Aquí se presenta un protocolo para producir una oclusión distal medio permanente de la arteria cerebral en ratas hembras de edad avanzada con la oclusión simultánea de las arterias carótidas para generar grandes infartos corticales y los déficits sostenidos. Mostramos la confirmación del tamaño de la lesión mediante resonancia magnética estructural a las 24 horas y 8 semanas después del accidente cerebrovascular.
Stroke típicamente ocurre en las personas de edad avanzada con una gama de comorbilidades incluyendo carótida (u otro arterial) la aterosclerosis, la hipertensión, la obesidad y la diabetes. En consecuencia, cuando la evaluación de terapias para el accidente cerebrovascular en animales, es importante seleccionar un modelo con excelente validez cara. El derrame cerebral isquémico el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares, y la mayoría de éstos se producen en el territorio de la arteria cerebral media (ACM), a menudo inducir infartos que afectan a la corteza sensoriomotora, causando plejia persistente o paresia en el lado contralateral del cuerpo. Nosotros demostramos en este vídeo un método para producir el accidente cerebrovascular isquémico en ratas de edad avanzada, lo que provoca la discapacidad sensoriomotora sostenido y infartos corticales sustanciales. Específicamente, inducimos oclusión permanente distal la arteria cerebral media (MCAO) en ratas hembras de edad avanzada mediante el uso de pinzas de diatermia para ocluir un segmento corto de esta arteria. La arteria carótida en el lado ipsilateral a la lesión era entonces permanently ocluido y la arteria carótida contralateral fue ocluida transitoriamente durante 60 min. Medimos el tamaño del infarto mediante imágenes de resonancia magnética ponderadas en T2 estructural (MRI) a las 24 horas y 8 semanas después del accidente cerebrovascular. En este estudio, el volumen de infarto media fue de 4,5% ± 2,0% (desviación estándar) del hemisferio ipsilateral en 24 hr (corregido para la inflamación del cerebro usando la ecuación de Gerriet, n = 5). Este modelo es factible y clínicamente relevante ya que permite la inducción de déficit sensoriomotoras sostenidos, que es importante para la elucidación de los mecanismos fisiopatológicos y nuevos tratamientos.
El accidente cerebrovascular es actualmente la tercera causa más común de muerte en el mundo y la principal causa de discapacidad 1. El accidente cerebrovascular isquémico, que comprende el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares, a menudo resulta en infartos en la corteza causando la pérdida de la sensibilidad (por ejemplo, la propiocepción), en la función motora y en atención a la parte afectada 2-4. La arteria cerebral media (ACM) es el más grande de los vasos que atrae a la oferta del círculo de Willis y se deriva de la arteria carótida interna 5. El MCA es el vaso cerebral más comúnmente afectados en el accidente cerebrovascular isquémico, con trazos en este territorio que representa el 65% de todos los ictus isquémicos 6,7. La CRM suministra ambas regiones corticales y subcorticales y anormalidades neurológicas causadas por un accidente cerebrovascular MCA varían dependiendo de la ubicación exacta de la oclusión 7. oclusiones proximales MCA afectan el territorio profunda a través de las arterias lenticulostriatal y causan infartos grandes que abarcan tanto cortical y regiones subcorticales. Por el contrario, las oclusiones más distales que privan a las regiones corticales exclusivamente del flujo de sangre tienden a producir infartos corticales más pequeños.
En grandes estudios de población, las lesiones de accidente cerebrovascular humanos van desde 5-14 de% del hemisferio ipsilateral 8,9; El derrame cerebral maligno para el 10% de los accidentes cerebrovasculares y da lugar a infartos más grandes, lo que requiere un hemicraniectomía para reducir la presión intracraneal, y los pacientes con lesiones más pequeñas tienen más probabilidades de sobrevivir 10. Demostramos un modelo reproducible, que produce lesiones que ocupan una proporción similar del hemisferio tantos trazos humanos.
El accidente cerebrovascular es una enfermedad heterogénea; 75% de los ictus isquémicos son inducidos por cualquiera de infartos lacunares (de obstrucción de los vasos intracraneales pequeñas); ictus cardioembólico; o aterosclerosis de las arterias grandes, lo que representa el 30% de los accidentes cerebrovasculares. aterosclerosis sintomática se observa con mayor frecuencia en el punto en el c comúnarteria arotid (CCA) se ramifica en las arterias carótidas internas y externas 11.
modelos preclínicos de accidente cerebrovascular deben ser lo más similar a la condición humana como sea posible para simular su fisiopatología y debe incorporar los factores de riesgo de accidente cerebrovascular. 92% de accidente cerebrovascular isquémico ocurre en personas mayores de 65 años, y otros factores de riesgo incluyen la obesidad, la hipertensión y la aterosclerosis, como se indicó anteriormente 12. Para representar mejor a estos factores de riesgo, se recomienda utilizar un modelo que pueden compartir algunas de las características fisiopatológicas de la condición natural. En este protocolo, se ha incluido la edad avanzada y el flujo sanguíneo obstruido a través de las arterias carótidas.
El modelo clásico de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) es el modelo de filamento intraluminal de MCA oclusión proximal, lo que reduce el flujo sanguíneo en la parte anterior y arterias cerebrales medias. tiempos de oclusión cortas usando este modelo se centra la lEsion a la región subcortical, mientras que los tiempos de oclusión más largas pueden dar lugar a lesiones grandes áreas de ambas las áreas corticales y subcorticales, lo que resulta en una tasa de mortalidad más alta en las ratas de edad avanzada de reclutamiento. En comparación, el modelo utilizado por nuestro grupo implica la realización de una craneotomía y la apertura de la duramadre seguido de la coagulación de la sangre y la destrucción de una pequeña porción de la MCA con unas pinzas de cauterización bipolares. Este modelo de diatermia es una adaptación del artículo de 1981 por Tamura et al. 23 y el uso de la craniectomía puede limitar aumento de la presión intracraneal, que es una característica del cráneo cerrado, y resulta en una mayor reproducibilidad y una tasa de mortalidad más baja en nuestra cohorte cirugía en comparación con algunos otros modelos 13. Para generar infartos reproducibles y sostenida de la discapacidad que ocluyen de forma permanente los extremos proximal CCA y transitoriamente ocluir el CCA distal según Chen imágenes de resonancia magnética ponderadas en T2 no invasiva y col. 14 Utilizamos nuclear (RMN) Para evaluar la extensión y localización del infarto cerebral, y el grado de hinchazón del cerebro en el córtex sensoriomotor.
MCAO en roedores es una técnica frecuentemente utilizada para modelar apoplejía humana. Este modelo tiene algunos detalles a tener en cuenta en el protocolo. En primer lugar, es esencial para mantener la temperatura del cuerpo del animal durante todo el experimento ya que esto afecta el tamaño del infarto y el número de muertes en un estudio. Puede ser posible interrumpir isoflurano durante la oclusión transitoria de la CCA derecha y seguir las ratas en un ambiente calentado, tranquilo para aumentar las tasas de supervivencia al reducir la exposición a isoflurano. Los investigadores deben considerar si un período más corto de anestesia es mayor que la tensión de inducción adicional. La vasculatura (por ejemplo, MCA ramificación) de las ratas varía dentro y entre cohortes de animales 22. Es importante tener esto en cuenta al comenzar un nuevo estudio. Diferentes tiempos de oclusión CCA se pueden evaluar (por ejemplo, 30, 45, 60 y 90 min). En este estudio se utiliza un tiempo de oclusión de 60 min. En otros estudios se ha encontrado que 45min oclusiones causan un infarto cortical de tamaño similar, pero con la evidencia anecdótica de mejores tasas de supervivencia. En consecuencia, tienen los cirujanos comienzan con un corto tiempo de oclusión (por ejemplo, 30 minutos) para ver si se obtienen volúmenes de lesión adecuados (y / o anomalías de comportamiento requeridas) y sólo después de aumentar los tiempos de oclusión en caso necesario. déficits conductuales no se sostienen en ratas adultas en comparación con las ratas de edad avanzada con tiempos de oclusión idénticos.
La RM se puede utilizar para juzgar si (después de un tiempo de oclusión en particular) volúmenes de lesión son apropiadas para los objetivos del estudio. Una lesión pequeña abarcaría menos del diez por 0,5 mm cortes coronales (de los 40). Una lesión de tamaño medio se extendería entre diez y veinte cortes coronales. Una lesión grande se extendería entre veinte y treinta cortes coronales. Una lesión muy grande se extendería más de treinta de los cuarenta rodajas. En nuestra experiencia, las ratas con lesiones muy grandes (más de treinta rebanadas) y / o evidencia de hernia Across de la línea media por lo general tienen un mal pronóstico: los tiempos de oclusión más cortos podrían ser considerados. La RM también es útil para evaluar la localización del infarto: algunos son más caudalmente localizados y algunos se encuentran más rostral.
Tenga mucho cuidado al separar el nervio vago de ambas arterias carótidas comunes. Rales (raspado) se puede producir después de la cirugía accidente cerebrovascular y esto podría ser debido al daño nervioso en algunos animales, aunque la causa es claro en la actualidad: en nuestra experiencia, el pronóstico es muy pobre para estos animales y por lo general se recomienda para matar humanitariamente ellos.
Las permanentes diatermia MCAO resultados del modelo en infartos corticales reproducibles y las tasas de supervivencia después de la operación aceptables en ratas de edad avanzada. La técnica, sin embargo, requiere cirugía invasiva bajo un estereomicroscopio. Es importante mantener una técnica aséptica si los animales han de recuperarse bien de la cirugía. Se debe tener cuidado de no dañar la MCA mientras que la exposición y coagular la arteria,y daño a la superficie cortical debe reducirse al mínimo de lo contrario el área expuesta de la corteza pueden formar parte de la zona del infarto. Se recomienda obtener tanta experiencia como sea posible para establecer el procedimiento y lograr infartos consistentes y determinar los tiempos de oclusión antes de que un estudio se realizó para probar terapias candidatos, por ejemplo. El experimentador debe cambiar aleatoriamente los tratamientos dentro de las sesiones de cirugía ( "bloque de la aleatorización") siempre que sea posible. Vale la pena señalar que este modelo no involucra MCA reperfusión (a menos transitoria ligadura de MCA se utiliza en lugar de diatermia). La mortalidad puede ser alta en ratas de edad avanzada con estas grandes infartos corticales, pero debe ser posible para reducir la mortalidad mediante el uso de tiempos de oclusión más cortos y minimizando la exposición a la anestesia general cuando sea posible (por ejemplo, durante la oclusión). El uso de 70% de N 2 O y 30% de O2 como un vehículo que puede permitir que los niveles más bajos de isoflurano a utilizar: esta exposición reducida a isofluRane puede dar lugar a mayores tasas de supervivencia.
Otro punto a considerar es que la aterosclerosis es un proceso gradual, mientras que en este protocolo se simula con la oclusión aguda de la CCA. Sin embargo, la reducción sustancial en el flujo sanguíneo y los déficits sostenidos simular oclusiones en tándem que se producen en muchos pacientes con accidente cerebrovascular. Permanente distal MCAO sin tándem CCA oclusión en ratas no induce trazos reproducible 14: además, sin tándem CCA oclusión, hemos encontrado una considerable recuperación espontánea ocurre que se opone a la evaluación del comportamiento a largo plazo de las terapias con accidente cerebrovascular durante 8 semanas. Por el contrario, se muestra que la MCAO distal con el tándem CCA oclusión induce déficit a largo plazo en ratas de edad avanzada.
En conclusión, este procedimiento en ratas provoca los movimientos que son similares en tamaño y ubicación a los observados en la condición humana, con discapacidad sostenida que se puede utilizar para permitir el ensayo de nuevos tratamientos y elucidación de remecanismos par después del accidente cerebrovascular isquémico.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. I Mhairi Macrae and Dr. Debbie Dewar, University of Glasgow, who kindly hosted CW and DD for training in this procedure. The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM. This work was also supported by a “Serendipity Grant” from The Dunhill Medical Trust to LM [grant number: SA21/0512].
Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Isoflurane | Abbott | B506 | |
Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
Cautery system | Eschmann | ||
0.25 mm Jeweler caurtery forceps | Eschmann | 8330349 | |
fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Thumb driven saline drip system | |||
Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
16 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
Vascular clip and applicator | |||
Operating microscope | Zeiss | ||
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
25g needles | Terumo | NN-2525R | |
syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
gauze | sterilize before use | ||
Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |