Introduction
Forskare har använt många olika djurmodeller för att studera den normala funktionen hos hörselsystemet samt patofysiologin av hörselnedsättning. Dessa modeller är också mycket användbar för att genomföra interventionsstudier mot olika patologiska processer och ligga till grund för translationella tillämpningar i människor. För de flesta forskning där snäckan och dess tillhörande hörselbanorna, måste en viss grad av skador eller störningar införs i systemet. Ofta är skadan uppsåtligen syftar till att skapa en viss skada, vilket gör att utredarna för att studera effekten av denna skada på normal funktion, liksom Cochlear förmåga att återhämta sig från den. När val av en speciell djurmodell och / eller teknik (er) för att införa skador måste ett antal faktorer beaktas för att uppnå bästa möjliga resultat. Olika djurmodeller kan reagera olika på ingrepp, medan de direkta och indirekta effekterna av en teknik kan varahelt skadliga för det önskade resultatet. I de flesta fall skulle det idealiska innerörat skador protokoll undvika systemisk toxicitet, snabbt och pålitligt producera skador, skapa en exakt och konsekvent skada, och vara survivable att tillåta ytterligare studier av funktionella, cellulära och molekylära förändringar. Idealt skulle dessa metoder också bevara den känsliga mikroarkitektur och elektrokemiska gradienter av snäckan i största möjliga utsträckning.
Hittills har forskare lyckats etablera ett antal tekniker för att inducera innerörat skada. De flesta av dessa innebär att utsätta snäckan till ett ototoxiskt medel antingen systemiskt eller via kirurgisk metod. Tekniker inkluderar parenteral injektion, intra-peritoneal injektion, trans-trum injektion, endolymphatic sac injektion och cochleostomy med perilymphatic perfusion. Dessa tekniker har använts för att introducera en mängd ototoxiska medel, såsom furosemid, gentamicin, ouabain och heptanol. 1-5Även framgångsrika i att skapa särskilda cochlea skador, även teknikerna ovan har erkänt begränsningar. System injektioner kan vara mycket giftiga för djur och kan associeras med oavsiktliga hörsel förolämpningar och inkonsekventa resultat. Den sistnämnda bristen har också satts i samband med trans-trum injektioner. Tekniker såsom cochleostomy och perilymphatic perfusion, medan förmåga att inducera snabba och mycket pålitliga skador, direkt invasiva till innerörat struktur och funktion. Många av de kirurgiska metoder är också förknippade med en hög grad av tekniska svårigheter och kan kräva lämna främmande föremål i djur, såsom en mikroinfusions. 2-4,6-8 Ingen enskild teknik är fri från brister, och utredarna måste välja metoder noggrant för att passa deras experimentella behov. Här beskriver vi i detalj, det runda fönstret nisch (RWN) appliceringsteknik för topisk leverans av ototoxiska medel hos vuxna möss.
First beskrivits av Husmann et al 1998 under studietiden gentamicin effekt på sensoriska hårceller degeneration i en aviär modell, var denna teknik visat sig vara kapabel att producera betydligt mer tillförlitliga skador än system gentamicin ansökan, samtidigt som man undviker tillhörande toxicitet. 9 Sedan dess har ett antal andra forskare, inklusive vårt laboratorium har utnyttjat denna teknik till stor framgång. År 2004 Heydt et al. anpassat den till en musmodell och beskrev en ökad förmåga att styra lesionsstorlek genom att fylla RWN med absorberbara gelatin svamp indränkt i varierande koncentrationer av gentamicin. 10 Palmgren et al., 2010, studerade ototoxiska effekterna av beta-bungarotoxin, en potent elementet i giftet från de taiwanesiska banded spjällåda, genom applicering av en vattenhaltig form av beslutet till RWN hos vuxna råttor. 11 Dessutom har ett antal tidigare studier från vårt laboratorium utnyttjas det runda fönstret tillvägagångssätt för att studera de ototoxiska effekterna av furosemide, ouabain och heptanol. 5,6,12-15 Resultaten av dessa studier har visat på vikten av cochlea vätska och jon homeostas på normal hörsel, upptäckte cellproliferativ förmåga spiralganglion och cochlea sidovägg, och främjat vår förståelse av åldersrelaterad hörselnedsättning.
Följande tillvägagångssätt innebär kirurgiskt tillgång till mellanörat via en postauricular snitt och delvis unroofing av beniga trum bulla. Detta möjliggör utmärkt exponering av RWN och membranet till vilken en utvald ototoxiska medlet kan anbringas direkt. Det flytande medlet sedan pooler i skålliknande ihålig av RWN (eller långsamt rinner från en mättad absorberbar gelatinsvamp bäraren packas in i RWN) och diffunderar genom det runda fönstermembranet in i perilymphatic utrymmet i cochlea förgården. Ingen direkt cochleostomy görs i denna strategi. Fördelar med denna teknik inkluderar bevarande av innerörat mikroarkitektur, undvikandeav systemisk toxicitet, ersättning av en intra-djurkontroll örat, snabbt insättande effekt, selektiv degenerering i vissa typer cochlea cell (t.ex.., typ I spiral ganglieneuroner med ouabain exponering och cochlea typ II fibrocyter inducerade genom behandling av heptanol), och reproducerbara / tillförlitliga resultat. Denna teknik kan tillämpas med några förändringar mellan andra arter av gnagare, bland annat råttor, marsvin och gerbiler. Nackdelar inkluderar en brant inlärningskurva teknisk och den relativa begränsningen av ototoxiska förolämpning som är begränsad till en enda tidpunkt.
Protocol
Alla aspekter av djurförsök genomfördes i enlighet med riktlinjerna i lämplig Institutional Animal Care och användning kommittén. Alla ryggradsdjur experimentella procedurer som beskrivs här godkändes enligt riktlinjerna för den medicinska universiteten av South Carolina (MUSC) Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Model Selection
- Behåll djurmodellen i en låg ljudnivå vivarium med rutin fastighetsskötsel per institutionella protokoll tills klar för användning. I djurförsök anläggningar (ARF), upprätthålla vibrationsstabilitet, ljuddämpning, dygns belysning, prep utrymme, ytbehandlingar, tätning och fogar, och ventilation som uppfyller NIH standarder.
Obs: National Institutes of Health (NIH) riktlinjer för ARF och underhåll av en låg ljudnivå vivarium kan ses över: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ - För alla experiment, använder höger öra som den experimentella örat. Vänster öra fungerar som en intra-djurkontroll och inte kirurgiskt ändras.
- Inspektera förlagan till djur preoperativt för tecken på mitten eller yttre öroninfektion. Potentiella tecken kan inkludera dränering av vätska eller pus från örat, inflammerad pinna vävnad och / eller slöhet av djuret. Detta är ovanligt, men om den finns, undvika ytterligare kirurgi och behandla djuret på lämpligt sätt.
2. Preoperativa Förfaranden
- Söva djuret 30 minuter före operation och eventuella perioperative förfaranden via intraperitoneal (IP) injektion av ketamin (100 mg / kg IP) och xylazin (20 mg / kg IP). Tillägg anestesi efter behov, såsom bedömdes genom en positiv toe-nypa reflex, med en lägre dosering av ketamin (25 mg / kg IP) och xylazin (5 mg / kg IP). Bestäm dosering i enlighet med institutionellt tillåtna protokoll för möss med ålder lämpliga justeringar i dos.
- Kontrollera för full sedation av modellen. Kontrollera om en etapp tre plan av anestesi för hela den beskrivna protokollet markeras med en vanlig andningshastighet, en brist på rätande reflex (hos möss), och brist på pedalen och ögonlocks (toe-nypa) reflexer. Bibehåll djuret vid denna nivå av anestesi. Detta är avgörande för att minimera smärta och intraoperativ rörelse, blödning och läckage av interstitiella vätskor under operation.
- Bibehåll djurets kroppstemperatur vid 37,5 ° C med en sluten slinga värmedyna.
- Administrera smärtlindring via subkutan injektion av buprenorfin. Deliver buprenorfin (0,1 mg / kg SQ gång 30 min före kirurgi) som analgesi för att minimera eventuella kirurgiska obehag. Bas dosering och alternativ som passar till den valda modellen på institutionellt godkända protokoll. Antibiotika används är inte nödvändig om god aseptisk teknik har utövats. Djuren får postoperativ smärtlindring om det finns tecken på smärta och ångest.
- Utför physiologic tester preoperativt. Utföra hörselhjärnstammen svar (ABR) testning och / eller snedvrida produkt optoakustisk testning utsläpp (DPOAE) både preoperativt och strax före offra av djuret fungerar som en objektiv mätning för effekten av den valda ototoxiska medlet på musen hörsel.
3. Kirurgisk förberedelse och positionering
- Sterilisera alla instrument preoperativt per institutionella normer. Förbered kirurgiska instrument och fält på ett konsekvent, steril och organiserat sätt att undvika onödiga ansträngningar och rörelse under förfarandet. Typiska instrument krävs omfattar skarpa dissekera sax, flera par av metalliska pincett med juvelerare tips, en otologiskt plockning, en otologiskt kyrett och en bipolär diatermi enhet (Figur 1).
- Förbered och sterilisera pappers vekar gjorda av labwipes i förväg genom att skära en liten trekantig bit av torka (~ 0,7 x 1,25 tum x 1.75 i) och vrida det tätt mellan tummen och pekfingret på en hand (~ 1,25 tum). Skapande av en tätt tvinnad, extremt tunna veken är avgörande för framgång för förfarandet. Bered totalt 15-20 vekar före kirurgi (Figur 2).
- Använd en tandläkarborr för att snabbt perforera benet i trum bulla på ett kontrollerat sätt. Användning av en remdriven dentalhandborr med en 1 eller 2 mm avsmalnande spets är att föredra. En operativ mikroskop krävs för att slutföra protokollet. (se steg 4.7)
- Pre-rita 0,2 ml av en vattenlösning innehållande det utvalda ototoxiska medlet in i en 1 ml tuberkulinspruta med en 28 G, 1/2 'nål. Typiskt en droppe (~ 10 | il) av medlet är tillräcklig för att fullständigt fylla mus RWN. En metallisk, trubbig spets sprutnål underlättar tillförsel av medlet samtidigt förhindra skada på underliggande strukturer av en kraftig avfasning spets. Spruta ut eventuell luft i sprutan som bubblor oavsiktligt kan fylla RWN och / eller förhindraapplicering av medlet till den runda fönstret själv.
- Ta päls från efteröron huden med elektriska grooming Clippers. Ta päls i en zon som sträcker sig från auriculo-cephalic veck rostrally till skuldergördeln kaudalt. Förläng hårborttagning från rygg, sagittal mittlinje till mandibular vinkel i sidled. Korrekt avlägsnande päls är av största vikt att upprätthålla en ren och klar kirurgiska området. Borsta försiktigt urklipp från den avsedda operationsområdet.
- Sterilisera huden preparerade ytan per institutionella protokoll. Applicera Betadine (povidon / jod) alterneras med etanol topiskt i ett cirkulärt sätt under två minuter. Andra medel kan ersättas per institutionens riktlinjer.
- Placera djuret på en plan yta för att bibehålla konstant kropps positionering under förfarandet. Använd en liten värmedyna placerad under kroppen på plattformen för att styra kroppstemperaturen under proceduren för att upprätthålla djurets kroppstemperatur vid 36-38 ° C. Inte overheat djuret eftersom detta kan leda till mild till svår hudskada och / eller tidig eutanasi.
- Säkra chefen för djuret via en bitblock / huvudhållare apparat. Utnyttja en 0,5 cm x 2 cm bitblock svarvade ur mässing med hål 2-4 mm diameter borrade genom den vid 5 mm intervall utmed den långa axeln. Öppna djurets mun runt denna fixtur och montera de övre centrala framtänderna i ett av hålen beroende på djurets storlek. Försiktigt dra en liten klämma över ryggen på djurets nos för att hålla den på plats (Figur 3).
- Bekräfta att bitblocket / huvudhållare är stelt förbunden med mitten av en U-formad vridbar arm (figur 3). Säkra en 1 cm bred stång till vänster arm "U" och använda spö som en vänster nackstödet (till höger är alltid den operativa sidan).
- När fast i huvudet hållaren, rotera musen till vänster sidoläge trycksår. Placera kroppen carefully på den plana rörelseytan för att säkerställa att den kommer att vara stabil under hela förfarandet och undvika onödig vridpåkänning på halskotorna.
- Placera ett operationsmikroskop med förmåga att 4x, 10x, och 20x förstoring över det kirurgiska området. Kontrollera att mikroskopet kan behålla sin position i en handsfree-sätt eftersom det är perfekt för två-handed kirurgiska protokoll diskuteras nedan.
- Placera en bipolär-aktiverad diatermi enhet med fin spets juvelerare handstycket i en position som är omedelbart tillgänglig för stödet i cauterization av små kärl och dissektion av vävnad. Detta kan också vara nödvändigt bör kraftigare blödningar uppstå.
4. kirurgisk metod
- Under mikroskopisk förstoring, vassa sax eller en skalpell blad för att skapa en 1-1,5 cm postauricular snitt, ungefär 6-8 mm kaudalt om auriculocephalic veck. I den vuxna musen, ett snitt från den dorsala mittlinjenlateralt till en punkt nära vinkeln för underkäken är tillräcklig. Noggrant undvika att skära djupt att bevara underliggande kärlstrukturer.
- Genomför försiktig dissektion genom subkutana fettskiktet som kan vara av varierande tjocklek. Fett kan säkert tas bort om det behövs förbättrad exponering. Var försiktig när dissekera i en ventral-medial riktning som den yttre halsvenen korsar detta område och skador på denna struktur kan orsaka stora mängder blodförlust och översvämningar i operationsområdet. Styr någon kraftig blödning med absorberbara gelatinsvampar och / eller bomullspellets. Använd bipolär diatermi för kraftigare blödningar.
- När fettskiktet är ordentligt uppdelad, exponera halsmusklerna. Obs viktiga strukturer, inklusive den stora muskel kropp av cleidomastoideus centralt inom den exponerade kirurgiska området, den yttre halsvenen ventralt och öronspott vävnad rostrally ligger över vinkeln käken. En viktig milstolpe är en liten nerv Branch (av kranialnerven XI) som sveper runt den bakre / rygg kanten av cleidomastoideus att förlänga rostrally mot ytterörat (Figur 4).
- Försiktigt dra in cleidomastoideus muskelkroppen i en posterior / dorsal riktning (figurerna 4, 5). Dela försiktigt transparenta fascia omsluter muskeln kroppen. På ett liknande sätt, försiktigt dra tillbaka parotid och yttre halsvenen i motsatt (främre / ventrala) riktning (fig 5).
- Med god indragning av cleidomastoideus muskler kroppen, kommer den blanka kupolen på trum bulla benhinnan komma i sikte (figur 6). På den bakre aspekten av bulla, införandet av en djupare livmoderhalscancer muskler, den sternomastoideus, kommer i sikte (figur 6). Bevara ansiktsnerven, som blir synlig på rygg och rostralt aspekt av bulla kupolen. Placera en självhållande upprullningsdon (Steril titan shaft-- inbäddade i engångs silikonklistra) före borrning.
- Med två-handed teknik, försiktigt dela bulla benhinnan med bipolär diatermi att exponera det underliggande benet. Använd pincett eller en otologiskt kyrett, försiktigt lyfta och driva periosteum i en perifer riktning för att allmänt exponera bulla kupolen.
Anm: Steg 4,6 är kritiskt för att maximera kirurgisk vy av mellanörat utrymmet. Utnyttja noggrann och varsam hantering mjuk vävnad för att undvika blödning och / eller läckage av interstitialvätska i bulla hålrummet efter borrning. - Vid en korrekt exponerad bulla kupol, borra ett 2 mm pilothålet genom bulla ben med en dental kirurgisk borr mellan den bakre kanten av kupolen och synligt opaka linjen (representerande trumhinnan) som sträcker sig tvärs över rostralt aspekten av bulla (figur 7). Var noga med att borra endast genom ben för att bevara underliggande strukturer, såsom stapedial artären. Borra ett andra testhål i närheten för att underlätta FN-tak av bulla ben (<strong> figur 7).
- Med hjälp av ett par juvelerare spets pincett, fixed bulla benet i en rygg- och stjärt riktning (Figur 8). Ta benet i ett fragmentariskt under hög förstoring. Punktera inte stapedial artären, som ligger direkt under bulla mössa, eftersom blödning från denna artär kan äventyra förfarandet. Minimera mängden av ben avlägsnas för att förhindra överdriven vätska inträde till mellanörat och samtidigt tillåta utmärkt visualisering och tillgång till det runda fönstret nisch (Figur 8).
5. Round Window Tillämpning av ototoxisk Agent
- Gör subtila rotations justeringar av huvudet innehavaren att föra RWN rakt i sikte. Den RWN typiskt belägen vid dorsala och kaudala aspekten av mellanörat utrymmet och visas som en skålliknande indrag av öron kapselbenet. I de flesta fall går den stapedial artären 1-2 mm ventralt / rostralt till detta. Den RWN kan ibland vara TUCked perifert under en akut vinkling av bulla kupolen. I sådana fall är noggrann positionering av djurets huvud av största vikt.
- Använda pappers vekar framställda preoperativt, ta bort allt synligt vätska i mellanörat och RWN tills torr ben visualiseras.
Obs: Detta är det mest kritiska steget i hela protokollet, som ~ 10 ^ (1 droppe) i ototoxiskt medel appliceras på RWN kan lätt spädas med denna vätska.
- Använda pappers vekar framställda preoperativt, ta bort allt synligt vätska i mellanörat och RWN tills torr ben visualiseras.
- Under maximal förstoring, använd en fin kaliber nål på en tuberkulinspruta 1 ml att tillämpa en droppe (~ 10 l) av ototoxiskt medel direkt till RWN, fylla den helt. Var noga med att inte störa stapedial artären och observera noga för att ersätta en liten ljusreflektion vid foten av ett torrt nisch med en tråkig och disigt flytande menisk som en indikator på att den nisch fylls ordentligt.
- Låt medlet att stanna inom den RWN för cirka 10 minuter exponeringstid. Efter detta, helt wick ut medlet och ersätta den med en ny tillämpning av samma agent. Bestäm upprepningar av ansökan enligt agent specifikationer. Total exponeringstid i detta förfarande sträcker sig typiskt mellan 30 till 60 minuter.
- I slutet av förfarandet, helt transportera bort agenten en sista gång och tillämpa ny agent för RWN. Lämna bulla oskyddad och använda pincett för att stänga den mjuka vävnaden ovanför operationssåret.
- Täta operationsstället vid nivån för huden med en 4-0, icke absorber monofilamentsutur. Placera djuret i en soda bur / stationen. Övervaka djurets kliniska tillstånd regelbundet efter operationen. Behåll djuret under lämpliga förhållanden miljö, inklusive bostäder med mjuk sängkläder och komplettering med mjuk mat, för att minimera stress. Bestäm framtida förfaranden och postoperativa förhållanden i enlighet med de institutionella IACUC protokollen.
- Använd institutionella IACUC protokoll för att sterilisera instruments före användning på nästa djur. Tillåt för att kylningen tid mellan instrument användning.
6. Postoperativa procedurer och Cochlear Tissue Skörd
- Som beskrivs i steg 2,5, utför fysiologiska tester av hörseln postoperativt vid önskade punkter och före avlivning. Utför Postoperativa förfaranden enligt experimentella syften. Offra djuret på vilket önskat postoperativa dagen.
- Vid full narkos via IP-injektion, vilket krävs per institutionella IACUC protokoll offra djuret. Med vassa saxar, halshugga djuret bara caudal till nackknöl. Kraftigt öppna skalle med en sax längs rygg och ventrala mittlinjen och en stor spridning. Försiktigt ösa ut hjärnvävnad att exponera temporal ben.
OBS: Ett antal förfaranden för undersökning av post förändringar exponering i snäckan kan förgrenas från denna punkt och kommer att nämnas i diskussionsavsnittet. Bestäm utredningsmetoden mest relevant de experimentella syften. Om elektronmikroskopi planeras efter snäckan sektioneras, använda hjärtkateterisering att i förväg fastställa vävnaden. Detta är utanför ramen för denna diskussion och har behandlas ingående på annat håll. 13 - Skär tids benen ur skallbasen med saxen och placerades omedelbart i fixeringslösning. Doppa ben direkt i 4% paraformaldehyd i 1,5 h vid RT. Övervaka fixering tid, eftersom längre varaktighet kan begränsa resultatet av histologisk analys vid senare steg. Avkalka dissekerade benen för en variabel tidsperiod via nedsänkning i 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA).
Representative Results
I en nyligen genomförd studie av Stevens et al utnyttja ovanstående protokoll var vuxna CBA / CaJ möss av båda könen exponeras via runda fönstret diffusion till heptanol. 15 HEPTANOL är ett gap junction un-kopplare kända för att producera riktade, återvinnings skada celler i cochlea sidovägg. Syftet med studien var att ta fram en tillförlitlig modell för riktad cochlea skador, vilket möjliggör undersökning av postkirurgisk regenerering av skadade element. Pre-kirurgiska och postoperativa hörtrösklar fungerade som en funktionell slutpunkt. Mikroskopi och immunhistokemiska färgningsteknik användes för att studera morfologiska förändringar. Signifikanta ökningar av ABR trösklar observerades i heptanol-behandlade möss (Figur 9). Kontrolldjur som fick skenkirurgi, med leverans av saltlösning istället för heptanol, inte har visat betydande tröskel skift vid varje testad frekvens.
Immunfärgning mot en inåt likriktandekaliumkanalen (Kir) 4,1 fungerade som en indirekt metod för att visualisera skada / återvinning av hörsel strukturer. Detta visade höggradigt reproducerbara skillnader mellan behandlings- och kontrollöron. Övergripande färgningsintensitet minskade markant inom stria vascularis (STV) och bland fibrocyter spiral ligament (SLF) 1-3 dagar efter heptanol exponering, betecknar stora mängder riktad skador på dessa områden. Det fanns en viss minskning i Kir 4.1 färgningsintensitet inom typ II och typ IV SLFs (Figur 10) och Stv (Figur 11). Bevis på störd kärn integritet och kromosomala kondens / blebs typiska för cellulär apoptos sågs också på kärn counterstains i dessa cochlea områden (Figur 10). Vakuoliserade zoner Kir 4.1 färgning lösas markant på 7 dagar och var frånvarande helt och hållet på 14 dagar. När Kir 4,1 färgningsintensitet kvantifierades inom områdena STV, behandlade öron visade en initial tråg följt av en stor förändring (p <0,05) tillbaka mot kontrollintensitet 7 dagar efter heptanol exponering (Figur 12).
Figur 1. Instrument inrättas. Visning av pre-kirurgiska set-up av instrumentering. All utrustning ska vara lätt tillgänglig inom det sterila operationsområdet. Typiska instrumentering omfattar 2 skarpa dissektion sax, 2-3 raka och / eller böjd spets juvelerare pincett med öron kyretter, böjda axel otologiskt plockar (senare ersattes med Rosen plockar - ej visad), och en elektro cautery enhet med fin böjd spets juvelerare pincett headpiece. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kirurgiska förbrukningsmaterial. Ytterligare tillbehör för att upprätthålla RWN miljön. Steriliserade labwipe utskärningar för pappers veke bildning (till vänster), transporterar tätt formade pappers tillverkat av steriliserade lab våtservetter (centrum), och 4 mm bomull pellets (höger) används för att torka överflödig vätska och blod översvämningar i runda fönstret nisch. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Djurhuvudhållare. Avbildar huvudhållaren och bitblocket. Hålen i blocket montera och säkra övre centrala framtänderna. En klämma försiktigt dras åt över rygg nos till säkra djuret på plats. Användning av en huvudhållare är avgörande för en framgångsrik kirurgisk outcome. Helst bör detta kunna rotera kring rostralt-caudal axeln hos djuret för att optimera kirurgiska utsikt över bulla under förfarandet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Cleidomastoideus m.. Schematisk diagram som visar den grundläggande anatomi gnagare halsmusklerna och dess samarbete med externa halsvenen. Den cleidomastoideus muskel är den mest lätt identifieras muskler under kirurgisk metod. Frisläppande av omslutande fascia följt av bakre / rygg indragning av muskeln kroppen kommer direkt kirurgisk dissektion mot trum bulla (svart cirkel). Klicka här för att se alArger version av denna figur.
Figur 5. Kirurgisk exponeringsområdet. Skildrar exponering efter dissektion genom kutana och subkutana fettdepåer. Strukturella landmärken noterar inkluderar en gren av kranialnerven XI liggande cleidomastoideus muskeln (A), den yttre halsvenen (B), och exponerades öronspott vävnad (C). Den kranialnerv XI gren förknippas ofta med en liten fartyg och måste delas upp innan du går vidare. Från höger till vänster på bilden motsvarar djurets rostralt-caudal axeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Exponera buIla. Exponering av trum bulla efter indragning av cleidomastoideus och omgivande strukturer. Kända landmärken inkluderar cleidomastoideus muskelkroppen (A) reflekterade baktill / dorsalt, ansiktsnerven (B), och den blanka kupolen på trum bulla benhinnan (C). Observera också införandet av sternomastoideus muskeln till vänster kaudala aspekten av trum bulla (asterisk). Närvaron av ansiktsnerven vid dorsala och rostrala aspekten av bulla är en kritisk landmärke för sann identifiering av bulla. Från höger till vänster på bilden motsvarar djurets rostralt-caudal axeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Exponera runt fönster nisch jag. Bild visar tympanic bulla helt exponerad efter dissektion av det överliggande benhinnan. Pilothålet är bäst lämpad vid halvvägs mellan den bakre kanten av bulla kupolen och en subtil ogenomskinlig linje visualiseras inom den rostrala aspekt bulla (representerande trumhinnan). En andra, närliggande pilothål kan underlätta lättare un-tak av bulla ben. Undvikande av djupborrning bör vidtas för att inte skada den underliggande stapedial artären. Den mörka, metallföremål längst ned i bilden är titan mjuk vävnadssårhake. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Exponera runt fönster nisch II. Uncapped trum bulla med exponering av det runda fönstret nisch (pilen) och stapedial artär (röd struktur1-2 mm lateralt till den nisch) som betraktas under 20x förstoring. Den nisch ofta fastställs i ett läge stoppade under den spetsiga vinkeln som bildas av bulla kupol med öron kapsel vid den kaudala aspekten av kupolen. Det är viktigt att full visualisering av nisch uppnås före applicering av ototoxiska medlet eller uppsugning. Överdriven benborttagning under avtäckning bör också undvikas eftersom interstitialvätska / blod tenderade att översvämma hålrummet när stora hål skapades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Representativa resultat -. HEPTANOL inducerad hörselnedsättning och återvinning Mean hörselhjärnstammen svar (ABR) gränsvärden (dB SPL) ritas som en funktion av tonen pipfrekvens. Mätningarna är grupperade enligt förexponering (svart-Control) och postoperativ dag (POD) 1, 7 och 14 (röd). Felstaplar representerar SEM. Figur åter ritas från Stevens et al. 2014. 15 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10. Representativa resultat - Riktade cochlea skador efter heptanol exponering del I. Förändringar i Kalium Inre Rectifier (Kir) Kanal 4.1 färgning i stria vascularis (STV) av öron behandlade med heptanol och kontrollera öron. (A) Normal Kir 4.1 färgning typiska kontroll öron med stark strial cell affinitet för Kir 4,1 (grön). (B) Behandling öra på POD1. Stora vacuolized zoner av Decrlättade Kir 4.1 affinitet ses i STV (Pilspetsar) tillsammans med en total minskning av Stv Kir 4.1 färgningsintensitet. Kärnor motfärgades med propidium jod (röd) (B). Skalstreck = 15 | im. Figur åter ritas från Stevens et al, 2014. 15 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11. Representativa resultat - Riktade cochlea skador efter heptanol exponering del II Förändringar i spiral ligament (SL) i heptanol behandlade örat jämfört med kontroll örat.. (A) Normal Kir 4,1 färgning (grön) i SL typiska kontroll öra med normalt utseende typ II spiralligament fibrocyter (II). (B) HEPTANOL treated öra med markant minskning av Kir 4.1 färgningsintensitet när det gäller typ II spiral ligament fibrocyter, kärnkraft avbrott och kromosom kondensations / blebs förenliga med apoptos (pilar). Kärnor motfärgades med propidium jod (röd). Skalstreck = 15 | im. Figur åter ritas från Stevens et al, 2014. 15 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12. Representativa resultat -. Återvinning av cochlea färgningsintensitet efter heptanol exponering Genomsnittlig relativ luminans Kir 4,1 färgning plottad som en funktion av efterexponerings dag. Relativ luminans beräknas som Kir 4,1 reflekterande intensitet enligt konfokalmikroskopi i heptanol behandlaed öronen tas som en procentandel av samma i kontrollöron. Obs POD14-28 uppgifter samlas som en enda punkt på kurvan. Fyllda cirklar representerar medelvärden medan felstaplarna representerar standardfelet av medelvärdet. En betydande återhämtning av relativa ljusstyrkan visades mellan POD 7 och senare datum (Students t-test p <0,05, asterisk). Figur åter ritas från Stevens et al., 2014. 15 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Protokollet och representativa resultat som beskrivs ovan erhölls i en CBA / Caj musmodell inklusive båda könen. Detta inavlad stam är väl etablerad som en "bra hörsel" standard och "normalt åldrande" -modellen hörselforskning. 16-23 Beskrivning av användningen av detta protokoll i andra modeller däggdjurs är utanför ramen för denna text. Läsaren bör notera, emellertid, att RWN appliceringstekniken erbjuder flera fördelar att studera däggdjurs inneröra. Av dessa är det mest anmärkningsvärda att den undviker direkt avbrott i den känsliga anatomiska struktur och biokemiska gradienter som finns innanför murarna till öron kapseln. Procedurer såsom cochleostomy och implantation av infusionspumpar har benägenheten att direkt bryta mot innerörat strukturer som leder till permanenta tröskel skift; ett faktum som måste beaktas när man analyserar resultaten. Störningar av hörselsidostrukturer vägg av invasiv metods kan också begränsa användningen av ototoxiska medel såsom furosemid eller heptanol, vars specifika zon effekt är begränsad till den platsen. 15,24 Alternativa icke-invasiva metoder såsom trans-trum injektion och parenteral injektion har plågats av opålitliga resultat och / eller systemisk toxicitet till djurmodell. Denna användningsmetod har visat att undvika båda dessa brister, att uppnå en nivå av enhetlighet som närmar sig den av de mer invasiva metoder som diskuteras ovan.
Andra fördelar med denna teknik inkluderar är dess breda användbarhet för ett antal djurmodeller och genomförbarhet att införliva i en befintlig laboratorieinfrastruktur. När det gäller det senare, inga speciella reagenser eller kemikalier behövs bortsett från de valda ototoxiska medel, bedövningsmedel och smärtstillande medel. Ototoxiska medel används typiskt i en fast koncentration och blandades i en tillräckligt stor volym av lösning (5 ml) för att hålla långa tidsperioder övervägaing varje applikation använder ungefär 10 l (hos möss). Således, efter den första upphandlingen av varor och instrument, utredare är relativt fria från tidsödande lösning förberedelse eller frekvent utbyte av material. Denna teknik erbjuder också minskningar av operativ tid, vilket kan ha betydelse i jämförelse med procedurer som involverar implantation av perilymphatic infusionspumpar eller cochleostomies. När den når en nivå av teknisk kompetens, vår genomsnittliga färdigställande tiden från första snittet till nedläggningen var typiskt 20 minuter till 1,5 timmar beroende på hur lång exponering önskas för ototoxiska medlet. Tre eller fyra operationer kan lätt fyllas i på en enda dag, vilket möjliggör ökad effektivitet och ökad risk för att få lyckade resultat. Såsom beskrivits ovan, denna teknik kan också lätt tillämpas på en mängd olika gnagarmodeller inklusive möss, råttor, marsvin och ökenråttor.
Begränsningar med denna metod är centrerade påmåttligt brant inlärningskurva som behövs för att bemästra den och minskad förväntade resultat förrän teknisk kompetens har uppnåtts. Såsom kommer att diskuteras mer i detalj nedan, kommer små fel under kirurgisk metod eller otillräcklig visualisering av det kirurgiska området nästan alltid leder till en dålig prognos. Subtila resultat som en nybörjare kan misslyckas med att erkänna, såsom en sub-millimeter tjock luftbubbla blockerar åtkomsten av medlet till den runda fönstermembranet eller interstitialvätska utspädning av medlet, ta tid att uppskatta och utveckla de psykomotorisk förmåga som krävs för att rätta till dem. Men med upprepat uppträdande av förfarandet dessa hinder är lätt övervinnas och utgör en mindre skrämmande teknisk utmaning för utredare än vissa av de tidigare nämnda invasiva metoder. Slutligen är denna teknik i samband med den relativa begränsningen att cochlea skada endast kan induceras vid en enda tidpunkt under den kirurgiska exponering. Detta kan övervinnas i viss grad, Genom att fylla RWN med absorberbara gelatin svamp indränkt i agenten som beskrevs av Heydt et al. 10 absorberbara gelatinsvamp kommer resorberar över tiden, men kan tillåta en längre exponeringstid än kan uppnås genom tillämpning av en vattenlösning ensam.
För att en utredare för att förverkliga alla fördelar med denna teknik och undvika fallgropar, är det viktigt att erkänna de två kritiska delar av denna teknik: 1) konsekvent upprätthålla visualisering av mellanörat och RWN; och 2) förmåga att hålla kirurgiska området fritt från interstitiell vätska och / eller blod. För att uppnå det förstnämnda av dessa, kan vikten av en ordentlig head-innehavaren inte överbetonas. Säker fixering av djurets huvud ger en stabil utsikt under mikroskop; vars betydelse blir lätt uppenbart när subtila instrumentering drastiskt ändrar positioneringen av strukturer under förstoring. En bra head hållare som kan rotera kring djurets rostralt-caudal axeln underlättar också viktiga dynamiska förändringar i utredarens linje plats. Ofta kan några millimeter rotations om denna axel betyda skillnaden mellan visualisering av RWN och visualisering av endast öron kapsel ben. Förmågan att ständigt förändras uppfattning är också av största vikt att säkerställa interstitialvätska har tagits bort ordentligt från djupet av nisch och även att ototoxiska medlet helt avlägsnas mellan tillämpningar diskuteras i del 5. I vår erfarenhet, blod, kondens, eller interstitialvätska som kommer in i mellanörat utrymmet har förmågan att störa hela experimentet. Detta är inte förvånande, eftersom den lilla mängden ototoxiskt medel appliceras på det runda fönstret (~ 10 l) kan lätt spädas genom att komma i kontakt med även små volymer av främmande vätska. Av denna anledning, noggrann kirurgisk dissektion, bit för bit Avtäcknings av trum bulla och noggrann preservation av stapedial artären är liktydigt med en framgångsrik experimentella resultat.
Om ovanstående kritiska steg observeras och förväntade resultat fortfarande inte uppnås, ska felsökning påbörjas. I vår erfarenhet, är det ofta bra att utföra prov variationer av två formelement. Den första är att ändra frekvensen med vilken ototoxiskt medlet fylls i det runda fönstret. Beroende på medlet som används, är den totala exponeringstiden mellan 30 minuter och en timme, med fullständig uppsugning och senare ersättning av medlet var 10 min. Om exponering för kortare löptider, kan öka de totala exponering tillåta medlet mer tid att diffundera över runda fönstermembranet. Ytterligare exponering och påfyllning kan också bidra till att undvika oönskad utspädning av ototoxiska medlet genom blod, kondensation, eller interstitiell som diskuterats ovan. Försiktighet bör upprätthållas vid användning av denna metod, men eftersom det tenderar att öka risken för oavsiktligly skadar stapedial artären och / eller införa interstitiell fluid till RWN.
Denna teknik är betydelsefullt i vad det erbjuder undersökningar av cochlea fysiologi och patofysiologi. Denna minimalt invasiva tekniken möjliggör detaljerad studie av känsliga biokemiska processer och har varit liktydigt för att främja vår forskning som syftar till att bedöma cochlea regenerativ potential. 12,24 Denna kirurgisk metod och exponering även reproduceras över en mängd andra utlöpare tekniker, och framgångsrika resultat genom att använda detta metod har rapporterats i studier av cochlea stamcells implantation. 14 En stor del fortfarande okänt om snäckan, men denna teknik, tillsammans med den bredare arsenalen tillgänglig för utredarna, kommer att hjälpa till att minska denna kunskapslucka.
Disclosures
Ingen konkurrerande ekonomiska intressen. Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Heptanol 98% | Sigma-Aldrich | H2805 | PubChem Substance ID 24895536 |
| Ketaset Injectable | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Concentrate 100mg/ml |
| (Ketamine HCl) | 10 ml | Schedule CIII controlled substance | |
| Anased Injectable | Lloyd Laboratories | NADA# 139-236 | Concentrate 20mg/ml |
| Buprenex Injectable | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Concentrate 0.3 mg/ml |
| (Buprenorphine HCl) | 5 ampules per box | Schedule CIII controlled substance | |
| Betadine Skin Prep Solution | Medline | MDS093941 | 1 Quart screw top bottle |
| 0.9% Sterile Saline | Variable | For mixing solutions and injections | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | 32192 | |
| Controlled Acoustics Environment Sound Booth | Industrial Acoustics Company | ||
| Surgical Head Holder | Custom Made – | Please see Figure 3 | |
| Medical University of South Carolina | |||
| Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75 inch | World Precision Instruments | 555801L | Maximum spread 20 mm |
| Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder | |||
| 90N Dental Belt Driven Hand Drill | Emesco | Vintage Item | |
| Scalpel Handle Size 6 | Bard-Parker | MEDC-011990 | |
| #15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade | Bard-Parker | SKU: 097-7215 | 50 Blades/Box |
| Via ACE Surgical Supply Code | |||
| Straight Tip Jewelers Forceps | Bernell | MIL17304 | |
| Iris Scissors Curved | Medline | DYND04026 | |
| Iris Scissors Straight | Medline | DYND04025 | |
| Stevens Tenotomy Scissors Straight | Medline | MDG3222111 | |
| Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.00 | Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks |
| Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.01 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | CODE 34155 | White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks. |
| House Ear Curette, 6” shaft, light angle | Medline | MDG0396486 | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100 | Medline | IIS34201 | Substitutions may be made |
| Cotton pellets #3 4 mm | Richmond | Manufacturer Code 100108 | |
| ElectroSurgical Unit 100 E M/M | Elmed | List No. 52-5770 | Bipolar and Monopolar Capable |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle | BD | Product Number: 329410 | Optional for delivery of Ototoxic agent |
| 23G, blunt tip, 1” length needle | Kendall | Product Code 8881202397 | For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery |
| Surgical Mask | U-line | S-10478 | |
| Exam Grade Nitrile Surgical Gloves | U-line | S-12549 | |
| Precision Hair Clippers | Wahl | Multiple models may be substituted | |
| 5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13 mm 3/8 circle needle | Ethilon | 1855G | Substitutions may be made. |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisher | 01-812054 | |
| Dry Sterilizer | ROBOZ | Germinator TM 500 |
References
- Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E.
- Dodson, H. C. Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides. Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).
- Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin. The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).
- Lee, K. S., Kimura, R. S. Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).
- Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).
- Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).
- Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers. Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).
- Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells. Hearing research. 125, 109-119 (1998).
- Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse. Hearing research. 162, 65-74 (2004).
- Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear. Hearing research. 265, 70-76 (2010).
- Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).
- Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).
- Lang, H., et al. Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).
- Stevens, S. M., et al. Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).
- Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing research. 130, 94-107 (1999).
- Hequembourg, S., Liberman, M. C. Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).
- Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to 'primary' loss of cochlear neurons. The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).
- Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).
- Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice. Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).
- Tang, X., et al. Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse. Neuroscience. 259, 184-193 (2014).
- Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).
- Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits. PloS one. 9, e90279 (2014).
- Lang, H., et al. Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).
