Introduction
Etterforskerne har brukt en rekke dyremodeller for å studere normal funksjon av hørselssystemet samt patofysiologien av hørselstap. Disse modellene er også svært nyttig for å gjennomføre intervensjonsstudier mot ulike patologiske prosesser og tjene som grunnlag for translasjonsforskning applikasjoner i mennesker. For de fleste forskning som involverer sneglehuset og de tilhørende hørselsbanene, må en viss grad av skade eller avbrudd innføres i systemet. Ofte er skaden hensikt som mål å skape en bestemt lesjon, slik at forskere for å studere effekten av at lesjon på normal funksjon, så vel som cochlea evne til å gjenopprette fra den. Ved valg av en spesiell dyremodell og / eller teknikk (er) for innføring av skade, må betraktes som en rekke faktorer for å oppnå best mulige resultater. Ulike dyremodeller kan reagere forskjellig på tiltak, mens de direkte og indirekte effekter av en teknikk kan værehelt skadelige for det ønskede resultatet. I de fleste tilfeller vil den ideelle indre øret skade protokollen unngå systemisk toksisitet, raskt og sikkert gi skader, skape et presist og konsistent lesjon, og være overlevings til å se nøyere på funksjonelle, cellulære og molekylære endringer. Ideelt sett ville disse metodene også bevare den delikate mikroarkitektur og elektrokjemiske gradienter av sneglehuset i størst mulig grad.
Hittil har etterforskerne klart å etablere en rekke teknikker for å indusere indre øret skade. De fleste av disse innebære å utsette sneglehuset til en ototoxic middel enten systemisk eller via kirurgiske tilnærming. Teknikker inkluderer parenteral injeksjon, intra-peritoneal injeksjon, trans-tromme injeksjon, endolymfatiske sac injeksjon, og cochleostomy med perilymphatic perfusjon. Disse teknikker har vært brukt for å introdusere et utvalg av ototoksiske midler, så som furosemid, gentamicin, ouabain, og heptanol. 1-5Mens vellykket i å skape bestemte cochlea lesjoner, de ovennevnte teknikker også har erkjent begrensninger. Systemiske injeksjoner kan være svært giftig for dyr og kan være forbundet med utilsiktede cochlea fornærmelser og inkonsistente resultater. Den sistnevnte ulempe har også vært forbundet med trans-tromme injeksjoner. Teknikker som cochleostomy og perilymphatic perfusjon, mens evnen til å indusere hurtig og svært pålitelige lesjoner, er direkte invasiv til det indre øret struktur og funksjon. Mange av de kirurgiske tilnærminger er også forbundet med en høy grad av tekniske problemer, og kan kreve å forlate fremmedlegemer i dyret, for eksempel en mikropumpe infuser. 2-4,6-8 Ingen enkel teknikk er fri for svakheter, og etterforskerne må velge metoder nøye for å passe deres eksperimentelle behov. Her beskriver vi, i detalj, er det runde vindu nisje (RWN) påføringsteknikk for topisk levering av ototoksiske midler i voksne mus.
First beskrevet av Husmann et al i 1998, mens han studerte gentamicin effekt på sensoriske hårcelle degenerasjon i en avian modell, ble denne teknikken funnet å være i stand til å produsere betydelig mer pålitelige lesjoner enn systemisk gentamicin søknad, og samtidig unngå assosierte toksisitet. 9 Siden da en rekke andre forskere, inkludert vårt laboratorium, har brukt denne teknikken til stor suksess. I 2004 Heydt et al. tilpasset den til en musemodell og beskrevet en forbedret evne til å kontrollere lesjon størrelse ved å fylle RWN med absorberbare gelatin svamp dyppet i varierende konsentrasjoner av gentamicin. 10 Palmgren et al., i 2010, studerte ototoxic effekten av beta-Bungarotoxin, en potent element i giften fra Taiwan bundet kasse, ved å anvende en vandig form for det til RWN av voksne rotter. 11 I tillegg er en rekke tidligere undersøkelser fra vårt laboratorium anvendes det runde vindu tilnærming for å studere effektene av furosemid ototoxice, ouabain, og heptanol. 5,6,12-15 Resultatene fra disse studiene har vist betydningen av cochlea væske og ion homeostase på normal hørsel, oppdaget celleproliferativ evne i spiral ganglion og cochlea sidevegg, og fremmet vår forståelse av aldersrelatert hørselstap.
Følgende tilnærming innebærer kirurgisk tilgang til mellomøret via en postauricular snitt og delvis unroofing av benete tromme bulla. Dette gir god eksponering av RWN og membranen til hvilken et utvalgt ototoxic middel kan påføres direkte. Den flytende middel da bassenger i koppen-lignende hul av RWN (eller langsomt drenerer fra en mettet absorberbare gelatin svamp carrier pakket inn i RWN) og diffunderer gjennom det runde vinduet membranen inn i perilymphatic plass i cochlea vestibylen. Ingen direkte cochleostomy er gjort i denne tilnærmingen. Fordelene ved denne teknikken omfatter bevaring av det indre øret mikroarkitektur, unngåelseav systemisk toksisitet, innrømmelse av en intra-dyr kontroll øret, hurtig innsettende effekt, selektiv degenerasjon i visse cochlea celletyper (f.eks., type I spiral ganglion nevroner med ouabain eksponering og cochlea type II fibrocytt indusert ved behandling av heptanol), og reproduserbare / pålitelige resultater. Denne teknikk kan anvendes med noen få endringer mellom andre gnagerarter, deriblant rotter, marsvin, ørkenrotte og. Ulempene inkluderer en bratt teknisk læringskurve og den relative begrensning av ototoxic fornærmelse som er begrenset til et enkelt punkt i tid.
Protocol
Alle aspekter av dyreforsøk ble gjennomført i samsvar med retningslinjene i det aktuelle Institutional Animal Care og bruk komité. Alle virveldyr dyr eksperimentelle prosedyrer beskrevet her ble godkjent etter retningslinjene for Medical University of South Carolina (MUSC) Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Modell Selection
- Opprettholde dyremodell i et lavt støynivå vivarium med rutine caretaking per institusjonelle protokoller til alt er klart til bruk. I dyreforsøk anlegg (ARF), opprettholde stabilitet vibrasjon, støy demping, dagaktive belysning, prep plass, overflatebehandlinger, tetting og drivning, og ventilasjon som oppfyller NIH standarder.
Merk: National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for ARF og vedlikehold av et lavt støynivå vivarium kan bli vurdert på: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ - For alle eksperimenter, bruk høyre øre som den eksperimentelle øret. Venstre øre tjener som en intra-dyr kontroll og er ikke kirurgisk endret.
- Inspisere modellen animalske pre-operativt etter tegn på midten eller ytre ørebetennelse. Potensielle tegn kan inkludere drenering av væske eller puss fra øret, betent pinna vev, og / eller letargi av dyret. Dette er uvanlig, men hvis bemerkes unngå ytterligere kirurgi og behandler dyret på riktig måte.
2. preoperative prosedyrer
- Bedøve dyret 30 minutter før operasjonen, og eventuelle perioperative prosedyrer via intra-peritoneal (IP) injeksjon av ketamin (100 mg / kg IP) og xylazin (20 mg / kg IP). Supplement anestesi som er nødvendig, som bedømt ved en positiv klemme tå-refleks, med en lavere dose av ketamin (25 mg / kg IP) og xylazin (5 mg / kg IP). Bestem dosering i samsvar med institusjonelt tillatt protokoller for mus med alders nødvendige justeringer i dose.
- Sjekk for fullt sedation av modellen. Se etter en scene tre fly av anestesi for helheten av den beskrevne protokollen preget av en vanlig pustefrekvens, som en mangel på rettende refleks (hos mus), og mangel på pedal og palpebral (toe-pinch) reflekser. Opprettholde dyret på dette nivået av anestesi. Dette er av vesentlig betydning for minimering av intraoperativ smerte og bevegelse, blødning, og lekkasje av interstitielle fluider under operasjonen.
- Opprettholde dyrets kroppstemperatur ved 37,5 ° C med et lukket varmeputen.
- Administrere analgesi via subkutan injeksjon av buprenorfin. Lever buprenorfin (0,1 mg / kg SQ gang 30 min før kirurgi) som smertelindring for å minimere alle kirurgiske ubehag. Base dosering og alternativer som passer til den valgte modellen på institusjonelt godkjente protokoller. Antibiotika bruk er ikke nødvendig hvis god aseptisk teknikk har vært praktisert. Dyrene får postoperativ analgesi hvis det er tegn til smerte og ubehag.
- Utfør physiologic tester preoperativt. Utføre auditive hjernestammen respons (ABR) testing og / eller forvrengning produkt optoacoustic utslipp testing (DPOAE) både pre-operativt og like før ofre av dyret fungerer som en objektiv måling for effekten av den valgte ototoxic agent på musen hørsel.
3. Kirurgisk Forberedelse og posisjonering
- Sterilisere alle instrumenter pre-operativt per institusjonelle standarder. Forbered kirurgiske instrumenter og felt i en konsekvent, steril, og organisert måte for å unngå unødvendige krefter og bevegelse under prosedyren. Typiske instrumenter kreves inkluderer skarpe dissecting saks, flere par av metalliske pinsett med gullsmed tips, en otologic pick, en otologic kyrette, og et bipolart elektro enhet (figur 1).
- Forberede og sterilisere papir veker laget av labwipes på forhånd ved å skjære et lite trekantet bit av tørke (~ 0,7 x 1,25 x 1.75 i) og vri det tett mellom tommelen og pekefingeren på den ene hånden (~ 1,25 in). Opprettelse av en tett vridd, ekstremt tynn veke er avgjørende for å lykkes i prosedyren. Forbered totalt 15-20 veker før kirurgi (figur 2).
- Bruk en dental drill for raskt å perforere benet av tromme bulla på en kontrollert måte. Anvendelse av et beltedrevet tannlegehånddrill med en 1 eller 2 mm avsmalnet spiss er å foretrekke. En operativ mikroskop er nødvendig for å fullføre protokollen. (se trinn 4.7)
- Pre-tegne 0,2 ml av en vandig oppløsning inneholdende den valgte ototoxic middel i en 1 ml tuberkulinsprøyte med en 28 G, 1/2 "nål. Typisk en dråpe (~ 10 mL) av midlet er tilstrekkelig til fullstendig å fylle mus RWN. En metallisk, letter butt tupp kanylen for levering av midlet mens hindre skade på underliggende strukturer ved en skarp spiss skråkant. Fjern all luft i sprøyten som bobler kan utilsiktet fylle RWN og / eller som kan hindrepåføring av midlet til det runde vindu i seg selv.
- Fjern pels fra etter auricular huden ved hjelp av elektriske grooming clippers. Fjern pels i en sone som strekker seg fra auriculo-cephalic krøll rostrally til skulderen belte caudally. Utvid hårfjerning fra dorsal, sagittal midtlinjen til kjevevinkelen sidelengs. Riktig pels fjerning er viktig å opprettholde et rent og klart kirurgisk felt. Forsiktig børste utklipp fra den tiltenkte operasjonsstedet.
- Sterilisere hud forberedt areal per institusjonelle protokoller. Påfør Betadine (povidon / jod) alterneres med etanol topisk i en sirkulær måte i 2 min. Andre agenter kan erstattes per institusjonelle retningslinjer.
- Plasser dyret på et flatt underlag for å opprettholde konstant kropps posisjonering under prosedyren. Bruk en liten varmepute plassert under kroppen på plattformen for å kontrollere kroppstemperaturen under prosedyren for å opprettholde dyrets kroppstemperaturen på 36-38 ° C. Ikke overheat dyret da dette kan føre til mild til alvorlig hudskade og / eller tidlig aktiv dødshjelp.
- Fest hodet på dyret via et bitt blokk / hodeholderen apparat. Utnytte en 0,5 cm x 2 cm bit blokk maskinert av messing med en diameter på 2-4 mm hull boret gjennom det på 5 mm intervaller langs den lange akse. Åpne dyrets munn rundt denne lampen og passer de øvre sentrale fortenner i ett av hullene, avhengig av dyrets størrelse. Stram forsiktig en liten klemme over ryggen av dyrets snute å holde den på plass (figur 3).
- Bekrefte at bittblokken / hode holderen er fast forbundet med midten av en U-formet bevegelig arm (figur 3). Sikre en 1 cm bred stang til venstre arm av "U" og bruke stang som en venstre-side hodestøtten (høyre side er alltid den operative side).
- Når godt sikret i hodet holder, roter musen til en venstre lateral decubitus posisjon. Plasser kroppen carefully på den flate overflaten drifts å sikre at det vil være stabil gjennom hele prosedyren og unngå unødig torsjonsspenning på halsvirvler.
- Plasser et operasjonsmikroskop stand til 4x, 10x, og 20x forstørrelse over kirurgiske feltet. Bekreft at mikroskopet kan opprettholde sin posisjon i en håndfri måte som dette er ideelt for to-hånds kirurgisk protokollen omtalt nedenfor.
- Plasser en bipolar-aktivert kirurgienhet med fin tippet gullsmed hånd brikke i en posisjon som er umiddelbart tilgjengelig for bistand i kauterisering av små fartøy og disseksjon av vev. Dette kan også være nødvendig bør kraftigere blødning oppstå.
4. Kirurgisk Approach
- Under mikroskopisk forstørrelse, bruke skarp saks eller en skalpell blad for å lage en 1-1,5 cm postauricular snitt, ca 6-8 mm kaudal til auriculocephalic press. I den voksne mus, et snitt fra rygglinjensideveis til et punkt nær vinkelen for kjeven er tilstrekkelig. Unngå nøye kutte dypt for å bevare underliggende vaskulære strukturer.
- Gjennomføre forsiktig stump disseksjon gjennom det subkutane fettlaget, som kan være av varierende tykkelse. Fett kan trygt fjernes hvis det er nødvendig for å bedre eksponering. Vær forsiktig når dissekere i en ventral-medial retning som ytre halsvenen traverserer dette området og skade på denne strukturen kan føre til store mengder blodtap og flom av operasjonsområdet. Kontrollere alle overdreven blødning med absorberbare gelatin svamper og / eller bomull pellets. Bruk bipolar kirurgi for tyngre blødning.
- Når fettlaget er riktig fordelt, utsett cervikal muskulatur. Legg merke til viktige strukturer, inkludert de store muskel kroppen av cleidomastoideus sentralt innenfor den eksponerte operasjonsfeltet, den ytre halsvenen ventralt, og parotisvev rostrally liggende vinkel på kjeven. En viktig landemerke er en liten nerve branch (av hjernenerve XI) som brytes rundt bakre / rygg kanten av cleidomastoideus å forlenge rostrally mot pinna (figur 4).
- Forsiktig trekke tilbake cleidomastoideus muskel kroppen i en posterior / dorsal retning (figur 4, 5). Forsiktig dele gjennomsiktig fascia omslutter muskel kroppen. På lignende måte, forsiktig trekke parotid og ytre halsvene i den motsatte (anterior / ventral) retning (figur 5).
- Med god tilbaketrekking av cleidomastoideus muskel kroppen, vil den blanke kuppelen av tromme bulla periosteum kommer til syne (figur 6). Ved hale aspekt av bulla, innsetting av en dypere cervical muskelen, sternomastoideus, vil komme til syne (figur 6). Bevar ansikts nerve, som blir synlig på rygg- og rostralt aspekt av bulla kuppel. Plasser en selv beholde retractor (Steril titan shaft-- forankret i disponibel silikonlim) før boring.
- Med tohåndsteknikk, forsiktig dele bulla periosteum med bipolar diatermi å avdekke underliggende bein. Bruk pinsett eller en otologic kyrette, forsiktig heve og skyve periosteum i en perifer retning til allment eksponere bulla kuppel.
Merk: Trinn 4.6 er kritisk for å maksimere kirurgisk riss av mellomøret plass. Utnytte nøyaktig og skånsom håndtering av mykt vev for å unngå blødning og / eller lekkasje av interstitiell fluid inn i hulrommet bulla etter boring. - Ved et riktig eksponert bulla kuppel, bore et 2 mm pilothull gjennom Bulla bein med en dental kirurgisk drill mellom hale margin av kuppelen og synlig ugjennomsiktig linje (som representerer trommehinnen) som strekker seg over rostralt aspekt av bulla (Figur 7). Vær nøye med å bore bare gjennom bein å bevare underliggende strukturer, slik som stapedial arterien. Bor et andre pilothull i nærheten for å lette un-taktekking av bulla bein (<strong> Figur 7).
- Ved hjelp av et par av gullsmed tips tang, Slipp ut Bulla bein i rygg og kaudal retning (Figur 8). Fjern bein i en stykkevis mote under høyt forstørrelse. Ikke punktere stapedial arterie, som ligger rett under bulla cap, som blødning fra denne arterien kan kompromittere prosedyren. Minimere mengden av bein fjernes for å hindre overdreven væske innreise til mellomøret som samtidig gir god visualisering og tilgang til det runde vinduet nisje (Figur 8).
5. runde vinduet Bruk av Ototoksisk Agent
- Gjøre små rotasjons justeringer i hodet holder å bringe RWN holdent til syne. Den RWN er vanligvis plassert på rygg- og hale aspekt av mellomøret plass og fremstår som en kopplignende innrykk av otisk kapselen benet. I de fleste tilfeller går stapedial arterien 1-2 mm ventralt / rostralt til dette. Den RWN kan noen ganger være tucked perifert under en akutt vinkling i bulla kuppel. I slike tilfeller er forsiktig posisjonering av dyrets hode akutt.
- Bruke papir veker forberedt preoperativt, fjerne all synlig væske i mellomøret og RWN til tørr bein er visualisert.
Merk: Dette er den mest kritiske trinn av hele protokollen, som ~ 10 pl (1 dråpe) av ototoxic middel påføres på RWN kan lett fortynnes ved denne væsken.
- Bruke papir veker forberedt preoperativt, fjerne all synlig væske i mellomøret og RWN til tørr bein er visualisert.
- Under maksimal forstørrelse, bruker du en kaliber nål på en 1 ml tuberkulinsprøyte å bruke en dråpe (~ 10 mL) av ototoxic middel direkte til RWN, fylle den helt. Vær nøye med å ikke forstyrre stapedial arterie og observere nøye for utskifting av en liten lysrefleksjon på bunnen av en tørr nisje med en kjedelig og disig væske menisken som en indikator på at nisje er å fylle på riktig måte.
- La middel til å hvile inne i RWN i ca. 10 min eksponeringstid. Etter dette helt wick ut agenten og erstatte den med en ny søknad på samme agent. Bestem repetisjoner av søknaden i henhold til nestleder spesifikasjoner. Total eksponeringstid i denne fremgangsmåten er typisk i området mellom 30 til 60 min.
- På slutten av prosedyren, helt transportere bort midlet en siste gang og anvende frisk midlet til RWN. La bulla uten lokk og bruke tang for å lukke bløtvevet over operasjonsstedet.
- Forsegl operasjonsstedet på nivået av huden med en 4-0, ikke-absorberbare monofilament-sutur. Plasser dyret i et recovery bur / stasjon. Overvåke dyret kliniske tilstand regelmessig etter operasjonen. Oppretthold dyret i passende miljøforhold, herunder boliger med myke senger og tilskudd med myk mat, for å minimere stress. Bestem fremtidige prosedyrer og post-operative forhold i henhold til de institusjonelle IACUC protokoller.
- Bruk institusjonelle IACUC protokoller for å sterilisere instruments før bruk på neste dyret. Tillat for tilstrekkelig kjøling tid mellom instrument bruk.
6. Postoperative Prosedyrer og Cochlear Tissue Høsting
- Som beskrevet i trinn 2.5, utføre testing fysiologisk hørte postoperativt ved ønskede punkter, og før avlivelse. Utfør Postoperative prosedyrer i henhold til eksperimentelle formål. Ofre dyr på enhver ønsket postoperative dag.
- Ved full anestesi via IP-injeksjon, slik det kreves per institusjonelle IACUC protokoller, ofre dyr. Bruke skarp saks, halshogge dyr bare hale til bakhodet. Kraftig åpne hodeskalle med saks langs rygg og ventral midtlinjen og spredt. Forsiktig øse ut hjernevev å avsløre tidsmessige bein.
Merk: En rekke prosedyrer for undersøkelse av posteksponerings endringer i sneglehuset kan avslaget fra dette punktet og vil bli nevnt i diskusjonen delen. Bestem undersøkende metoden mest relevant til eksperimentelle formål. Hvis elektronmikroskopi er planlagt etter cochlea er seksjonert, bruker hjertekateterisering å forhånds fikse vev. Dette er utenfor rammen av denne diskusjonen og har blitt dekket i dybden andre steder. 13 - Skjær tidsmessige bein ut av skallebasis med saksen og umiddelbart plassert i fiksativ løsning. Dyppe ben direkte i 4% paraformaldehyd i 1,5 timer ved romtemperatur. Overvåk fiksering tid, som lengre varighet kan begrense utfallet av histologisk analyse på senere trinn. Avkalk dissekert bein for en variabel tidsperiode via neddykking i 1 mM Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).
Representative Results
I en fersk undersøkelse utført av Stevens et al utnytte ovenfor protokollen, ble voksen CBA / Caj mus av begge kjønn eksponert via runde vinduet diffusjon til heptanol. 15 Heptanol er et gap junction un-coupler kjent for å produsere målrettet, utvinnbare skade på cellene i cochlea sidevegg. Hensikten med studien var å produsere en pålitelig modell for målrettet cochlea skade, noe som åpner for gransking av post-kirurgisk regenerering av skadede elementer. Pre-kirurgisk og post-kirurgiske høreterskler fungerte som en funksjonell endepunkt. Mikroskopi og immunhistokjemisk farging teknikker ble benyttet for å studere morfologiske forandringer. Betydelige økninger i ABR terskler ble observert i heptanol-behandlede mus (figur 9). Dyr kontroll som fikk narre kirurgi, med levering av saltvann i stedet for heptanol, ikke demonstrere betydelige terskelskift til enhver testet frekvens.
Farging mot en innad hekalium kanal (Kir) 4.1 fungert som en indirekte metode for å visualisere skade / utvinning av cochlea strukturer. Dette viser meget reproduserbare forskjeller mellom behandlings- og kontroll ører. Samlet fargeintensitet ble merkbart redusert i løpet av stria vascularis (STV) og blant fibrocytt i spiralen ligament (SLF) 1-3 dager etter eksponering heptanol, betegner store mengder målrettet skade på disse områdene. Det var en bestemt reduksjon i Kir 4,1 fargeintensitet i de områder av type II og type IV SLFs (figur 10) og STV (figur 11). Bevis på forstyrret atom integritet og kromosom kondens / blebs typisk for cellulær apoptose ble også sett på atom counterstains i disse cochlea områdene (Figur 10). Vacuolated soner av Kir 4,1 farging løst markert på 7 dager og var fraværende helt på 14 dager. Når Kir 4,1 fargeintensitet ble kvantifisert i de områdene av STV, behandlet ører demonstrert en tt ig ngal trau etterfulgt av en betydelig forskyvning (p <0,05) tilbake mot kontroll intensitet 7 dager etter heptanol eksponering (figur 12).
Figur 1. Instrument satt opp. Visning av pre-kirurgisk oppsett av instrumentering. Alt utstyr skal være lett tilgjengelig i sterile kirurgiske feltet. Typisk instrumentering inkluderer 2 skarpe disseksjon saks, til 2-3 rett og / eller buet spiss gullsmed tang med øret Curettes, buet aksel otologic picks (senere erstattet med Rosen plukker - ikke vist), og en elektrokirurgi enhet med fin buet spiss gullsmed tang headpiece. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kirurgiske råmaterialer. Ytterligere forsyninger for å opprettholde den RWN miljøet. Steriliserte labwipe utsparinger for papir veke dannelse (til venstre), veker tett-formet papir laget av steriliserte lab kluter (midten), og 4 mm bomulls pellets (til høyre) blir brukt til å tørke overflødig væske og blod flom i det runde vinduet nisje. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Animal hodet holder. Bildet viser hodet holderen og bite blokk. Hullene i blokken montere og feste den øvre sentrale fortenner. En klemme er svakt strammet over dorsal snute for å feste dyret på plass. Bruk av et hode holder er avgjørende for vellykket kirurgisk outcome. Ideelt sett bør dette være i stand til å rotere om rostrokaudale aksen av dyret for å optimalisere kirurgiske utsikt over bulla under prosedyren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Cleidomastoideus m.. Skjematisk diagram som viser den grunnleggende anatomi av gnager cervikal muskulatur og dens tilknytning til den ytre halsvenen. Den cleidomastoideus muskelen er den mest lett identifiseres muskelen under den kirurgiske metode. Utgivelsen av den omsluttende fascia fulgt av posterior / rygg tilbaketrekking av muskel kroppen vil lede kirurgisk disseksjon mot tromme bulla (sort sirkel). Klikk her for å se alArger versjon av denne figuren.
Figur 5. Kirurgisk eksponering området. Viser eksponering etter disseksjon gjennom kutane og underhudsfett lag. Strukturelle landemerkene i notatet omfatter en gren av hjernenerve XI overliggende cleidomastoideus muskelen (A), den ytre halsvenen (B), og eksponert parotiden vev (C). Den hjernenerve XI gren er ofte forbundet med en liten kar og må deles før du fortsetter. Høyre til venstre på bildet tilsvarer dyrets rostrokaudale aksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Utsette bulla. Eksponering av tromme bulla etter tilbaketrekking av cleidomastoideus og omkringliggende strukturer. Kjente landemerker som cleidomastoideus muskel kroppen (A) reflekteres baktil / dorsally, ansikts nerve (B), og den blanke kuppelen av tromme bulla periosteum (C). Vær også oppmerksom på innsetting av sternomastoideus muskel på venstre hale aspekt av tromme bulla (stjerne). Tilstedeværelsen av ansiktsnerven på dorsal og rostrale del av bulla er en kritisk fjell for sann identifikasjon av bulla. Høyre til venstre på bildet tilsvarer dyrets rostrokaudale aksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Utsette runde vinduet nisje jeg. Bildet viser den tympanic bulla fullt eksponert etter disseksjon av den overliggende periosteum. Pilothull er best plassert halvveis mellom hale kanten av bulla kuppel og en subtil ugjennomsiktig linje visualisert innenfor rostralt aspektet bulla (som representerer trommehinnen). En annen, tilstøtende pilothull kan lette lettere un-taktekking av bulla bein. Unngåelse av dypboring bør tas for ikke å skade den underliggende stapedial arterien. Den mørke, metallgjenstand på bunnen av bildet er det titan bløtvev retractor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Utsette runde vinduet nisje II. Uncapped tromme bulla med eksponering av det runde vinduet nisje (pil) og stapedial arterie (rød struktur1-2 mm lateralt for nisje) som sett under 20x forstørrelse. Nisje ofte legger i en posisjon gjemt under skrå vinkel dannet av bulla kuppel med otic kapsel på hale aspekt av kuppelen. Det er viktig at hele visualisering av nisjen oppnås før påføringen av ototoxic middel eller transporterende. Dreven bein fjerning under uncapping bør også unngås som interstitiell væske / blod tendens til å flom hulrommet når store hull ble opprettet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. Representative resultater -. Heptanol indusert hørselstap og gjenopprettings mener auditive hjernestammen respons (ABR) terskler (dB SPL) plottet som en funksjon av tone piphyppighet. Målinger er gruppert etter pre-eksponering (Black-Control) og postoperativ dag (POD) 1, 7 og 14 (rød). Feilfelt representerer SEM. Figur ble re-plottet fra Stevens et al. 2014. 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10. Representative Resultater - Målrettet cochlea skader etter heptanol eksponering del I. Endringer i Kalium Indre Rectifier (Kir) Kanal 4,1 flekker i stria vascularis (STV) av ørene behandlet med heptanol og kontrollere ører. (A) Normal Kir 4,1 flekker typisk for kontroll ørene med sterk strial celle affinitet for Kir 4.1 (grønn). (B) Behandling øret på POD1. Store vakuolisert soner av redusere påvirkerlettet Kir 4,1 affinitet er sett i STV (Pilspisser) sammen med en generell nedgang i STV Kir 4,1 fargeintensitet. Kjerner er motfarget med propidium jod (red) (B). Scale bar = 15 mikrometer. Figur ble re-plottet fra Stevens et al, 2014. 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11. Representative Resultater - Målrettet cochlea skader etter heptanol eksponering del II Endringer i spiral ligament (SL) av heptanol behandlet øre sammenlignet med kontroll øret.. (A) Normal Kir 4,1 farging (grønt) i SL typisk for kontroll øre med normal vises type II spiralligament fibrocytt (II). (B) Heptanol treated øret med markant nedgang i Kir 4,1 fargeintensitet i området av type II spiral ligament fibrocytt, kjerne avbrudd og kromosom kondens / blebs konsistente med apoptose (piler). Kjerner er motfarget med propidium jod (rød). Scale bar = 15 mikrometer. Figur ble re-plottet fra Stevens et al, 2014. 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12. Representative Resultater -. Gjenoppretting av cochlea fargeintensitet følgende heptanol eksponering Mean relative luminans Kir 4,1 flekker plottet som en funksjon av posteksponerings dag. Relativ luminans beregnes som Kir 4,1 reflekterende intensitet etter konfokalmikroskopi i heptanol godbited ører tatt som en prosentandel av det samme i kontroll ører. Note POD14-28 data er samlet som et enkelt punkt på kurven. Fylte sirkler representerer middelverdier mens Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. En vesentlig bedring av relativ lysstyrke ble demonstrert mellom POD 7 og senere datoer (Student t test p <0,05, stjerne). Figur ble re-plottet fra Stevens et al., 2014. 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen og representative resultatene beskrevet over ble oppnådd i en CBA / Caj musemodell blant begge kjønn. Dette innavlet stamme er godt etablert som en "god hørsel" standard og "normal aldring" -modellen i å høre forskning. 16-23 beskrivelse av bruk av denne protokollen i andre pattedyr modeller er utenfor rammen av denne teksten. Leseren bør merke seg imidlertid at RWN påføringsteknikk gir flere fordeler å studere pattedyr indre øret. Av disse er det mest bemerkelsesverdige at den unngår direkte forstyrrelse av den delikate anatomisk struktur og biokjemiske gradienter som eksisterer innenfor murene til otic kapsel. Prosedyrer som cochleostomy og implantering av infusjonspumper har tilbøyelighet til å direkte krenke indre øret strukturer som fører til permanente terskel skift; et faktum som må tas i betraktning ved analyse av resultatene. Forstyrrelse av cochlea sideveggkonstruksjoner av invasiv methods kan også begrense bruken av ototoksiske midler slik som furosemid eller heptanol, som bestemt sone av effekten er begrenset til det stedet. 15,24 Alternative ikke-invasive metoder som trans-tromme injeksjon og parenteral injeksjon har vært plaget av upålitelige resultater og / eller systemisk toksisitet overfor dyremodell. Denne påføringsmetode har vist seg å unngå begge disse ulemper, å oppnå en grad av konsistens som nærmer seg de mer invasive metodene diskutert ovenfor.
Andre fordeler ved denne teknikken omfatter er dens brede anvendbarhet til en rekke dyremodeller og muligheten til å innlemme inn i et eksisterende laboratorieinfrastruktur. Når det gjelder sistnevnte, er ingen spesielle reagenser eller kjemikalier er nødvendig bortsett fra de valgte ototoxic midler, bedøvelsesmidler, og analgetika. Ototoxic midler benyttes typisk ved en fast konsentrasjon og blandes i et stort nok volum av oppløsning (5 ml) til å vare lengre tid vurdereing hvert program bruker omtrent 10 pl (hos mus). Dermed etter den første anskaffelse av utstyr og instrumenter, etterforskere er relativt fri for tidkrevende løsning forberedelse eller hyppig utskifting av materialer. Denne teknikken har også reduksjon i operativ tid, noe som kan ha betydning når sammenlignet med fremgangsmåter som omfatter implantering av perilymphatic infusjonspumper eller cochleostomies. Ved å nå et nivå på tekniske ferdigheter, våre gjennomsnittlig gjennomføringstid fra første snitt til nedleggelsen var typisk 20 min til 1,5 timer, avhengig av lengden av eksponering er ønsket for ototoxic agent. Tre eller fire operasjoner kan lett bli ferdig i løpet av én dag, noe som åpner for økt effektivitet og økt potensial for å oppnå gode resultater. Som beskrevet ovenfor, denne teknikken kan også lett brukes på en rekke forskjellige gnagermodeller, inkludert mus, rotter, marsvin og ørkenrotte.
Begrensninger av denne metoden er sentrert påmoderat bratt læringskurve for å mestre det og redusert forventede resultater til teknisk ferdighet er nådd. Som skal diskuteres i mer detalj nedenfor, vil små feil i løpet av den kirurgiske metode eller utilstrekkelig visualisering av det kirurgiske felt nesten alltid føre til et dårlig resultat. Sparsomme funn at en nybegynner kan mislykkes i å gjenkjenne, for eksempel en sub-millimeter tykk luftboble blokkerer tilgangen av agenten til det runde vinduet membran eller interstitiell væske fortynne agent, ta deg tid til å sette pris på og utvikle de psykomotoriske ferdigheter som kreves for å korrigere dem. Men med gjentatt utførelse av fremgangsmåten disse hindringene er lett overvinnes, og utgjør en mindre krevende teknisk utfordring å undersøkere enn noen av de tidligere nevnte invasive metoder. Endelig er denne teknikken forbundet med relative begrensning at cochlea skade kan fremkalles bare ved et enkelt tidspunkt i løpet av den kirurgiske eksponering. Dette kan overvinnes i en viss grad, Ved å fylle RWN med absorberbare gelatin svamp fuktet i midlet som ble beskrevet av Heydt et al. 10 Den absorberbare gelatin svampen vil resorbere over tid, men kan gi rom for en lengre eksponeringsperiode enn det som er oppnåelig ved anvendelse av en vandig oppløsning alene.
For at en undersøker for å realisere den fulle fordeler ved denne teknikk og unngå eventuelle fallgruver, er det avgjørende å gjenkjenne de to kritiske elementer av denne teknikk: 1) den gjennomgående opprett visualisering av mellomøret plass og RWN; og 2) evne til å holde operasjonsområdet fritt for interstitiell væske og / eller blodet. I å oppnå den tidligere av disse, kan betydningen av en skikkelig head-holderen ikke understrekes sterkt nok. Sikker fiksering av dyrets hode sikrer en stabil visning under mikroskop; hvis betydning blir lett åpenbar når subtile instrumentering drastisk endrer plassering av strukturer under forstørrelse. En god head holder som kan rotere om dyrets rostrokaudale aksen forenkler også viktige dynamiske endringer i etterforskeren linje av nettstedet. Ofte kan et par millimeter rotasjon om denne akse bety forskjellen mellom visualisering av RWN og visualisering av bare otic kapselen benet. Muligheten til å stadig endre syn er også viktig å sikre interstitiell væske er fjernet fra dypet av nisje og også at ototoxic agenten er helt fjernet mellom programmer som omtalt i del 5. I vår erfaring, blod, kondens, eller interstitiell væske som kommer inn i mellomøret plass har evnen til å forstyrre hele eksperimentet. Dette er ikke overraskende, da den lille mengde av ototoxic middel påføres på det runde vindu (~ 10 mL) kan lett fortynnes ved å komme i kontakt med selv små mengder av overflødig væske. Av denne grunn, nitid kirurgisk disseksjon, stykkevis uncapping av tromme bulla og forsiktig preservation av stapedial arterie er ensbetydende med å en vellykket eksperimentelle resultater.
Hvis ovennevnte kritiske trinn er observert og forventede resultater er fortsatt ikke oppnådd, bør feilsøking starte. Etter vår erfaring er det ofte nyttig å utføre prøve varianter av to prosessuelle elementer. Den første er å endre hvor ofte den ototoxic agenten blir oppfylt i det runde vinduet. Avhengig av det middel som skal anvendes, er total eksponeringstid på mellom 30 min og 1 time, med fullstendig vekevirkende og påfølgende utskifting av midlet hvert 10 min. Hvis utsette for kortere varighet, kan øke den totale eksponeringen tillate agenten mer tid til å spre over det runde vinduet membran. Ytterligere eksponering og etterfylling kan også bidra til å unngå uønsket fortynning av ototoxic middel ved blod, kondensasjon, eller interstitiell som diskutert ovenfor. Forsiktighet bør opprettholdes ved bruk av denne tilnærmingen, men som det har en tendens til å øke risikoen for utilsiktetly skadet den stapedial arterie og / eller innføre interstitiell væske til RWN.
Denne teknikken er vesentlig i hva det tilbyr til undersøkelser av cochlea fysiologi og patofysiologi. Denne minimalt invasive teknikken tillater detaljert studie av delikate biokjemiske prosesser og har vært ensbetydende i å fremme vår forskning rettet mot å vurdere cochlea regenererende potensial. 12,24 Denne kirurgiske tilnærming og påvirkning er også gjengitt på tvers av en rekke andre avlegger teknikker, og vellykkede resultater ved hjelp av denne Metoden har blitt rapportert i studier av cochlea stamcelle implantasjon. 14 Mye er fortsatt ukjent om sneglehuset, men denne teknikken, sammen med bredere armamentarium tilgjengelig for etterforskere, vil hjelpe til å begrense dette kunnskapsgapet.
Disclosures
Ingen konkurrerende økonomiske interesser. Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Heptanol 98% | Sigma-Aldrich | H2805 | PubChem Substance ID 24895536 |
| Ketaset Injectable | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Concentrate 100mg/ml |
| (Ketamine HCl) | 10 ml | Schedule CIII controlled substance | |
| Anased Injectable | Lloyd Laboratories | NADA# 139-236 | Concentrate 20mg/ml |
| Buprenex Injectable | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Concentrate 0.3 mg/ml |
| (Buprenorphine HCl) | 5 ampules per box | Schedule CIII controlled substance | |
| Betadine Skin Prep Solution | Medline | MDS093941 | 1 Quart screw top bottle |
| 0.9% Sterile Saline | Variable | For mixing solutions and injections | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | 32192 | |
| Controlled Acoustics Environment Sound Booth | Industrial Acoustics Company | ||
| Surgical Head Holder | Custom Made – | Please see Figure 3 | |
| Medical University of South Carolina | |||
| Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75 inch | World Precision Instruments | 555801L | Maximum spread 20 mm |
| Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder | |||
| 90N Dental Belt Driven Hand Drill | Emesco | Vintage Item | |
| Scalpel Handle Size 6 | Bard-Parker | MEDC-011990 | |
| #15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade | Bard-Parker | SKU: 097-7215 | 50 Blades/Box |
| Via ACE Surgical Supply Code | |||
| Straight Tip Jewelers Forceps | Bernell | MIL17304 | |
| Iris Scissors Curved | Medline | DYND04026 | |
| Iris Scissors Straight | Medline | DYND04025 | |
| Stevens Tenotomy Scissors Straight | Medline | MDG3222111 | |
| Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.00 | Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks |
| Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.01 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | CODE 34155 | White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks. |
| House Ear Curette, 6” shaft, light angle | Medline | MDG0396486 | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100 | Medline | IIS34201 | Substitutions may be made |
| Cotton pellets #3 4 mm | Richmond | Manufacturer Code 100108 | |
| ElectroSurgical Unit 100 E M/M | Elmed | List No. 52-5770 | Bipolar and Monopolar Capable |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle | BD | Product Number: 329410 | Optional for delivery of Ototoxic agent |
| 23G, blunt tip, 1” length needle | Kendall | Product Code 8881202397 | For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery |
| Surgical Mask | U-line | S-10478 | |
| Exam Grade Nitrile Surgical Gloves | U-line | S-12549 | |
| Precision Hair Clippers | Wahl | Multiple models may be substituted | |
| 5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13 mm 3/8 circle needle | Ethilon | 1855G | Substitutions may be made. |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisher | 01-812054 | |
| Dry Sterilizer | ROBOZ | Germinator TM 500 |
References
- Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E.
- Dodson, H. C. Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides. Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).
- Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin. The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).
- Lee, K. S., Kimura, R. S. Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).
- Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).
- Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).
- Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers. Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).
- Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells. Hearing research. 125, 109-119 (1998).
- Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse. Hearing research. 162, 65-74 (2004).
- Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear. Hearing research. 265, 70-76 (2010).
- Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).
- Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).
- Lang, H., et al. Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).
- Stevens, S. M., et al. Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).
- Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing research. 130, 94-107 (1999).
- Hequembourg, S., Liberman, M. C. Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).
- Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to 'primary' loss of cochlear neurons. The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).
- Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).
- Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice. Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).
- Tang, X., et al. Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse. Neuroscience. 259, 184-193 (2014).
- Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).
- Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits. PloS one. 9, e90279 (2014).
- Lang, H., et al. Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).
