant number: SA21/0512].
Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Isoflurane | Abbott | B506 | |
Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
Cautery system | Eschmann | ||
0.25 mm Jeweler caurtery forceps | Eschmann | 8330349 | |
fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Thumb driven saline drip system | |||
Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
16 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
Vascular clip and applicator | |||
Operating microscope | Zeiss | ||
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
25g needles | Terumo | NN-2525R | |
syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
gauze | sterilize before use | ||
Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |