Hier presenteren we een protocol om permanent distale middelste cerebrale slagader occlusie bij oudere vrouwelijke ratten te produceren met gelijktijdige afsluiting van de halsslagaders om grote corticale infarcten en aanhoudende tekorten te genereren. We tonen de bevestiging van de laesie grootte met behulp van structurele MRI bij 24 uur en 8 weken na een beroerte.
Beroerte ontstaat meestal bij oudere mensen met een bereik van comorbiditeit, waaronder carotis (of andere arteriële) atherosclerose, hoge bloeddruk, obesitas en diabetes. Dienovereenkomstig, bij de beoordeling therapieën voor een beroerte bij dieren, is het belangrijk om een model met uitstekende face validity selecteren. Ischemische beroerte is goed voor 80% van alle beroertes, en de meerderheid van deze optreedt op het grondgebied van de middelste cerebrale slagader (MCA), vaak induceren infarcten dat de sensorimotorische cortex beïnvloeden, waarbij een aanhoudende plegia of parese aan de contralaterale zijde van het lichaam. We tonen in deze video een methode voor het produceren van ischemische beroerte bij oudere ratten, waarvoor aanhoudende sensomotorische handicap en substantiële corticale infarcten veroorzaakt. In het bijzonder, we veroorzaken permanente distale middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) bij oudere vrouwelijke ratten met behulp van diathermie tang om een korte segment van de slagader af te sluiten. De halsslagader aan de ipsilaterale kant van de laesie werd vervolgens permanently afgesloten en de contralaterale halsslagader werd transient afgesloten gedurende 60 minuten. Wij meten de infarctgrootte met behulp van genoemde T2-gewogen magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en 24 uur en 8 weken na een beroerte. In deze studie, de gemiddelde infarct volume was 4,5% ± 2,0% (standaard deviatie) van de ipsilaterale hemisfeer na 24 uur (gecorrigeerd voor zwelling van de hersenen met behulp Gerriet de vergelijking, n = 5). Dit model is uitvoerbaar en klinisch relevant omdat het de inductie van tekorten aanhoudende sensorimotorische, wat belangrijk is voor het ophelderen van pathofysiologische mechanismen en nieuwe behandelingen toestaat.
Beroerte is momenteel de derde meest voorkomende doodsoorzaak wereldwijd en de belangrijkste oorzaak van invaliditeit 1. Ischemische beroerte, die 80% van alle beroertes omvat, resulteert vaak in infarcten in de cortex waardoor het verlies in de sensatie (bv, proprioceptie), in de motorische functie en in de aandacht op de aangedane zijde 2-4. De middelste cerebrale slagader (MCA) is de grootste van de schepen dat het aanbod trekt uit de cirkel van Willis en vloeit voort uit de interne halsslagader 5. Het MCA is de cerebrale schip meest getroffen in ischemische beroerte, met slagen in dit gebied goed voor 65% van alle ischemische beroerte 6,7. De MCA levert zowel corticale en subcorticale regio's en neurologische afwijkingen veroorzaakt door MCA een beroerte zijn afhankelijk van de exacte locatie van de occlusie 7. Proximale MCA afsluitingen van invloed op de diepe grondgebied door de lenticulostriatal slagaders en veroorzaken grote infarcten die zowel cortical en subcorticale regio's. In contrast, meer distale afsluitingen die uitsluitend corticale gebieden te beroven van de bloedstroom hebben de neiging om kleinere corticale infarcten veroorzaken.
In grote populatie studies, de menselijke beroerte laesies variëren 5-14% van de ipsilaterale hemisfeer 8,9; maligne lijn vertegenwoordigt 10% van beroertes en leidt tot grotere infarcten, die een hemicraniectomy intracraniële druk te verlagen, en patiënten met kleinere laesies vaker overleven 10. We tonen een reproduceerbaar model dat laesies die een vergelijkbaar deel van de halve bol als vele menselijke beroertes bezetten produceert.
Beroerte is een heterogene ziekte; 75% van ischemische beroerte worden veroorzaakt door een van beide lacunaire infarcten (van obstructie van de intracraniële kleine schepen); cardioembolische beroerte; of grote atherosclerose, die goed is voor 30% van de beroertes. Symptomatische atherosclerose wordt meestal waargenomen op het punt waar de gemeenschappelijke carotid slagader (CCA) zich vertakt in de interne en externe halsslagaders 11.
Pre-klinische modellen van een beroerte moet als vergelijkbaar met de menselijke conditie zijn mogelijk bij de pathofysiologie simuleren en moet de risicofactoren van een beroerte te nemen. 92% van ischemische beroerte komt voor bij mensen ouder dan 65, en andere risicofactoren omvatten obesitas, hoge bloeddruk en atherosclerose, zoals eerder besproken 12. Om beter vertegenwoordigen deze risicofactoren, is het raadzaam om een model dat een aantal van de pathofysiologische kenmerken van de natuurlijke toestand kunnen delen te gebruiken. In dit protocol hebben we opgenomen leeftijd en belemmerd bloedstroom door de halsslagaders.
Het klassieke model van middelste cerebrale arterie occlusie (MCAO) is de intraluminale filament model proximale MCA occlusie, die bloedstroom in de voorste en middelste cerebrale arteriën vermindert. Korte occlusie tijden het gebruik van dit model richt zich op de lEsion de subcorticale regio, terwijl langere occlusie tijd leiden tot grote laesies werven delen van zowel de corticale en subcorticale gebieden, wat resulteert in een hoger sterftecijfer bij oudere ratten. Ter vergelijking, het model van de groep omvat het uitvoeren van een craniotomie en opening van de dura gevolgd door bloedstolling en vernietiging van een klein gedeelte van de MCA via het verbranden bipolaire tang. Dit diathermie model is aangepast van het 1981 artikel van Tamura et al. 23 en het gebruik van de craniectomy kan beperken verhoogde intracraniale druk, die een kenmerk van de gesloten schedel en resulteert in hogere reproduceerbaarheid en een lagere sterfte in onze praktijk cohort in vergelijking met andere modellen 13. Reproduceerbare infarcten en langdurige invaliditeit genereren we permanent afsluiten en het proximale CCA tijdelijk afsluiten het distale CCA volgens Chen et al. 14 Wij maken gebruik van niet-invasieve T2-gewogen magnetische resonantie beeldvorming (MRI) De omvang en locatie van herseninfarct, en de mate van zwelling van de hersenen in de sensorimotorische cortex evalueren.
MCAO in knaagdieren is een techniek vaak toegepast om menselijke slagmodel. Dit model heeft wel een paar details op te merken in het protocol. Ten eerste is het essentieel om de lichaamstemperatuur van het dier te handhaven gedurende het experiment wordt de grootte van het infarct en het aantal sterfgevallen in een studie beïnvloedt. Het kan mogelijk zijn om isofluraan stoppen tijdens de transiënte occlusie van de rechter CCA en bewaar ratten in een verwarmde, rustige overleving te verhogen door het verminderen van de blootstelling aan isofluraan. Onderzoekers moeten overwegen of een kortere periode verdoving opweegt tegen de stress van extra inductie. Het vaatstelsel (bijv MCA vertakking) van de ratten varieert binnen en tussen cohorten van 22 dieren. Het is belangrijk om dit in gedachten te houden bij het begin van een nieuwe studie. Verschillende CCA occlusie tijd worden geëvalueerd (bijvoorbeeld 30, 45, 60 en 90 min). In dit onderzoek een occlusie van 60 min wordt gebruikt. In andere studies hebben we gevonden dat 45min afsluitingen veroorzaken een vergelijkbare grootte corticale infarct, maar met anekdotisch bewijs van verbeterde overleving. Dienovereenkomstig hebben de chirurgen beginnen met een korte occlusietijd (bijvoorbeeld 30 minuten) om te zien of er voldoende laesie volumes (en / of vereist gedragsstoornissen) verkregen en pas daarna indien nodig occlusie malen te verhogen. Behavioural tekorten worden niet ondersteund in volwassen ratten dan bij oudere ratten met identieke occlusie tijden.
MRI kan worden gebruikt om te beoordelen of (na een bepaalde occlusietijd) laesie volumes geschikt voor de studie doelen. Een kleine laesie zou overspannen minder dan tien 0,5 mm coronale plakjes (van de 40). Een middelgrote laesie zou overbruggen tussen de tien en twintig coronale plakjes. Een grote laesie zou overbruggen tussen de twintig en dertig coronale plakjes. Een zeer grote laesie zou meer dan dertig van de veertig plakjes overspannen. In onze ervaring, ratten met zeer grote laesies (meer dan dertig plakjes) en / of het bewijs van herniation across de middellijn hebben meestal een slechte prognose: kortere occlusie tijden kan worden beschouwd. MRI is ook handig voor de beoordeling van de infarct locatie: sommige zijn meer caudaal gelegen en sommige zijn meer rostraal gevestigd.
Wees extra voorzichtig bij het scheiden van de nervus vagus van zowel de gemeenschappelijke halsslagaders. Rales (raspen) kunnen optreden na een beroerte chirurgie en dit kan worden veroorzaakt door schade aan de zenuwen in sommige dieren, hoewel de oorzaak is op dit moment onduidelijk: in onze ervaring, prognose is zeer slecht voor deze dieren en het is meestal aangeraden om ze op humane wijze te doden.
De permanente diathermie MCAO model resulteert in reproduceerbare corticale infarcten en acceptabele postoperatieve overleving bij oudere ratten. De techniek heeft echter, vereisen invasieve chirurgie onder een stereomicroscoop. Het is belangrijk om aseptische omstandigheden te handhaven als dieren zeer snel herstellen van een operatie. Let erop dat de MCA niet beschadigd terwijl het blootstellen en coaguleren de slagader,en beschadiging van het corticale oppervlak moet worden geminimaliseerd anders het blootgestelde oppervlak van de cortex mag in de infarct zone vormen. Het verdient aanbeveling om zoveel mogelijk ervaring te verkrijgen om de procedure en om consistente infarcten bereiken en vast occlusie keer voordat een onderzoek wordt uitgevoerd om kandidaat therapieën testen, bijvoorbeeld. Onderzoekers moeten alle behandelingen binnen chirurgie sessies willekeurig ( "block randomisatie") waar mogelijk. Het is vermeldenswaard dat dit model MCA reperfusie geen sprake is (tenzij transient MCA ligatie wordt gebruikt in plaats van diathermie). Hoge mortaliteit bij oudere ratten met deze grote corticale infarcten maar het moet mogelijk zijn om de mortaliteit verminderen door occlusie kortere tijden en door het minimaliseren van de blootstelling aan algemene anesthesie plaats mogelijk is (bijvoorbeeld tijdens occlusie). Het gebruik van 70% N2 en 30% O O 2 als drager kunnen lagere isofluraan laten gebruiken: deze verminderde blootstelling aan isofluRane kan resulteren in hogere overlevingskansen.
Een ander punt van overweging is dat atherosclerose is een geleidelijk proces, dat in dit protocol te simuleren we het met acute CCA occlusie. De aanzienlijke vermindering van de bloedstroom en aanhoudende tekorten simuleren tandem occlusies die komen in veel patiënten met een beroerte. Permanente distale MCAO zonder tandem CCA occlusie bij ratten niet beroertes reproduceerbaar 14 opwekken bovendien zonder tandem CCA occlusie, hebben we aanzienlijke treedt spontaan herstel opzicht uit langdurige gedragsevaluatie beroerte therapieën dan 8 weken. In tegenstelling, tonen wij aan dat distale MCAO met tandem CCA occlusie induceert tekorten langdurig bij oudere ratten.
Tot slot, deze procedure bij ratten veroorzaakt slagen die vergelijkbaar in grootte en locatie met die bij de menselijke conditie zijn, met aanhoudende handicap die men kan gebruiken om het testen van nieuwe behandelingen en opheldering van hergebruik mogelijk te makenpair mechanismen na ischemische beroerte.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. I Mhairi Macrae and Dr. Debbie Dewar, University of Glasgow, who kindly hosted CW and DD for training in this procedure. The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM. This work was also supported by a “Serendipity Grant” from The Dunhill Medical Trust to LM [grant number: SA21/0512].
Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Isoflurane | Abbott | B506 | |
Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
Cautery system | Eschmann | ||
0.25 mm Jeweler caurtery forceps | Eschmann | 8330349 | |
fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Thumb driven saline drip system | |||
Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
16 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
Vascular clip and applicator | |||
Operating microscope | Zeiss | ||
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
25g needles | Terumo | NN-2525R | |
syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
gauze | sterilize before use | ||
Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |