Her presenterer vi en protokoll for å produsere permanent distal midten cerebral arterie okklusjon hos eldre hunnrotter med samtidig okklusjon av halspulsårene å generere store kortikale infarkter og vedvarende underskudd. Vi viser bekreftelse av lesjon størrelse ved hjelp av strukturelle MR på 24 timer og 8 uker etter hjerneslag.
Stroke vanligvis forekommer hos eldre mennesker med en rekke samtidige sykdommer, inkludert carotis (eller annen arteriell) aterosklerose, høyt blodtrykk, fedme og diabetes. Følgelig, ved vurdering av terapi for slag hos dyr, er det viktig å velge en modell med utmerket ansikt gyldighet. Iskemisk hjerneslag står for 80% av alle slag, og de fleste av disse forekommer i territoriet til midten cerebral arterie (MCA), ofte indusere infarkter som påvirker sensorimotor cortex, forårsaker vedvarende plegia eller pareser på motsatt side av kroppen. Vi viser i dette video en fremgangsmåte for fremstilling av iskemisk slag hos eldre rotter, noe som fører til vedvarende sensorimotoriske uførhet og betydelige kortikale infarkter. Nærmere bestemt, induserer vi permanent distale tilstopping av midtre cerebralarterie (MCAO) i eldre hunnrotter ved hjelp av diatermirelatert tang for å okkludere et kort segment av denne arterie. Halspulsåren på den ipsilaterale side til lesjonen ble deretter permanently okkludert og den kontralaterale halsarterie ble okkludert transient i 60 min. Vi måler infarktstørrelsen ved hjelp av strukturelle T2-vektet magnetisk resonans imaging (MRI) på 24 timer og 8 uker etter hjerneslag. I denne studien var det midlere infarktvolum var 4,5% ± 2,0% (standardavvik) av den ipsilaterale hemisfæren ved 24 timer (korrigert for hjerne hevelse ved hjelp Gerriet likning, n = 5). Denne modellen er mulig og klinisk relevant da den tillater induksjon av vedvarende sensorimotor underskudd, noe som er viktig for klarlegging av patofysiologiske mekanismer og nye behandlinger.
Hjerneslag er i dag den tredje vanligste dødsårsaken i verden og den ledende årsaken til uførhet 1. Iskemisk hjerneslag, som består av 80% av alle slag, ofte resulterer i infarkter i cortex forårsake tap i sensasjon (f.eks propriosepsjon), i motorisk funksjon og oppmerksomhet til den berørte side 2-4. Den midterste cerebral arterie (MCA) er den største av fartøyene som trekker forsyning fra sirkelen av Willis og stammer fra den interne carotisar 5. MCA er cerebral fartøyet mest berørt i iskemisk slag, med slag i dette området står for 65% av alle iskemisk slag 6,7. MCA leverer både kortikale og subkortikale regioner og nevrologiske abnormiteter forårsaket av MCA hjerneslag varierer avhengig av den nøyaktige plasseringen av okklusjon 7. Proksimale MCA okklusjoner påvirke dypt territorium gjennom lenticulostriatal arteriene og forårsake store infarkter omfatter både Cortical og subkortikale regioner. I kontrast, mer distale okklusjoner som fratar utelukkende kortikale regioner av blodstrøm tendens til å produsere mindre kortikale infarkter.
I store befolkningsstudier, menneske hjerneslag lesjoner varierer fra 5-14% av den ipsilaterale halvkule 8,9; ondartet slag står for 10% av slag og gir opphav til større infarkter, som krever en hemicraniectomy å redusere intrakranielt trykk, og pasienter med mindre skader er mer sannsynlig å overleve 10. Vi viser en reproduserbar modell som produserer lesjoner som opptar en tilsvarende andel av halvkulen som mange menneskelige slag.
Hjerneslag er en heterogen sykdom; 75% av iskemisk slag blir indusert av enten lakunære infarkter (fra obstruksjon av intrakranielle små fartøy); kardioembolisk slag; eller stor arterie aterosklerose, som står for 30% av slag. Symptomatisk aterosklerose er mest hyppig observert ved det punkt hvor den felles carotid arterie (CCA) grener i de interne og eksterne carotis 11.
Prekliniske modeller av hjerneslag bør være så lik den menneskelige tilstand som mulig for å simulere sin patofysiologi og bør innarbeide risikofaktorer for hjerneslag. 92% av iskemisk hjerneslag oppstår hos personer over 65 år, og andre risikofaktorer er overvekt, høyt blodtrykk, og aterosklerose, som tidligere omtalt 12. For bedre å representere disse risikofaktorene, er det anbefalt å bruke en modell som kan dele noen av de patofysiologiske trekk ved den naturlige tilstanden. I denne protokollen, har vi inkludert høy alder og hindret blodstrømmen gjennom carotis.
Den klassiske modellen av midten cerebral arterie okklusjon (MCAO) er intraluminal filament modell av proksimale MCA okklusjon, som reduserer blodgjennomstrømningen i fremre og midtre cerebrale arterier. Korte okklusjon ganger med denne modellen fokuserer lesion til subkortikale region, mens lengre okklusjon ganger kan føre til store skader rekruttere områder av både kortikale og subkortikale områder, noe som resulterer i en høyere dødelighet hos eldre rotter. Til sammenligning, innebærer den modellen som brukes ved vår gruppe utfører en kraniotomi og åpning av dura, etterfulgt av koagulering av blod og ødeleggelse av en liten del av MCA ved hjelp av bipolare cauterizing tang. Dette diatermi modellen er tilpasset fra 1981 artikkel av Tamura et al. 23 og bruk av craniectomy kan begrense forhøyet intrakranielt trykk, som er en funksjon av den lukkede hodeskallen, og resulterer i høyere reproduserbarhet og lavere dødelighet i våre kirurgi kohort sammenlignet med noen andre modeller 13. For å generere reproduserbare infarkter og vedvarende uførhet vi tilstoppe permanent proksimale CCA og forbigående tilstoppe distale CCA som per Chen et al. 14 Vi bruker non-invasiv T2-vektet magnetisk resonans imaging (MRI) For å evaluere graden og plassering av cerebralt infarkt, og graden av hjerne svelling i sensorisk-cortex.
MCAO hos gnagere er en teknikk som ofte brukes til å modellere human slag. Denne modellen har et par detaljer å merke seg i protokollen. For det første er det viktig å opprettholde dyrets kroppstemperatur gjennom hele forsøket, da dette påvirker størrelsen av infarktet og antall død fisk i en studie. Det kan være mulig å avbryte isofluran under den transiente okklusjon av den høyre CCA og holde rotter i en oppvarmet, rolig miljø for å øke overlevelsesraten ved å redusere eksponering for isofluran. Forskere bør vurdere om en kortere anestesi periode oppveier stresset av ytterligere induksjon. Blodkar (f.eks MCA forgrening) av rottene varierer innen og mellom årskull av dyr 22. Det er viktig å ha dette i bakhodet når du starter en ny studie. Ulike CCA okklusjon ganger kan evalueres (f.eks, 30, 45, 60 og 90 min). I denne studien blir brukt en okklusjon tid på 60 min. I andre studier har man funnet at 45min okklusjoner føre til en lignende størrelse kortikale infarkt, men med anekdotiske bevis for økt overlevelse. Følgelig har kirurger starter med en kort tid okklusjon (for eksempel, 30 min) for å se hvorvidt tilstrekkelige lesjon volumer (og / eller nødvendige adferdsmessige mangler) oppnås, og bare da å øke okklusjon tider hvor det er nødvendig. Atferds underskudd er ikke vedvarende hos voksne rotter sammenlignet med eldre rotter med identiske okklusjon ganger.
MR kan brukes til å bedømme om (etter en bestemt okklusjon tid) lesjon volumer som er aktuelle for studien mål. En liten lesjon ville span mindre enn ti 0,5 mm koronale skiver (av 40). En middels størrelse lesjon ville strekke seg mellom ti og tjue koronale skiver. En stor lesjon ville strekke seg mellom tjue og tretti koronale skiver. En svært stor lesjon ville strekke seg mer enn tretti av de førti skiver. I vår erfaring, rotter med svært store lesjoner (mer enn tretti stykker) og / eller bevis for prolaps across midtlinjen har vanligvis dårlig prognose: kortere okklusjon tider kan bli vurdert. MR er også nyttig for å vurdere lokalisering av infarktet: noen er mer caudally plassert og noen er mer rostrally plassert.
Vær ekstra forsiktig når du skiller vagus nerve fra både vanlige carotis. Rales (rasping) kan oppstå etter hjerneslag kirurgi, og dette kan være på grunn av nerveskader hos noen dyr, selv om årsaken er foreløpig uklart: i vår erfaring, er prognosen svært dårlig for disse dyrene, og det er vanligvis anbefalt å humant drepe dem.
De permanente diatermi MCAO modellresultater i reproduserbare kortikale infarkter og akseptable postoperative overlevelse hos eldre rotter. Teknikken gjør imidlertid kreve invasiv kirurgi under et stereomikroskop. Det er viktig å opprettholde aseptisk teknikk hvis dyrene er å komme godt fra kirurgi. Hensyn må tas for ikke å skade MCA mens utsette og koagulere arterien,og skader på kortikale overflate bør minimaliseres ellers eksponerte areal av cortex kan utgjøre en del av infarktområdet. Det anbefales å oppnå så mye erfaring som mulig å etablere fremgangsmåten og for å oppnå konsistente infarkter og bestemme okklusjon ganger før en studie er utført for å teste kandidatbehandlingsformer, for eksempel. Forskere bør random noen behandlinger innenfor kirurgi økter ( "block randomisering") der det er mulig. Det er verdt å merke seg at denne modellen ikke innebærer MCA reperfusjon (med mindre forbigående MCA ligering anvendes i stedet for diatermi). Dødelighet kan være høy i eldre rotter med disse store kortikale infarkter, men det bør være mulig å redusere dødeligheten ved hjelp av kortere okklusjon ganger, og ved å minimere eksponering for generell anestesi der det er mulig (for eksempel i løpet av okklusjon). Bruken av 70% N 2 O og 30% O 2 som en bærer kan tillate lavere nivåer av isofluran som skal brukes: denne reduserte eksponering for isoflurane kan resultere i høyere overlevelse.
Et annet punkt å vurdere er at aterosklerose er en gradvis prosess, mens i denne protokollen vi simulere den med akutt CCA okklusjon. Den betydelige reduksjonen i blodstrømmen og vedvarende underskudd simulere tandem okklusjoner som forekommer i mange slagpasienter. Permanent distal MCAO uten tandem CCA okklusjon hos rotter ikke klarer å indusere slag reproduserbart 14: dessuten uten tandem CCA okklusjon, har vi funnet betydelig spontan bedring oppstår som utelukker langsiktig atferds evaluering av hjerneslag behandlinger over 8 uker. I kontrast, viser vi at distal MCAO med tandem CCA okklusjon induserer langsiktige underskudd hos eldre rotter.
Som konklusjon, denne prosedyren hos rotter forårsaker slag som er like i størrelse og plassering som hos den menneskelige tilstand, med vedvarende funksjonshemming som man kan bruke for å muliggjøre testing av nye behandlinger og belysning av repair mekanismer etter iskemisk hjerneslag.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Prof. I Mhairi Macrae and Dr. Debbie Dewar, University of Glasgow, who kindly hosted CW and DD for training in this procedure. The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Programme (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 to LM. This work was also supported by a “Serendipity Grant” from The Dunhill Medical Trust to LM [grant number: SA21/0512].
Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Isoflurane | Abbott | B506 | |
Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
Cautery system | Eschmann | ||
0.25 mm Jeweler caurtery forceps | Eschmann | 8330349 | |
fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Thumb driven saline drip system | |||
Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
16 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
Vascular clip and applicator | |||
Operating microscope | Zeiss | ||
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
25g needles | Terumo | NN-2525R | |
syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
gauze | sterilize before use | ||
Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |