Здесь мы приводим протокол для получения постоянного дистального окклюзии средней мозговой артерии у пожилых самок крыс с одновременным окклюзии сонных артерий генерировать большие корковых инфарктов и устойчивые дефициты. Покажем подтверждение размера повреждения, используя структурную МРТ через 24 часа и 8 недель после инсульта.
Инсульт, как правило, происходит у пожилых людей с целым рядом сопутствующих заболеваний, включая сонной (или другого артериального) атеросклероз, высокое кровяное давление, ожирение и диабет. Соответственно, при оценке терапии инсульта у животных, важно, чтобы выбрать модель с превосходной номинальной действия. Ишемический инсульт приходится 80% всех случаев инсульта, а большинство из них происходят на территории средней мозговой артерии (СМА), часто вызывая инфаркты, которые влияют на сенсомоторной коре, вызывая стойкое плегией или парез на противоположной стороне тела. Покажем в этом видео способ получения ишемический инсульт у пожилых крыс, который вызывает устойчивый сенсомоторную инвалидности и существенные корковых инфарктов. В частности, мы побудить постоянный дальний окклюзии средней мозговой артерии (МСАО) у пожилых самок крыс с помощью диатермии щипцы для закупоривания короткий отрезок этой артерии. Сонную артерию на той же стороне к поражения было то рermanently окклюзии и контралатеральной сонной артерии, временно окклюзии в течение 60 мин. Мы измеряем размер инфаркта с помощью структурной T2-взвешенных магнитно-резонансной томографии (МРТ) через 24 часа и 8 недель после инсульта. В этом исследовании, средняя инфаркта объем был 4,5% ± 2,0% (стандартное отклонение) ипсилатерального полушария через 24 часа (с поправкой на набухание мозга с использованием уравнения Gerriet, в п = 5). Эта модель является реальным и клинически значимыми, поскольку позволяет индукцию устойчивых дефицитов сенсомоторных, что очень важно для выяснения патофизиологических механизмов и новых методов лечения.
Инсульт в настоящее время является третьей наиболее распространенной причиной смерти во всем мире и ведущей причиной инвалидности 1. Ишемический инсульт, который включает 80% всех инсультов, часто приводит к инфарктов в коре, вызывающего потерю ощущения (например, Проприоцепция), в моторной функции и во внимании к пораженной стороне 2-4. Средней мозговой артерии (СМА) является самым крупным из сосудов, что привлекает снабжение из круга Уиллис и проистекает из внутренней сонной артерии 5. MCA является церебральный судно чаще всего пострадавших при ишемическом инсульте, штрихами на этой территории составляет 65% от всех ишемических инсультов 6,7. MCA поставляет как корковых и подкорковых областей и неврологические отклонения, вызванные инсультом MCA в зависимости от точного местоположения окклюзии 7. Проксимальный MCA окклюзии влияют на глубокую территорию через lenticulostriatal артерий и вызвать большие инфаркты охватывающее как Кортикал и подкорковых областях. В противоположность этому, более дистальных окклюзии, лишающие исключительно областях коры кровотока, как правило, производят меньшие корковых инфарктов.
В крупных популяционных исследованиях, поражения инсульт человека варьируются от 5-14% ипсилатерального полушария 8,9; злокачественная инсульта составляет 10% инсультов и порождает больших инфарктов, требуя hemicraniectomy снизить внутричерепное давление, и пациенты с меньшими повреждениями, более вероятно, чтобы выжить 10. Покажем воспроизводимый модель, которая производит поражений, которые занимают аналогичную пропорцию полушарии как многих человеческих штрихами.
Инсульт является гетерогенным заболеванием; 75% ишемических инсультов индуцируются либо лакунарных инфарктов (от обструкции внутричерепных мелких сосудов); кардиоэмболического инсульта; или большой атеросклероз артерий, на долю которого приходится 30% инсультов. Симптомом атеросклероз чаще всего наблюдается в точке, где общий грarotid артерии (ССА) разветвляется на внутренних и внешних сонных артерий 11.
Доклинические модели инсульта должны быть максимально приближены к человеческому состоянии, насколько это возможно, чтобы имитировать его патофизиологии и должны включать в себя факторы риска инсульта. 92% ишемического инсульта возникает у людей в возрасте старше 65 лет, а также другие факторы риска включают ожирение, высокое кровяное давление и атеросклероз, как обсуждалось ранее 12. Чтобы лучше представить эти факторы риска, рекомендуется использовать модель, которая может поделиться некоторыми из патофизиологических особенностей естественного состояния. В этом протоколе, мы включили преклонного возраста и осложненные кровоток через сонные артерии.
Классическая модель окклюзии средней мозговой артерии (МСАО) является внутрипросветное модель нить проксимального окклюзии МСА, что снижает кровоток в передней и средней мозговых артерий. Короткое время окклюзии, использующие эту модель фокусирует лesion к подкорковых области, в то время как более длительные времена окклюзии может привести к крупным поражением вербовкой области обоих корковых и подкорковых областях, в результате чего более высокой смертности у пожилых крыс. Для сравнения, модель, используемая в нашей группе включает в себя проведение краниотомии и открытие твердой мозговой оболочки с последующим свертывания крови и разрушения небольшого участка MCA использованием биполярных прижигание щипцов. Эта модель диаметрия приспособлен от 1981 бумаге Тамура и др. 23 и использование удаление фрагментов костей черепа может ограничить повышенное внутричерепное давление, которое является особенностью закрытом черепе, и приводит к увеличению воспроизводимости и низкий уровень смертности в нашей хирургии когорте по сравнению с некоторыми другими моделями 13. Для создания воспроизводимых инфаркты и устойчивый инвалидности мы постоянно закрывают проксимальный ОАС и временно закрывают дистального CCA согласно Chen и др. 14 Мы используем неинвазивной T2-взвешенных магнитно-резонансной томографии (МРТ), Чтобы оценить размеры и местоположение церебрального инфаркта, и степень набухания мозга в сенсомоторной коре.
МСАО у грызунов является метод часто используется для моделирования человеческого инсульта. Эта модель имеет несколько деталей отметить в протоколе. Во-первых, важно, чтобы поддерживать температуру тела животного в течение всего эксперимента, как это влияет на размер инфаркта и количество случаев гибели в исследовании. Это может быть возможным, чтобы прекратить изофлуран течение временной окклюзии правой ССА и держать крыс в подогретый, спокойной обстановке, чтобы увеличить выживаемость за счет снижения воздействия изофлуран. Исследователи должны рассмотреть вопрос о целесообразности более короткий период анестезии перевешивает стресса дополнительного индукции. Сосудистую (например, MCA ветвления) крыс изменяется в пределах и между когорт животных 22. Важно иметь в виду, когда начинают новое исследование. Различные CCA раз окклюзии может быть оценена (например, 30, 45, 60 и 90 мин). В этом исследовании используют временную окклюзию 60 мин. В других исследованиях было обнаружено, что 45мин окклюзии вызвать подобную размера корковой инфаркт, но с неподтвержденной улучшенных показателей выживаемости. Соответственно, есть хирурги начинают с коротким временем окклюзии (например, 30 мин), чтобы увидеть, будут ли получены достаточные объемы поражения (и / или необходимые поведенческие дефициты) и только потом увеличивать раз окклюзии, где это необходимо. Поведенческие дефициты не выдержал у взрослых крыс по сравнению с пожилыми крыс с одинаковыми раза окклюзии.
МРТ может использоваться, чтобы судить ли (после определенного времени окклюзии) объемы поражения являются подходящими для целей исследования. Небольшой поражение будет охватывать менее десяти 0,5 мм корональные срезы (из 40). Поражение среднего размера будет охватывать между десятью и двадцатью корональных ломтиками. Большая поражение будет охватывать между двадцатью и тридцатью корональных ломтиками. Очень большое поражение будет охватывать более тридцати из сорока ломтиками. По нашему опыту, крысы с очень большими поражениями (более тридцати ломтиками) и / или данные о грыжи ACROSы по средней линии, как правило, имеют плохой прогноз: сокращение времени окклюзии может рассматриваться. МРТ также полезно для оценки местоположения инфаркта: некоторые более каудально расположены и некоторые из них более ростральным расположен.
Проявите особую осторожность при отделении блуждающего нерва с обеих общих сонных артерий. Хрипы (грубая) может возникнуть после инсульта хирургии, и это может быть из-за повреждения нерва в некоторых животных, хотя причина в настоящее время неясно: по нашему опыту, прогноз очень плохой для этих животных, и это, как правило, рекомендуется гуманно убить их.
Постоянные результаты модели диаметрия MCAO в воспроизводимых корковых инфарктов и приемлемым ставкам послеоперационных выживания в пожилых крыс. Техника, тем не менее, требуют инвазивной хирургии под стереомикроскопа. Важно поддерживать асептики, если животные хорошо восстановиться после хирургического вмешательства. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить MCA разоблачая и коагулянты артерию,и повреждение поверхности коры должно быть минимизировано в противном случае открытые участки коры могут образовывать часть области инфаркта. Рекомендуется для получения как можно больше опыта, как это возможно, чтобы установить порядок и добиться согласованных инфаркты и определить раз окклюзии, прежде чем исследование выполняется для проверки кандидатов терапии, например. Экспериментаторы должны выборочно любые процедуры в рамках операции сессий ( "блок рандомизации"), где это возможно. Стоит отметить, что эта модель не предполагает MCA реперфузии (если переходный MCA перевязки не используется вместо диатермией). Смертность может быть высокой у пожилых крыс с этих больших корковых инфарктов, но это должно быть возможным, чтобы снизить смертность при использовании более короткого времени окклюзии и сведения к минимуму воздействия на общий наркоз, где это возможно (например, во время окклюзии). Использование 70% N 2 O и 30% O 2 в качестве носителя может позволить более низкие уровни изофлуран, которые будут использоваться: это снижение воздействия isofluRane может привести к увеличению выживаемости.
Еще один момент, чтобы рассмотреть, что атеросклероз это постепенный процесс, в то время как в этом протоколе мы его имитации с острым ОСО окклюзии. Тем не менее, существенное снижение кровотока и устойчивых дефицитов имитации тандем окклюзии, которые происходят во многих пациентов, перенесших инсульт. Постоянная дистальный МСАО без тандеме CCA окклюзии у крыс не может стимулировать штрихи воспроизводимо 14: кроме того, без тандемного ОСО окклюзии, мы нашли значительное спонтанное восстановление происходит, что исключает долгосрочное поведенческое оценку хода терапии в течение 8 недель. В противоположность этому, мы покажем, что дистальная МСАО с тандеме ОСО окклюзия вызывает долгосрочные дефицита у пожилых крыс.
В заключение, эта процедура у крыс вызывает инсульты, которые похожи по размеру и расположению к тем, которые наблюдаются в человеческом состоянии, с устойчивой инвалидности, которые можно использовать для того, чтобы тестирование новых методов лечения и выяснения репара механизмы после ишемического инсульта.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. I Mhairi Macrae and Dr. Debbie Dewar, University of Glasgow, who kindly hosted CW and DD for training in this procedure. The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM. This work was also supported by a “Serendipity Grant” from The Dunhill Medical Trust to LM [grant number: SA21/0512].
Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Isoflurane | Abbott | B506 | |
Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
Cautery system | Eschmann | ||
0.25 mm Jeweler caurtery forceps | Eschmann | 8330349 | |
fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Thumb driven saline drip system | |||
Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
16 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
Vascular clip and applicator | |||
Operating microscope | Zeiss | ||
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
25g needles | Terumo | NN-2525R | |
syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
gauze | sterilize before use | ||
Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |