Qui vi presentiamo un protocollo per la produzione di distale occlusione dell'arteria cerebrale media permanente anziani ratti femmina con occlusione simultanea delle arterie carotidi a generare grandi infarti corticali e deficit sostenuti. Mostriamo conferma della dimensione della lesione utilizzando la risonanza magnetica strutturale a 24 ore e 8 settimane dopo l'ictus.
Ictus si verifica in genere nelle persone anziane con una gamma di comorbidità tra cui carotidea (o altro arteriosa) aterosclerosi, ipertensione, obesità e diabete. Di conseguenza, al momento di valutare le terapie per l'ictus negli animali, è importante scegliere un modello con eccellente validità faccia. rappresenta ictus ischemico per il 80% di tutti gli ictus, e la maggioranza di questi si verificano nel territorio dell'arteria cerebrale media (MCA), spesso inducendo infarti che colpiscono la corteccia sensomotoria, causando plegia persistente o paresi sul lato controlaterale del corpo. Dimostriamo in questo video di un metodo per la produzione di ictus ischemico nei ratti anziani, che causa sostenuta della disabilità sensomotoria e sostanziali infarti corticali. In particolare, induciamo occlusione permanente distale dell'arteria cerebrale media (MCAO) negli anziani femmine di ratto utilizzando una pinza diatermia per occludere un breve segmento di questa arteria. L'arteria carotide sul lato omolaterale alla lesione allora permanently occluso e la carotide controlaterale è stata transitoriamente occluso per 60 min. Misuriamo la dimensione dell'infarto utilizzando la risonanza magnetica pesata in T2 strutturale (MRI) a 24 ore e 8 settimane dopo l'ictus. In questo studio, il volume dell'infarto medio è stato di 4,5% ± 2,0% (deviazione standard) dell'emisfero ipsilaterale a 24 ore (corretto per il rigonfiamento del cervello utilizzando l'equazione di Gerriet, n = 5). Questo modello è fattibile e clinicamente rilevante in quanto consente l'induzione di deficit motorio-sensitivi sostenuti, che è importante per chiarire i meccanismi fisiopatologici e nuovi trattamenti.
L'ictus è attualmente la terza causa più comune di morte nel mondo e la principale causa di disabilità 1. Ictus ischemico, che comprende l'80% di tutti gli ictus, si traduce spesso in infarti nella corteccia causando la perdita della sensazione (per esempio, propriocezione), in funzione motoria e attenzione al lato colpito 2-4. L'arteria cerebrale media (MCA) è il più grande dei vasi che attira alimentazione dal circolo di Willis e nasce dalla carotide interna 5. L'MCA è il vaso cerebrale, più comunemente colpite in ictus ischemico, con colpi in questo territorio che rappresentano il 65% di tutti gli ictus ischemici 6,7. L'MCA fornisce entrambe le regioni corticali e sottocorticali e anomalie neurologiche causate da ictus MCA variano a seconda della posizione esatta del dell'occlusione 7. occlusioni prossimale MCA interessano il territorio in profondità attraverso le arterie lenticulostriatal e causano grandi infarti che comprende sia CortiCAL e le regioni subcorticali. Al contrario, occlusioni più distali che privano regioni corticali esclusivamente del flusso sanguigno tendono a produrre piccoli infarti corticali.
In grandi studi di popolazione, lesioni ictus umani vanno dal 5-14% dei dell'emisfero ipsilaterale 8,9; rappresenta ictus maligno per il 10% degli ictus e dà luogo a infarti più grandi, che richiedono un hemicraniectomy per ridurre la pressione intracranica, e pazienti con lesioni più piccole hanno maggiori probabilità di sopravvivere 10. Dimostriamo un modello riproducibile che produce lesioni che occupano una percentuale simile dell'emisfero altrettanti colpi umani.
L'ictus è una malattia eterogenea; 75% degli ictus ischemici sono indotti da una infarti lacunari (da ostruzione dei piccoli vasi intracranici); ictus cardioembolico; o grande aterosclerosi delle arterie, che rappresenta il 30% degli ictus. aterosclerosi sintomatica è più frequentemente osservata nel punto comune carteria arotid (CCA) si dirama in arterie carotidi interne ed esterne 11.
modelli pre-clinici di ictus dovrebbe essere il più simile alla condizione umana come possibile simulare la sua fisiopatologia e dovrebbe incorporare i fattori di rischio di ictus. 92% di ictus ischemico si verifica in persone di età superiore ai 65 anni, e di altri fattori di rischio sono l'obesità, l'ipertensione, l'aterosclerosi e, come discusso in precedenza 12. Per rappresentare meglio questi fattori di rischio, si consiglia di utilizzare un modello che può condividere alcune delle caratteristiche fisiopatologiche della condizione naturale. In questo protocollo, abbiamo incluso l'età avanzata e il flusso sanguigno ostruito attraverso le arterie carotidi.
Il modello classico di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è il modello filamento intraluminale di prossimale occlusione MCA, che riduce il flusso di sangue nel anteriore e arterie cerebrali medie. tempi brevi di occlusione che utilizzano questo modello si concentra lEsion alla regione sottocorticale, mentre i tempi di occlusione più lunghi possono causare grandi lesioni reclutamento di aree di entrambe le aree corticali e sottocorticali, risultando in un tasso di mortalità più elevato nei ratti anziani. In confronto, il modello utilizzato dal nostro gruppo comprende l'esecuzione di una craniotomia e l'apertura della dura seguita da coagulazione del sangue e la distruzione di una piccola porzione del MCA mediante pinza cauterizzatori bipolari. Questo modello diatermia è adattato dalla carta 1981 con Tamura et al. 23 e l'uso del craniectomy può limitare aumento della pressione endocranica, che è una caratteristica del cranio chiuso, e si traduce in maggiore riproducibilità e un tasso di mortalità più basso nella nostra coorte chirurgia rispetto ad alcuni altri modelli 13. Per generare infarti riproducibili e sostenuta della disabilità che in modo permanente occludere il prossimale CCA e transitoriamente occludere il distale CCA come da Chen et al. 14 Usiamo la risonanza magnetica pesata in T2 non invasivo (MRI) Per valutare l'entità e la posizione di infarto cerebrale, e il grado di edema cerebrale nella corteccia sensomotoria.
MCAO nei roditori è una tecnica spesso usata per modellare ictus umana. Questo modello dispone di un paio di dettagli da notare nel protocollo. In primo luogo, è essenziale per mantenere la temperatura corporea degli animali durante l'esperimento come questo influenza le dimensioni dell'infarto e il numero di mortalità in uno studio. Può essere possibile interrompere isoflurano durante l'occlusione transitoria del diritto CCA e mantenere ratti in un ambiente silenzioso riscaldato per aumentare la sopravvivenza riducendo l'esposizione a isoflurano. I ricercatori dovrebbero considerare se un periodo più breve anestesia supera lo stress dell'induzione supplementare. Il sistema vascolare (ad esempio, MCA ramificazione) dei ratti varia all'interno e tra coorti di animali 22. E 'importante tenere a mente quando si inizia un nuovo studio. Tempi diversi occlusione CCA possono essere valutati (per esempio, 30, 45, 60 e 90 min). In questo studio è utilizzato un tempo di occlusione di 60 min. In altri studi abbiamo trovato che il 45min occlusioni provocano una dimensione dell'infarto corticale simile ma con prove aneddotiche di tassi di sopravvivenza migliori. Di conseguenza, hanno i chirurghi iniziano con un breve tempo di occlusione (ad esempio, 30 minuti) per vedere se adeguati volumi di lesione (e / o deficit comportamentali richiesti) si ottengono e solo allora di aumentare i tempi di occlusione, se necessario. i deficit comportamentali non sono sostenuti in ratti adulti rispetto ai ratti anziani con occlusione volte identici.
MRI può essere utilizzata per giudicare se (dopo un determinato tempo di occlusione) volumi lesioni sono appropriate per gli obiettivi di studio. Una piccola lesione sarebbe estendersi meno di dieci 0,5 mm fette coronali (su 40). Una dimensione della lesione medio sarebbe estendersi tra dieci e venti fette coronali. Una grande lesione sarebbe estendersi tra i venti ei trenta fette coronali. Una grande lesione sarebbe estendersi più di trenta dei quaranta fette. Nella nostra esperienza, i ratti con lesioni molto grandi (più di trenta fette) e / o prova di Acros ernias la linea mediana di solito hanno prognosi infausta: i tempi di occlusione più brevi potrebbero essere presi in considerazione. RM è anche utile per valutare la localizzazione dell'infarto: alcuni sono più caudalmente trovano e alcuni sono più rostralmente trovano.
Prestare particolare attenzione quando separa il nervo vago da entrambe le arterie carotidi comuni. Rales (raspatura) può verificarsi dopo l'intervento chirurgico ictus e questo potrebbe essere causa di danni ai nervi in alcuni animali, anche se la causa è attualmente poco chiaro: nella nostra esperienza, la prognosi è molto povera per questi animali e di solito è consigliato per ucciderli umanamente.
Le permanenti diatermia MCAO risultati del modello di infarti corticali riproducibili e tassi di sopravvivenza post-operatorie accettabili nei ratti anziani. La tecnica, tuttavia, richiedono un intervento chirurgico invasivo sotto uno stereomicroscopio. E 'importante mantenere una tecnica asettica, se gli animali sono a recuperare bene da un intervento chirurgico. Bisogna fare attenzione a non danneggiare la MCA, esponendo e coagulare l'arteria,e danni alla superficie corticale deve essere minimizzata altrimenti l'area esposta della corteccia può formare parte della zona infartuata. Si raccomanda di ottenere quanta più esperienza possibile stabilire la procedura e di raggiungere infarti coerenti e determinare i tempi di occlusione prima di uno studio viene eseguita per testare terapie candidati, per esempio. Gli sperimentatori dovrebbero mischiare le eventuali trattamenti all'interno di sessioni di chirurgia ( "blocco randomizzazione"), ove possibile. Vale la pena notare che questo modello non comporta MCA riperfusione (a meno transitoria MCA legatura si utilizza invece la diatermia). La mortalità può essere alto nei ratti anziani con queste grandi infarti corticali ma dovrebbe essere possibile ridurre la mortalità usando tempi più brevi occlusione e minimizzando l'esposizione alla anestesia generale ove possibile (ad esempio, durante l'occlusione). L'uso di 70% N 2 O ed il 30% O 2 come un vettore può consentire livelli inferiori di isoflurano da utilizzare: questa esposizione ridotta a isofluRane può provocare tassi di sopravvivenza più elevati.
Un altro punto da considerare è che l'aterosclerosi è un processo graduale, che, in questo protocollo abbiamo simulare con occlusione acuta CCA. Tuttavia, la sostanziale riduzione del flusso di sangue e deficit sostenuti simulare occlusioni tandem che si verificano in molti pazienti con ictus. Permanente distale MCAO senza tandem CCA occlusione nei ratti non riesce a indurre colpi riproducibile 14: Inoltre, senza tandem CCA occlusione, abbiamo trovato un notevole recupero spontaneo si verifica che preclude la valutazione del comportamento a lungo termine delle terapie ictus più di 8 settimane. Al contrario, mostriamo che distale MCAO con tandem CCA occlusione induce deficit a lungo termine nei ratti anziani.
In conclusione, questa procedura nei ratti provoca colpi che sono simili per dimensioni e posizione a quelli visti nella condizione umana, con disabilità sostenuta che si può usare per consentire la sperimentazione di nuovi trattamenti e delucidazione dei remeccanismi di coppia dopo ictus ischemico.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. I Mhairi Macrae and Dr. Debbie Dewar, University of Glasgow, who kindly hosted CW and DD for training in this procedure. The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM. This work was also supported by a “Serendipity Grant” from The Dunhill Medical Trust to LM [grant number: SA21/0512].
Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Isoflurane | Abbott | B506 | |
Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
Cautery system | Eschmann | ||
0.25 mm Jeweler caurtery forceps | Eschmann | 8330349 | |
fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Thumb driven saline drip system | |||
Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
16 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
Vascular clip and applicator | |||
Operating microscope | Zeiss | ||
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
25g needles | Terumo | NN-2525R | |
syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
gauze | sterilize before use | ||
Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |