Här presenterar vi ett protokoll för att producera permanent distala mitten cerebral artärocklusion hos äldre honråttor med samtidig ocklusion av halspulsåder för att generera stora kortikala infarkter och ihållande underskott. Vi visar bekräftelse av skadestorleken med hjälp av strukturell MRI vid 24 timmar och 8 veckor efter stroke.
Stroke typiskt förekommer i äldre personer med en rad andra sjukdomar, inklusive halspulsådern (eller annan arteriell) åderförkalkning, högt blodtryck, fetma och diabetes. Följaktligen vid utvärdering av terapier för stroke hos djur, är det viktigt att välja en modell med utmärkt ansikte giltighet. Ischemisk stroke står för 80% av alla slag, och majoriteten av dessa förekommer i det område av den mellersta cerebral artär (MCA), ofta inducera infarkter som påverkar sensorimotor cortex, orsaka ihållande plegia eller förlamning på den kontralaterala sidan av kroppen. Vi visar i denna video en metod för framställning av ischemisk stroke hos äldre råttor, vilket orsakar ihållande sensomotoriska funktionshinder och betydande kortikala infarkter. Specifikt vi framkallar permanent distala mitten cerebral artärocklusion (MCAO) i äldre honråttor med diatermi pincett för att täppa ett kort segment av denna artär. Karotidartären på den ipsilaterala sidan till lesionen var då permanently ockluderas och den kontralaterala halspulsådern transient ockluderades under 60 min. Vi mäter infarktstorleken med hjälp av struktur T2-viktade magnetisk resonanstomografi (MRT) på 24 timmar och 8 veckor efter stroke. I denna studie var den genomsnittliga infarktvolymen var 4,5% ± 2,0% (standardavvikelse) på den ipsilaterala hemisfären vid 24 h (korrigerat för hjärnsvullnad med användning Gerriet ekvation, n = 5). Denna modell är genomförbar och kliniskt relevant eftersom den tillåter induktion av ihållande sensomotoriska svårigheter, vilket är viktigt för att klarlägga patofysiologiska mekanismer och nya behandlingar.
Stroke är för närvarande den tredje vanligaste dödsorsaken i världen och den vanligaste orsaken till handikapp en. Ischemisk stroke, som omfattar 80% av alla slag, resulterar ofta i infarkter i cortex orsakar förlust i känsla (t.ex. proprioception), i motorik och uppmärksamhet på den drabbade sidan 2-4. Den mellersta cerebral artär (MCA) är den största av de fartyg som drar leverans från kretsen av Willis och stjälkar från inre halsartären 5. MCA är den cerebrala kärl mest drabbade i ischemisk stroke, med slag i detta område står för 65% av alla ischemisk stroke 6,7. MCA levererar både kortikala och subkortikala regioner och neurologiska avvikelser orsakade av MCA stroke varierar beroende på den exakta platsen för ocklusion 7. Proximal MCA ocklusioner påverkar djupa territorium genom lenticulostriatal artärerna och orsaka stora infarkter omfattar både Cortical och subkortikala regioner. Däremot mer distala ocklusioner som berövar enbart kortikala regioner av blodflödet tenderar att producera mindre kortikala infarkter.
I stora befolkningsstudier, mänskliga stroke skador varierar från 5 till 14% av den ipsilaterala halvklotet 8,9; malignt slag står för 10% av stroke och ger upphov till större infarkter, kräver en hemicraniectomy att minska intrakraniellt tryck, och patienter med mindre skador är mer benägna att överleva 10. Vi visar en reproducerbar modell som producerar lesioner som upptar en lika stor andel av halvklotet så många mänskliga drag.
Stroke är en heterogen sjukdom; 75% av ischemisk stroke induceras av antingen lakunära infarkter (från obstruktion av intrakraniella små kärl); cardioembolic stroke; eller stor artär ateroskleros, som står för 30% av stroke. Symtomatisk ateroskleros är oftast observerade vid den punkt där den gemensamma carotid artär (CCA) förgrenar sig i de interna och externa halspulsåder 11.
Prekliniska modeller av stroke bör vara så lik människans villkor som möjligt för att simulera dess patofysiologi och bör omfatta riskfaktorer för stroke. 92% av ischemisk stroke inträffar hos personer över 65 år, och andra riskfaktorer inkluderar övervikt, högt blodtryck, och åderförkalkning, som tidigare diskuterats 12. För att bättre representera dessa riskfaktorer, är det rekommenderat att använda en modell som kan dela med sig av de patofysiologiska egenskaperna hos det naturliga tillståndet. I detta protokoll, har vi inkluderat hög ålder och hindras blodflödet genom halspulsåder.
Den klassiska modellen för arteria cerebri media ocklusion (MCAO) är det intraluminala filamentmodell av proximal MCA-ocklusion, vilket minskar blodflödet i den främre och mellersta cerebrala artärer. Korta ocklusion gånger med denna modell fokuserar lesion till subkortikal region, medan längre ocklusion gånger kan resultera i stora skador rekrytera områden av såväl de kortikala och subkortikala områden, vilket resulterar i en högre dödlighet hos äldre råttor. I jämförelse, innefattar den modell som används av vår grupp att utföra en kraniotomi och öppning av dura följt av koagulering av blodet och förstörelse av en liten del av MCA med hjälp av bipolära etsande pincett. Denna diatermi modell är anpassad från 1981 uppsats av Tamura et al. 23 och användningen av den craniectomy kan begränsa förhöjt intrakraniellt tryck, vilket är en funktion av den slutna skalle, och resulterar i högre reproducerbarhet och en lägre dödlighet i vår kirurgi kohort jämfört med vissa andra modeller 13. För att generera reproducerbara infarkter och ihållande funktionsnedsättning vi permanent täppa proximala CCA och tillfälligt täppa distala CCA enligt Chen et al. 14 Vi använder icke-invasiv T2-viktade magnetisk resonanstomografi (MRT) För att utvärdera omfattningen och lokaliseringen av hjärninfarkt, och graden av hjärnan svullnad i sensomotoriska cortex.
MCAO hos gnagare är en teknik som ofta används för att modellera mänskliga stroke. Denna modell har ett par detaljer att notera i protokollet. För det första är det viktigt att upprätthålla djurets kroppstemperatur genom hela experimentet, eftersom detta påverkar storleken på infarkten och antalet döda i en studie. Det kan vara möjligt att avbryta isofluran under den transienta tilltäppning av rätt CCA och hålla råttor i en uppvärmd, lugn miljö för att öka överlevnaden genom att minska exponeringen för isofluran. Forskare bör överväga om en kortare anestesi period uppväger stressen ytterligare induktion. Kärl (t.ex. MCA förgrening) av råttorna varierar inom och mellan grupper av djur 22. Det är viktigt att ha detta i åtanke när du börjar en ny studie. Olika CCA ocklusion gånger kan utvärderas (t.ex. 30, 45, 60 och 90 min). I denna studie en ocklusion av 60 min används. I andra studier har vi funnit att 45min ocklusioner orsaka en liknande storlek kortikala infarkt men med anekdotiska bevis för förbättrad överlevnad. Följaktligen har kirurger börjar med en kort ocklusion tid (t.ex. 30 min) för att se om tillräckliga lesion volymer (och / eller nödvändiga beteendestörningar) erhålls och först därefter öka ocklusion gånger vid behov. Beteende underskott inte upprätthållas i vuxna råttor jämfört med äldre råttor med identiska ocklusion gånger.
MRT kan användas för att bedöma om (efter en viss ocklusion tid) lesion volymer är lämpliga för studie mål. En liten skada skulle sträcka sig mindre än tio 0,5 mm koronala skivor (av 40). Ett medium lesion storlek skulle sträcka sig mellan tio och tjugo coronal skivor. En stor skada skulle sträcka sig mellan tjugo och trettio coronal skivor. En mycket stor skada skulle sträcka sig över mer än trettio av de fyrtio skivor. I vår erfarenhet, råttor med mycket stora skador (mer än trettio skivor) och / eller tecken på diskbråck Across mittlinjen har oftast dålig prognos: kortare ocklusion tider kan övervägas. MRT är också användbar för att bedöma infarkt plats: vissa är mer kaudalt beläget och vissa är mer rostrally belägna.
Var extra försiktig när separera vagusnerven från både vanliga halspulsåder. Rassel (rasping) kan förekomma efter stroke operation och detta kan bero på nervskador hos vissa djur, även om orsaken är för närvarande oklart: i vår erfarenhet, är mycket dålig för dessa djur prognos och det är oftast rekommenderas att humant döda dem.
De permanenta diatermi kortex modellresultat i reproducerbara kortikala infarkter och godtagbara postoperativa överlevnad hos äldre råttor. Tekniken har dock kräva invasiv kirurgi under ett stereomikroskop. Det är viktigt att bibehålla aseptisk teknik om djuren att återhämta sig väl från kirurgi. Man måste vara försiktig att inte skada MCA men utsatte och koagulerar artären,och skada på kortikala ytan bör minimeras annars det exponerade området av hjärnbarken kan utgöra en del av infarktområdet. Det rekommenderas att få så mycket erfarenhet som möjligt för att fastställa förfarandet och för att uppnå konsekventa infarkter och bestämma ocklusion gånger innan en studie utförs för att testa terapikandidater, till exempel. Praktiker bör slumpmässigt alla behandlingar inom kirurgi sessioner ( "block randomisering") där så är möjligt. Det är värt att notera att denna modell inte innebär MCA reperfusion (om inte övergående MCA ligation används istället för diatermi). Dödligheten kan vara hög i äldre råttor med dessa stora kortikala infarkter men det bör vara möjligt att minska dödligheten genom att använda kortare ocklusion gånger och genom att minimera exponeringen för narkos där så är möjligt (t.ex. under ocklusion). Användning av 70% N 2 O och 30% O 2 som en bärare kan tillåta lägre nivåer av isofluran som skall användas: denna reducerade exponering för isoflurane kan resultera i högre överlevnad.
En annan sak att tänka på är att åderförkalkning är en gradvis process, medan i detta protokoll vi simulera det med akut CCA ocklusion. Men den kraftiga minskningen av blodflödet och ihållande underskott simulera tandem ocklusioner som förekommer i många strokepatienter. Permanent distala MCAO utan tandem CCA ocklusion hos råttor misslyckas att inducera stroke reproducerbart 14: dessutom utan tandem CCA ocklusion, har vi funnit betydande spontan återhämtning inträffar som utgör hinder för en långsiktig beteende utvärdering av stroke terapier under 8 veckor. Däremot visar vi att distal kortex med tandem CCA ocklusion inducerar långvariga underskott hos äldre råttor.
Sammanfattningsvis, detta förfarande hos råttor orsakar linjer som har liknande storlek och läge för de som ses i människans villkor, med bibehållen funktionshinder som man kan använda för att möjliggöra testning av nya behandlingar och klarläggande av repar mekanismer efter ischemisk stroke.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. I Mhairi Macrae and Dr. Debbie Dewar, University of Glasgow, who kindly hosted CW and DD for training in this procedure. The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM. This work was also supported by a “Serendipity Grant” from The Dunhill Medical Trust to LM [grant number: SA21/0512].
Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Isoflurane | Abbott | B506 | |
Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
Cautery system | Eschmann | ||
0.25 mm Jeweler caurtery forceps | Eschmann | 8330349 | |
fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Thumb driven saline drip system | |||
Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
16 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
Vascular clip and applicator | |||
Operating microscope | Zeiss | ||
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
25g needles | Terumo | NN-2525R | |
syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
gauze | sterilize before use | ||
Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |