Aqui apresentamos um protocolo para produzir oclusão média distal permanente da artéria cerebral em ratos fêmeas idosos com oclusão simultânea das artérias carótidas de gerar grandes infartos corticais e déficits sustentados. Mostramos confirmação do tamanho da lesão utilizando MRI estrutural às 24 h e 8 semanas após o acidente vascular cerebral.
Acidente vascular cerebral geralmente ocorre em pessoas idosas com uma gama de co-morbidades, incluindo carótida (ou outro arterial) aterosclerose, hipertensão arterial, obesidade e diabetes. Assim, ao avaliar terapias para acidente vascular cerebral em animais, é importante escolher um modelo com excelente validade de face. acidente vascular cerebral isquêmico é responsável por 80% de todos os acidentes vasculares cerebrais, e que a maioria destes ocorrem no território da artéria cerebral média (MCA), muitas vezes induzindo infartos que afetam o córtex sensório-motor, causando plegia persistente ou paralisia no lado contralateral do corpo. Demonstramos neste vídeo um método para a produção de acidente vascular cerebral isquémica em ratos idosos, que faz com que a deficiência sensório sustentada e infartos corticais substanciais. Especificamente, nós induzir oclusão permanente distal da artéria cerebral média (MCAO) em ratas idosas usando uma pinça de diatermia para ocluir um pequeno segmento da artéria. A artéria carótida no lado ipsilateral à lesão foi então permanently ocluída e a artéria carótida contralateral foi transitoriamente ocluído durante 60 min. Medimos o tamanho do infarto usando ressonância magnética ponderada em T2 estrutural (MRI) às 24 horas e 8 semanas após o AVC. Neste estudo, o volume de enfarte média foi 4,5% ± 2,0% (desvio padrão) do hemisfério ipsilateral às 24 h (corrigido para o edema cerebral utilizando a equação de Gerriet, n = 5). Este modelo é viável e clinicamente relevante uma vez que permite a indução de défices sensório-motores sustentados, o que é importante para a elucidação dos mecanismos patofisiológicos e novos tratamentos.
O AVC é atualmente a terceira causa mais comum de morte no mundo ea principal causa de incapacidade 1. Acidente vascular cerebral isquêmico, que compreende 80% de todos os acidentes vasculares cerebrais, muitas vezes resulta em infartos no córtex causando perda de sensação (por exemplo, propriocepção), na função motora e na atenção para o lado afetado 2-4. A artéria cerebral média (MCA) é o maior dos vasos que chama de alimentação do polígono de Willis e caules da artéria carótida interna 5. O MCA é o vaso cerebral mais comumente afetadas no acidente vascular cerebral isquêmico, com golpes neste território representando 65% de todos os acidentes vasculares cerebrais isquêmicos 6,7. O MCA fornece ambas as regiões corticais e subcorticais e anormalidades neurológicas causada por MCA curso variam de acordo com a localização exata da oclusão 7. oclusões proximal MCA afetar a profunda território através das artérias lenticulostriatal e causar grandes infartos abrangendo tanto Cortical e regiões subcorticais. Em contraste, oclusões mais distais que privam regiões corticais apenas do fluxo de sangue tendem a produzir mais pequenos infartos corticais.
Em grandes estudos populacionais, lesões AVC humanos variam de 5-14% do hemisfério ipsilateral 8,9; acidente vascular cerebral maligno é responsável por 10% dos acidentes vasculares cerebrais e dá origem a infartos maiores, exigindo uma hemicraniectomia para reduzir a pressão intracraniana, e os pacientes com lesões menores são mais propensos a sobreviver 10. Nós demonstramos um modelo reproduzível que produz lesões que ocupam uma proporção semelhante do hemisfério como muitos traços humanos.
O AVC é uma doença heterogênea; 75% dos acidentes vasculares cerebrais isquêmicos são induzidos por qualquer infartos lacunares (de obstrução de pequenos vasos intracranianos); AVC cardioembólico; ou aterosclerose da artéria grande, que responde por 30% dos acidentes vasculares cerebrais. aterosclerose sintomática é mais frequentemente observada no ponto em que o C comumartéria arotid (CCA) ramifica nas artérias carótidas internas e externas 11.
modelos pré-clínicos de AVC deve ser tão semelhante à condição humana como possível simular sua fisiopatologia e deve incorporar os fatores de risco de acidente vascular cerebral. 92% de acidente vascular cerebral isquémico ocorre em pessoas com mais de 65 anos de idade, e outros factores de risco incluem a obesidade, a hipertensão arterial, aterosclerose e, tal como anteriormente discutido 12. Para melhor representar esses fatores de risco, recomenda-se usar um modelo que pode partilhar algumas das características fisiopatológicas da condição natural. Neste protocolo, incluímos idade avançada e do fluxo sanguíneo obstruído através das artérias carótidas.
O modelo clássico de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) é o modelo de filamento intraluminal da oclusão MCA proximal, o que reduz o fluxo sanguíneo na região anterior e as artérias cerebrais médias. tempos de oclusão curtas usando este modelo focaliza a lesion para a região subcortical, enquanto que tempos de oclusão mais longas podem resultar em grandes lesões recrutando áreas de ambas as áreas corticais e subcorticais, resultando em uma maior taxa de mortalidade em ratos idosos. Em comparação, o modelo utilizado pelo nosso grupo envolve a execução de uma craniotomia e abertura da dura-máter seguido de coagulação do sangue e a destruição de uma pequena porção da MCA utilizando uma pinça de cauterização bipolar. Este modelo de diatermia é adaptado a partir do papel de 1981 por Tamura et ai. 23 e a utilização da craniectomia pode limitar a pressão intracraniana aumentada, o que é uma característica do crânio fechado, e resulta em maior reprodutibilidade e uma taxa de mortalidade mais baixa no nosso coorte cirurgia em comparação com alguns outros modelos 13. Para gerar infartos reprodutíveis e de incapacidade sustentada que obstruir permanentemente a proximal CCA e transitoriamente ocluir o CCA distal como por Chen et al. 14 Utilizamos a ressonância magnética ponderada em T2 não-invasiva (MRI) Para avaliar a extensão e localização de enfarte cerebral, e o grau de edema cerebral no córtex sensorimotor.
MCAO em roedores é uma técnica frequentemente utilizada para modelar acidente vascular cerebral humano. Este modelo tem alguns detalhes a serem observados no protocolo. Em primeiro lugar, é essencial para manter a temperatura corporal do animal ao longo da experiência como isto afecta a dimensão do enfarte e o número de casos de mortalidade em estudo. Pode ser possível a suspensão de isoflurano durante a oclusão transiente da ACC direita e manter os ratos num ambiente aquecido, tranquilo para aumentar as taxas de sobrevivência através da redução da exposição ao isoflurano. Os pesquisadores devem considerar se um período mais curto anestesia supera o estresse de indução adicional. A vasculatura (por exemplo, ramificação MCA) dos ratos varia dentro e entre grupos de animais 22. É importante ter isso em mente quando começa um novo estudo. Diferentes tempos de oclusão da ACC podem ser avaliados (por exemplo, 30, 45, 60 e 90 min). Neste estudo é utilizado um tempo de oclusão de 60 minutos. Em outros estudos, verificou-se que 45mínimo de oclusões causar um enfarte cortical de tamanho semelhante, mas com evidências de que as taxas de sobrevivência melhoradas. Por conseguinte, têm os cirurgiões começar com um curto tempo de oclusão (por exemplo, 30 minutos) para se ver se os volumes adequados de lesão (e / ou défices comportamentais necessárias) são obtidos e só então para aumentar o tempo de oclusão, quando necessário. déficits comportamentais não são sustentados em ratos adultos em comparação com ratos idosos com tempos de oclusão idênticas.
MRI pode ser usado para julgar se (depois de um determinado tempo de oclusão) volumes de lesão são apropriadas para os objetivos do estudo. Uma pequena lesão mediria menos de dez 0,5 mm cortes coronais (em 40). Uma lesão tamanho médio mediria entre dez e vinte cortes coronais. Um grande lesão mediria entre vinte e trinta cortes coronais. Um muito grande lesão iria abranger mais de trinta dos quarenta fatias. Em nossa experiência, os ratos com grandes lesões (mais de trinta fatias) e / ou evidência de hérnia across linha média geralmente têm mau prognóstico: tempos de oclusão mais curtos pode ser considerada. MRI também é útil para avaliar a localização do enfarte: alguns são mais caudalmente localizado e alguns são mais rostralmente localizado.
Tome cuidado extra ao separar o nervo vago a partir de ambas as artérias carótidas comuns. Estertores (áspero) pode ocorrer após a cirurgia acidente vascular cerebral e isto pode ser devido a danos nos nervos em alguns animais, embora a causa não está claro: em nossa experiência, o prognóstico é muito pobre para estes animais e é geralmente recomendado para matá-los humanamente.
As permanentes diathermy MCAO modelo resulta em infartos corticais reprodutíveis e as taxas de sobrevivência pós-operatórias aceitáveis em ratos idosos. A técnica, no entanto, requerem cirurgia invasiva sob microscópio estereoscópico. É importante manter a técnica asséptica, se os animais são bem para recuperar de uma cirurgia. Cuidados devem ser tomados para não danificar o MCA enquanto expondo e coagulação da artéria,e danos na superfície cortical deve ser minimizado de outra forma a superfície exposta do córtex podem formar parte da área de enfarte. Recomenda-se para obter o máximo de experiência possível para estabelecer o procedimento e para alcançar infartos consistentes e determinar tempos de oclusão antes de um estudo é realizado para testar terapias candidatos, por exemplo. Experimentadores devem embaralhar qualquer tratamento dentro das sessões de cirurgia ( "block randomization") sempre que possível. Vale a pena notar que este modelo não envolve MCA reperfusão (a menos transitória ligadura MCA é usado em vez de diatermia). A mortalidade pode ser elevada em ratos idosos com estas grandes infartos corticais, mas deve ser possível reduzir a mortalidade usando tempos de oclusão mais curtas e por minimização da exposição a uma anestesia geral, sempre que possível (por exemplo, durante a oclusão). A utilização de 70% de N 2 O e 30% de O 2 como um transportador pode permitir níveis mais baixos de isoflurano para ser utilizado: esta exposição reduzida para isoflurane pode resultar em taxas de sobrevivência mais elevadas.
Outro ponto a considerar é que a aterosclerose é um processo gradual, que, neste protocolo, simulá-lo com oclusão aguda CCA. No entanto, a redução substancial no fluxo sanguíneo e déficits sustentados simular oclusões em tandem que ocorrem em muitos pacientes com AVC. Distal MCAO sem paralelo CCA oclusão permanente em ratos não induzir pancadas reproducibly 14: Além disso, sem paralelo oclusão da ACC, descobrimos recuperação espontânea considerável ocorre que impede a avaliação comportamental de longo prazo de terapias AVC ao longo de 8 semanas. Em contraste, mostramos que distal MCAO com conjunto de oclusão CCA induz défices a longo prazo em ratos idosos.
Em conclusão, este procedimento em ratos provoca acidentes vasculares cerebrais que são semelhantes em tamanho e localização às observadas na doença humana, com deficiência sustentada que se pode utilizar para permitir o teste de novos tratamentos e elucidação de remecanismos par após acidente vascular cerebral isquêmico.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. I Mhairi Macrae and Dr. Debbie Dewar, University of Glasgow, who kindly hosted CW and DD for training in this procedure. The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM. This work was also supported by a “Serendipity Grant” from The Dunhill Medical Trust to LM [grant number: SA21/0512].
Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Isoflurane | Abbott | B506 | |
Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
Cautery system | Eschmann | ||
0.25 mm Jeweler caurtery forceps | Eschmann | 8330349 | |
fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Thumb driven saline drip system | |||
Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
16 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
Vascular clip and applicator | |||
Operating microscope | Zeiss | ||
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
25g needles | Terumo | NN-2525R | |
syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
gauze | sterilize before use | ||
Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |