Introduction
A engenharia de tecidos utiliza os princípios da biologia e da engenharia, no desenvolvimento de substitutos funcionais para manter, restaurar ou melhorar tecido nativo e. A capacidade de gerar construtos biomiméticos tridimensionais na demanda facilitaria avanços científicos e tecnológicos na engenharia de tecidos, bem como em sensores baseados em celulares, drogas / triagem toxicidade, modelos de tecido ou tumor, e outros. A organização tridimensional das construções da engenharia de tecidos é um componente fundamental do método de fabrico, porque ele deve imitar de perto a interacção altamente organizado de células e matriz extracelular no tecido nativo.
Andaimes tridimensionais biodegradável e formando-forma são factores críticos para a geração de novas construções de tecido porque as células migram para formar uma camada bidimensional de células, mas não têm a capacidade para crescer em favorecida tridimensional. O andaime serve como base temporária para celularadesão e proliferação, por isso deve ser construído a partir de materiais com porosidade controlada e biodegradabilidade, e integrit mecânica suficiente. Os materiais de andaime não deve ser citotóxico ou criar uma resposta adversa do anfitrião. Os hidrogeles têm sido vulgarmente utilizados nas técnicas de engenharia de tecidos, e devido à sua hidrofilicidade, os hidrogéis de permitir o intercâmbio de fluido e gás em toda a estruturação. Ao combinar diferentes hidrogéis, as propriedades do hidrogel sintetizado são modificáveis para cumprir a exigência de aplicação distinta.
A abordagem de engenharia de tecidos convencional envolve a criação de andaimes de sacrifício porosas acelular que são semeadas com células pós-fabricatio. Têm sido empregues várias técnicas, tais como colagem de fibras, moldagem com solvente, e derreter moldagem, mas provou ser bem sucedida minimamente para aplicações de engenharia de tecidos. Métodos de fibra de ligação permitem que as fibras sejam alinhadas em formatos específicos, mas eles só são capazes de pródução muito fina andaime. Métodos de evaporação de solvente produziu construções altamente porosos, no entanto, a maior membrana produzida foi de apenas 3 mm thic. Por conseguinte, a criação de estruturas tridimensionais não é possível utilizar estas técnicas. Técnicas de moldagem Melt foi bem sucedida na produção de suportes tridimensionais, mas tais temperaturas elevadas que são necessários materiais biológicos não pode ser incorporado durante o proces produção. Andaimes semeado pós-fabricação são limitados em sua capacidade de atender aos requisitos de engenharia de tecidos para produzir scaffolds tridimensionais com microestruturas pré-definidos ou controláveis e. Outro grande problema com tecnologias andaime de semeadura sólidos é a deficiência de vascularização e pobres mecânica.
Bioprinting foi estendida para três dimensões através da utilização de não-tóxicos e biodegradáveis, geles termo-reversíveis de superar as desvantagens do convencional. Alguns do sólido freeform fabricação techniques atualmente sendo empregadas são bioprinting e jato de tinta de impressão laser-assistida. Técnicas bioprinting assistida por laser pulsado utilizar uma fonte de laser, uma placa de destino, e um substrato de recepção para gerar tridimensional. No entanto, esta técnica é limitada devido à baixa taxa de transferência, a viabilidade celular baixa, e só pode produzir arranjos limitadas de estruturas fabricadas, porque apenas pré-polímeros foto-reticulável pode ser utilizado para formar um hidrogel reticulado. Impressão de jacto de tinta foi desenvolvido como um método não-contacto, que reproduz os dados de imagem digitais sobre um substrato por deposição de tinta picolitros. No entanto, a impressão a jacto de tinta não produzir uma construção de alta resolução, constrói experiência rápida desnaturação da proteína, e muitas das células são lisadas durante a deposição.
Atualmente, têm sido desenvolvidos novos métodos de fabricação aditiva bioprinting. Nestes sistemas de células, proteínas, factores de crescimento, e os hidrogéis são tipicamente integrados biomiméticos para mater matrizIALS durante o processo de fabricação e simultaneamente depositados utilizando atuadores controlados por computador para gerar estruturas celulares carregados tridimensionais à base de andaime que imitam de perto a microarquitetura de natal. Os hidrogéis de células carregados de constituir o bioink, que pode ser heterogéneo, que consiste em vários tipos de células, ou homogénea. Aditivo sistemas de manufatura depósito bioink gota-a-gota ou camada por camada através de seringas descartáveis e dicas para um palco controlado por computador capaz de se mover nas direções x, ye z. Através de um software de computador, a arquitectura de andaimes impressos pode ser facilmente manipulado, dependendo dos requisitos da aplicação. Ao contrário das técnicas convencionais, tecnologias médicas tridimensionais (ressonância magnética, tomografia computadorizada) podem ser incorporados aos desenhos, gerando construção específica para cada paciente. Estes métodos permitem também a possibilidade de produzir substituições vascularizados porque construções são produzidos com um elevado ldensidade celular ocal, permitindo interacções célula-célula e melhorar a probabilidade de pós-implantação surviva.
A impressora Palmetto é um sistema multi-dispenser tridimensional personalizado construído que usa métodos de fabricação programáveis robóticos para gerar construções de tecido heterogêneos tridimensionais (Figura 1). Ele permite a utilização de uma pluralidade de materiais em combinações únicas para produzir estruturas heterogéneas. A inicialização do bioprinter é um dos passos mais importantes na bioprinting porque permite que você para definir uma variedade de parâmetros para otimizar a capacidade de impressão das construções bioprinted.
O bioprinter compreende um processo tipo de lote com sequências de arranque, operação e encerramento controlado por um controlador lógico programável (PLC), que o usuário opera por meio de um painel de controle de tela interativa sensível ao toque (Figura 1, A). Para evitar a contaminação dos biomateriais lógicos a bioprinter é encerrado em um poli-pressionados positivamente (metacrilato de metilo) (PMMA) com uma câmara de partículas arrestance de elevada eficiência (HEPA) filtrado por sistema de circulação de ar (Figura 1, B, C). O interior da impressora pode ser esterilizada utilizando as fontes de luz ultravioleta embutidos (Figura 1, D). O componente central do bioprinter é um posicionamento robô programável que pode totalmente reprodutível colocar uma ponta conta-gotas com uma precisão de 10 micrometros (Figura 1, E). Existem três distribuidores, os quais são capazes de depositar volumes tão pequenos como 230 nl, utilizando um parafuso rotativo (Figura 1, F). Eles são independentemente programável usando computadores diferentes que regem os parâmetros de impressão para cada distribuidor (figura 1, G). Rotativa de parafuso de distribuição utiliza a rotação de um parafuso motorizado para mover para baixo bioink uma seringa e para fora da ponta da seringa. Estes distribuidores são montados em um pneumáticoNest Ferramenta LY controlada (Figura 2A, B), permitindo que o robô para alternar distribuidor montada sobre o braço robótico do eixo Z sob controlo programado (Figura 1, H).
O robô XYZ recebe instruções de impressão a partir de um computador que executa o software de desenho (Figura 1, I). Cada programa contém os locais de distribuição, rotinas e protocolos de calibração, dispensador de mudança. O desenho das construções gerados essencialmente consiste na coordenadas XYZ, onde cada dispensador vai depositar material. O bioprinter compreende dois sensores de luz ópticos (Figura 2C) que determinam a coordenadas XYZ da extremidade da ponta da seringa. Estes sensores enviam informações para coordenar o robô, que os utiliza para calcular as posições das extremidades ponta distribuidor. Há um laser de deslocamento adicional (Figura 2D) que projeta um diodo 633 nm feixe de laser vermelho de tamanho de ponto 30 x 100 micrômetros para medir a distância com um accuracy de 0,1 micrómetros. Quando o feixe está altamente focada o robô determina a distância Z da superfície de impressão. Esta medida, ea medida sensores de luz óptica da extremidade da ponta em Z, permite o cálculo de Z coordenadas precisas usada para colocar a ponta do aplicador em relação à superfície de impressão. As pontas do distribuidor mover-se lateralmente e verticalmente através do sensor de luz óptica X-eixo orientado para localizar os centros de Y e Z, e lateralmente por meio de um sensor do eixo Y para encontrar o centro do eixo-X. A superfície de impressão é mapeado utilizando a fórmula para uma superfície plana no espaço XYZ: ax + by + cz = d para determinar onde a superfície é em relação à posição da extremidade da ponta de distribuição. A fase de impressão (Figura 1, J) contém uma amostra de uma placa de Petri até 80 mm de diâmetro e utiliza um banho de água com recirculação para manter a temperatura definida (Figura 1, K). Temperatura estágio pode ser ajustado dentro de uma gama de -20 e permanece estável dentro. Há uma câmera USB montadopara o Z-braço robô para proporcionar uma vista ampliada da ponta de aplicação durante o processo de impressão (figura 1, G). Há uma segunda câmara montada na direcção do topo do interior da câmara, que fornece uma visão completa do bioprinter durante o processo de impressão (figura 1, G).
Um software de desenho auxiliado por computador determina o padrão de deposição e permite ao usuário gerar gotículas espaçadas de forma incremental e estruturas complexas (Figura 3). Vias tridimensionais pode ser codificado manualmente no software de desenho de impressora compatível ou importados de um software separado auxiliado por computador desenho (Figura 4, Tabela 1). O software da impressora compatível permite variações de parâmetros de impressão, tais como o método de deposição (deposição ou deposição de gotícula única passagem contínua), a geometria tridimensional das vias, a taxa de deposição, distância entre a extremidade da ponta da seringa e substtaxa de superfície de impressão, a quantidade de tempo para depositar uma gota indivíduo, e a altura e acelerar a seringa é levantada entre a deposição das gotas. Cada programa contém XYZ locais de distribuição, rotinas de calibração ponta e protocolos de dispensador de mudança para proporcionar um ambiente estéril, sem intervenção do operador, durante a impressão. O controlador lógico programável (PLC) do robô recebe instruções do computador que executa o software de desenho e controla o tempo dos eventos dos controladores externos (por exemplo, os distribuidores). Para fazer isso, o PLC utiliza um mecanismo de loop para controlar os dispensadores , dispositivo de posicionamento robótico, e fatores ambientais.
Tridimensional bioprinting e gravação directa utilizando um parafuso rotativo, sistema de distribuição de líquido permite que o processo de depósito de células para ser mais eficiente, precisa e mais fácil do que métodos anteriores. Este estudo mostra a bioprinter personalizado construído é capaz de gerar ceconstruções de hidrogel ll-carregado com alta viabilidade celular.
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Protocol
1. Preparação de gelatina substrato contendo for Three-Dimensional bioprinting de hidrogéis de alginato
- Prepara-se o substrato de cálcio / gelatina seguindo o método do substrato de cálcio / gelatina descrita por Pataky et al 11 para evitar a viabilidade reduzida associada com alto teor. O método de substrato de cálcio / gelatina é listado abaixo.
- Combinar cloreto de cálcio di-hidratado (1,5% em peso), de cloreto de sódio (0,9% em peso), e gelatina porcina (2% em peso) em água destilada e ferver durante 2 minutos para criar uma solução de gelatina a 100 mM.
- Pour 5 ml da solução de gelatina / cálcio em 100 mm placas de petri padrão, agite a solução volta para ter um revestimento uniforme sobre a superfície, e o lugar sobre uma superfície plana no frigorífico de gel de O / N (permitir a gel, pelo menos, 8 hr antes de usar).
- Para aumentar a opacidade da superfície do substrato, adicionar dióxido de titânio (0,3% em peso) para o / CaCl2 solução de gelatina. Agita-se durante 10 min. Autoclave a solução de gelatina / TiO 2 no ciclo de líquidos durante 30 min para esterilizá-lo.
- Adicionar 3 ml de o / TiO2 solução de gelatina para a superfície das placas de gelatina preparados anteriormente. Agite a mistura para garantir que ele é espalhado uniformemente por toda a superfície. Deixa-se em gel a 4 ° C frigorífico S / N (permitir a gel, pelo menos, 8 horas antes da utilização). Os substratos deve ser utilizado no prazo de 3 dias.
2. O alginato Oxidação
- Oxidar o bioink alginato de sódio seguindo o método de alginato parcialmente oxidado por Bouhadir et al 30 descrito abaixo.
- Para fazer uma solução de alginato oxidado 5%, dissolve-se 1 g de alginato de sódio em 100 ml de água destilada. Adicionar uma solução aquosa de periodato de sódio (0,25 M, 0,25 mmol), o agente de oxidação, para produzir uma solução 5% de oxidação. Agita-se durante 19 horas à temperatura ambiente. Adicionar 40 ml de etileno-glicol à solução depois de 24 horas para acabar o Reaction.
- Dissolve-se 2,5 g de cloreto de sódio na solução. Adicionar uma quantidade em excesso de álcool etílico (2: 1) para precipitar os alginatos oxidados. Centrifugar a solução a 1.000 x g para recolher os precipitados e re-dissolve-los em água destilada. Repita a lavagem de etanol.
- Liofilizar as pelotas de alginato oxidados e armazenar a -20 ° C até estar pronto para utilização.
- Determinar o grau de oxidação através da medição da percentagem de periodato de sódio, antes de ser consumido terminada pela etileno glicol.
- Prepara-se uma solução de iodeto de potássio (20% w / v, tampão de fosfato pH 7,0 de sódio) e uma solução thyodene (10% w / v, tampão de fosfato de sódio pH 7,0). Misturar as duas soluções com o alginato oxidado à TA.
- Cair gradualmente a solução de periodato de alginato de sódio e reagiu na mistura de soluções de iodeto de potássio e theodyne. Medir a absorvância da mistura a 426 nm espectrofotometricamente. Quando se atingiu ummáxima, registrar o volume utilizado de solução de periodato de alginato de sódio e como V 1.
- A reacção é
. A quantidade de periodato de sódio que não reagiu é 
- Subtrair a quantidade de periodato de sódio que não reagiu a partir da concentração inicial para determinar a quantidade de periodato de sódio consumido. Usando a fórmula anterior, determinar o grau de oxidação final do alginato.
. A quantidade de periodato de sódio que não reagiu é 
3. O alginato Peptide Conjugação
- Ligandos conjugados com uma sequência de arginina-glicina-aspartato exposta (péptido) para dentro do alginato oxidado previamente preparado seguindo o método de conjugação de RGD por Alginato Rowley et al 31 descrito abaixo para promover a adesão e espalhamento.
- Use carbod aquosaquímica iimide com G 4 RGDSPto conjugado 31.
- Dissolve-se 1 g de 5% de alginato oxidado em um 0,1 M de 2- (N-morfolino) etanossulfónico (MES), pH = 4. Adicionar 1-etil- (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, 0,54 mmol) e N-hidroxissuccinimida ( NHS, 0,27 mmol) a 2: 1 para formar a amida intermediária.
- Adicionar 0,28 mmol de péptido, para acoplamento a espinha dorsal do polímero através de alginato a amina terminal. Agita-se à temperatura ambiente O / N.
- Parar a reacção de acoplamento por adição de cloreto de sódio a 2,5 g para a solução. Adicionar uma quantidade em excesso de álcool etílico (2: 1) para precipitar os alginatos oxidados. Centrifugar a mistura a 4000 xg durante 5 min para recolher os precipitados. Aspirar a mídia na capa de cultura de células e re-dissolver os precipitados em água destilada. Repita a lavagem de etanol.
- Liofilizar os precipitados até que se torne completamente secas (aparecerá como uma substância em pó branca) e armazenar na temperatura de -20 ° C frigorífico para mais tardeusar.
4. adiposo humano estromais Tissue células de cultura celular (de hADSC)
- Culturas adiposo humano de células estromais de tecido (de hADSC) em 75 cm tratados frascos de cultura de células (frascos T75), coberto com 15 ml de baixo DMEM de glucose com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de glutamina, e 1% antimicina. Alterar a mídia, na capa de cultura de células, a cada dois dias até que tenham atingido a confluência (80-90%).
- Uma vez confluentes, as transferir para frascos T75 a capa de cultura de células e suspender o hADSC utilizando o método de digestão com enzimas de tripsina.
- Na capa, aspirar todo o meio de cultura de células fora das células. Lavar com 5 ml de fosfato de Dulbecco com Solução Salina Tamponada com cálcio e magnésio (DPBS ++). Aspirar o DPBS ++ fora das células.
- Enquanto no capô, fazer uma solução de tripsina e DPBS ++ pela mistura de 1 ml de tripsina e 4 ml DPBS ++. Cada frasco de 5 ml de requer a solutde iões, assim que o volume apropriado para o número de frascos confluentes. Adicionar 5 ml de tripsina / ++ DPBS a cada frasco e colocá-los na incubadora durante 2 min.
- Após 2 min, retire os frascos e bata levemente os lados deles para soltar as células a partir do fundo. Veja cada frasco sob um microscópio para garantir que as células são suspensas. Colocar os frascos de volta no capuz de cultura de células e adicionar 3 ml de meio de cultura celular adequado a cada frasco. Isto termina a reacção de tripsina.
- Transfira a mídia celular carregado de cada frasco e colocar em um cônico de 50 ml. Centrifugar a 1.000 xg los durante 5 min. As células devem aparecer como um pequeno sedimento branco no fundo do cone. Transferência de volta para a capa de cultura de células e aspirar a mídia. Ressuspender as células em 2 ml de meio de cultura celular.
- Contar as células utilizando um hemocitómetro sob o microscópio. Uma vez que as células foram contadas, na capa de cultura, a quantidade aliquota de meio contendo ~ 1,3 million células e transferência para um cônico de 15 ml. Centrifugar a cónico de 15 ml contendo as células mais uma vez durante 5 min a 1000 x g.
- Na capa de cultura, propagar novamente as células restantes em vários frascos T-75, a adição de uma concentração de ~ 350.000 células de cada frasco. Adicionar 15 ml de meio DMEM e retornar à incubadora até confluente novamente.
- Uma vez que o ciclo de centrifugação é completa, o regresso cónico de 15 ml para a cultura de células. Aspirar a mídia do pellet celular e resuspender as células em solução aquosa de alginato a uma concentração de 1,3 milhões de células por mililitro de bioink, terteriating a solução muitas vezes para que haja uma distribuição homogênea de células de todo o bioink. Coloque a solução de células-laden em um estéril seringa de 3 ml e impressora compatível com o parafuso na estéril 22 G ponta de plástico.
5. Configuração bioprinter
- Ligue o bioprinter, cada um dos computadores de dispensador, e o recirculating banho de água.
- Definir manualmente a temperatura do banho de recirculação de água para para o mecanismo de gelificação.
- Manualmente definir parâmetros de impressão para cada distribuidor no computador correlacionando distribuidor. Definir o volume de distribuição a 230 nl, número de backsteps a 0, e a taxa de distribuição de 10 ul -sec.
- Abra o software de projeto e do programa para a visualização de visor da câmera USB no computador.
- Usando o software, insira manualmente as coordenadas para uma matriz de 5 x 5 dot com 2,4 mm de espaçamento entre as quedas.
- Defina os parâmetros de impressão a ser: distância entre a extremidade da ponta e da superfície do substrato = 0,1 mm; altura seringa é levantada entre as deposições = 20 mm; a quantidade de tempo por deposição = 1 seg.
- Salve o programa e enviá-lo para o robô.
- Colocar a cápsula de gelatina / TiO2 molecular contendo Petri na etapa 4 ° C impressora. Feche e tranque a porta da câmara.
- Use o PLC para initialize as fontes de luz ultravioleta, e esterilizar a câmara durante 90 seg.
- Uma vez que a esterilização é completa, abrir a câmara e carregar a seringa contendo de hADSC suspenso em alginato em Gun 1. Feche e tranque a porta da câmara.
- Use o PLC para ligar o sistema de ventilação, espere 30 segundos para a pressão interna equilíbrio.
- No computador, execute o programa que contém os parâmetros de impressão via e geométricas.
- Durante todo o processo de impressão, visualizar o visor da câmera USB no computador para confirmar a impressão precisa e uniforme.
- Uma vez que a impressão terminar, deixe as construções de gel durante 40 min.
Avaliação de Viabilidade 6. celular
- Cubra as construções que não estão indo a ser trabalhada imediatamente pós-impressão em DMEM e guarde na incubadora até à hora de imagem.
- Para quantificar a viabilidade das construções, mancha-los utilizando um ensaio de viabilidade / citotoxicidade fluorescente à base, umaimagem nd usando microscopia confocal.
- Seguindo as instruções do kit, preparar uma solução de coloração contendo calceina AM e homodimero de etidio-1. Para fazer 10 ml de solução de coloração, adicionar 20 ul da etídio homodímero-1 e 5 ul de calceína am a 10 ml de solução estéril, tamponada com fosfato salino de cultura de tecidos de grau de Dulbecco (+ magnésio, + cálcio; DPBS ++).
- Mergulhar os construtos bioprinted na solução de coloração, durante 15 minutos no escuro.
- Imagem as construções coradas utilizando um sistema de microscópio confocal nos dias 0 e 8. Tire várias fotos de cada construção bioprinted, usando parâmetros Z-stack de 30 fatias ópticos sobre uma profundidade de 300 mm, e contar manualmente as células. Se as células aparecem amarelo ou contá-los como verde vivo, e se vermelho, contá-los como mortos.
- Calcula-se a percentagem de viabilidade celular, como o número de células vivas a dividir pelo número total de células na construção; Viabilidade celular = número decélulas vivas (verde + amarelo) / número de células totais (verde + amarelo + vermelho) x 100%.
- Calcula-se a quantidade de proliferação de células para cada amostra como o número de células do dia 8, dividido pelo número de células no dia 0; Proliferação celular = contagem de células vivas no dia 8 / células vivas contar no dia 0 x 100%.
7. RGD Peptide Análise Conjugação
- Para analisar o sucesso de RGD peptídeo conjugação com o alginato, compare alginato RGD-conjugado e alginato não conjugado. Para fazer isso, as construções de imagem impressos utilizando (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole, dicloridrato) (DAPI) e faloidina manchas.
- Adicione os phalloidins solução de trabalho por diluição de 5 ul da solução-mãe metanólica com 200 mL de DPBS ++. Armazenar a -20 ° C até o uso.
- Adicione uma solução de 300 uM de estoque a mancha DAPI seguinte equação: (0,10509 g / L) / (350,3 g / mol) = 3 × 10 -4 M = 0,0003 M = 0,300 mm = 300 uM. Faça the DAPI solução de trabalho por diluição da solução-mãe de 1: 100 em DPBS ++ para se obter 3 uM solução. Armazenar a -20 ° C até o uso.
- Completamente imersa a amostra em paraformaldeído a 4%. Incubar durante 1 h à TA. Lavar três vezes com DPBS ++, permitindo que a solução em repouso durante 5 min cada lavagem. Transfira a amostra em gel a partir do bem para uma lâmina de vidro, que lança sobre o gel no processo. Mergulha-se o gel em 0,1% de Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) em DPBS ++ durante 10 min. Lavar três vezes com DPBS ++, permitindo 5 minutos para cada lavagem.
- Corar as construções impressas com faloidina por imersão na solução de trabalho. Cubra com papel alumínio e incubar durante 4 horas. Remover a mancha faloidina e lavar três vezes com DPBS ++. A primeira lavagem deve ser rápido, o último lavagens deve sentar-se durante 5 minutos cada.
- Corar as construções impressas com DAPI por imersão na solução de trabalho DAPI. Cubra com folha e incubar à TA durante 30 min. lavagemtrês vezes com DPBS ++, permitindo que cada lavagem para se sentar por 5 min. Observe e imagem das amostras em um sistema de microscópio confocal.
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Representative Results
Os resultados demonstram a bioprinter é capaz de depositar hidrogéis de células carregadas em localizações tridimensionais específicas com precisão e de forma consistente utilizando software auxiliado por computador. Estes softwares determinar a colocação de cada gotícula e controlar muitos dos parâmetros para a distribuição (Figura 3,4). A repetibilidade do bioprinter para depositar apropriadamente biomateriais é fundamental para o seu sucesso em aplicações de engenharia de tecidos.
A viabilidade das células, um dos requisitos de uma técnica bioprinting bem sucedida, foi analisada 1 hora e 8 dias pós-impressão. Alta viabilidade celular é essencial para a fabricação de construções biomiméticos e é uma representação direta de um bioink adequada. RGD peptídeo conjugação melhora a viabilidade celular durante longos períodos de tempo, promovendo a célula se espalhando. Microscopia de fluorescência foi utilizada para quantificar a viabilidade celular em construções após o processo de impressão. Bioink alginato com uma concentrção de 15% e a oxidação de 5% teve um dia 0 viabilidade de 98%, dia 4 de 96%, e no dia 8 de 95% (Figura 5). Estes resultados indicam a técnica de deposição do bioprinter-escrita directa extrude células suavemente suficiente para produzir construções que permanecem viáveis durante e após o processo de impressão (Figura 1, 2). A viabilidade celular elevada mostra a oxidação de 5% e 15% de alginato de concentração bioink era um veículo adequado para a deposição de células e proporcionou um ambiente adequado para a sobrevivência da célula-. As contagens de células similares em cada uma das áreas de células mostraram uma distribuição homogénea no bioink alginato, um aspecto fundamental da resolução de impressão.
A maioria dos tecidos têm combinações complexas e gradientes de constituintes da matriz extracelular, cada um com influências biológicas e mecânicas específicas. Um biomaterial deve ser biomimética da ambiente nativo e facilitar as funções celulares. A elevada porosidade do andaime permite que o alginatocélulas de comunicar e se relacionar com os outros, e também pode facilitar o fluxo de nutrientes e metabolitos entre a escora e do seu ambiente circundante. A adesão celular à matriz extracelular é uma fase preliminar de formação de tecido que ocorre a proliferação de células antes e a organização de moléculas de matriz extracelular no tecido funcional. A proliferação de células desempenha um papel vital na cicatrização de feridas e crescimento de tecido, e é, portanto, um factor muito importante para a análise construções bioprinted para aplicações de engenharia de tecidos. O alginato melhorada aderência celular RGD conjugado em estruturas impressas, levando à melhoria da propagação e proliferação celular. A proliferação das células dos andaimes impresso foi quantificada por contagem de três áreas separadas nos dias 0 e 8 (Figura 6). A proliferação das células em geral verificou-se ser 219,674% após 8 dias de cultura. Estes resultados significam o andaime tem biocompatibilidade adequada a ser utilizada umamatriz extracelular sintético sa para a entrega de células para reparar tecidos danificados ou não-funcionais.
Para analisar o êxito da RGD péptido conjugação na bioink alginato, uma experiência de comparação foi realizada usando células de carga, de RGD conjugado concentração de 15%, 5% bioink oxidação alginato e célula-carregado, não-conjugado concentração de 15%, 5% oxidação bioink alginato. Coloração DAPI para núcleos e a coloração para actina de faloidina foram usadas para analisar o espalhamento das células em construções impressas no dia 8. As imagens de cada amostra (pelo menos, três imagens aleatórias por amostra) foram tomando utilizando um sistema de microscópio confocal utilizando parâmetros Z-pilha de 30 fatias ópticos sobre uma profundidade 300 (Figura 7). O espalhamento das células mostrado na amostra com alginato de RGD conjugada comprova a incorporação bem sucedida do péptido sobre o alginato. A migração celular é um passo importante no desenvolvimento de tecido; Por conseguinte, a conjugação de péptidos RGD em alginato melhora a likelihood da aplicação in vivo utilizando este bioink.
Figura 1. Palmetto Impressora. Controlador Lógico Programável coordena as ações de todas as funções da impressora (A). Uma câmara de contenção estanque (B) com a ingestão filtrada (C) e escape (C) mantém uma pressão positiva interna regulado para reduzir a possibilidade de contaminação. Luzes UV duplo (D) montado no tecto da câmara pode ser programado para operar em intervalos de segurança. Um Janome 2300N XYZ robô (E) é programado e controlado por um computador integrado (I). Três controladores de distribuidor (G) são programados para regular a saída de armas dispenser (F) disponíveis para serem carregados no braço do eixo Z robô (H) sob o controle do computador. A temperatura do suporte do robô de amostra (J) está situado entre 4 e 40 ° C por um controlador de banho de água (K). Câmeras digitais duplos (L) estão disponíveis t o monitorar a atividade da impressora e formação de amostra. Uma câmera é montada no braço do eixo Z robô e fornece uma imagem ampliada da ponta do dispensador da arma carregada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ninho Tool, Óptica Sensores e deslocamento Laser de bioprinter. A. descarregado vista ninho ferramenta de frente. B. Loaded vista ninho ferramenta de frente. C. ótica Sensores de medição da extremidade da ponta de distribuição no espaço tridimensional. D. Distância laser de medição coordenada Z da superfície de impressão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Visual PathBuilder Software. Imagem do software desenho auxiliado por computador usado para projetar a arquitetura externa das construções bioprinted. Este programa proporciona a capacidade de gerar gotículas espaçadas de forma incremental e geometrias complexas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. JR-C Software Points. Screenshot do software de design de impressora compatível. Este programa permite que o usuário controle o método de deposição (isto é, deposição única gota ou deposição via contínua), a velocidade de deposição, distância entre a extremidade da ponta da seringa e impressão su bstrate superfície, o tempo previsto para a deposição de cada gota, ea colocação tridimensional de gotas (consulte a Tabela 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Imagem fluorescente de Stained hADSCs Pós-Impressão viabilidade celular. / Citotoxicidade imagens fluorescentes de hADSC de em construção bioprinted tomado usando um sistema de microscópio confocal (parâmetros Z-stack de 30 fatias ópticos mais de uma profundidade) depois de 0 (A) e 8 ( B) dias. O hADSC foram rotulados de pós-impressão usando um ensaio de viabilidade celular / citotoxicidade mamíferos. Células vivas estão manchadas verde, e as células mortas são manchadas de vermelho."Target =" _ blank 3156fig5large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. As viabilidades quantificada de Bioprinted constructos. O número de células vivas e mortas foi quantificada utilizando um ensaio de viabilidade / citotoxicidade. As contagens de células mortas / ao vivo para o dia 0 é mostrado em (A), e as contagens do Dia 8, em (B). O número de células vivas contadas para cada área nos dias 0 e 8 são mostrados em (C) e foram usadas para quantificar a proliferação das células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Comparação de Cell-Laden, Nno conjugado e RGD Conjugado alginatos. As imagens fluorescentes de bioprinted hADSC de em não-conjugado (A), e em RGD-conjugado (B) 15% de concentração de 5% de oxidação de alginato bioink feita utilizando um sistema de microscópio confocal (parâmetros Z-pilha de 30 fatias ópticos sobre uma profundidade). O hADSC de foram coradas com faloidina e DAPI manchas para analisar a célula se espalhando em cada uma das construções. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tabela de Comandos | |
| Comando | Response Robot |
| PTP Ponto | Move braço robótico para posiiton indicada em X, Y, Z espaço |
| Find_Base_Z | Usa o laser para medir DOENTE tele impressão de superfície do substrato; A distância entre a extremidade da ponta da seringa e a superfície do substrato é ajustado manualmente. |
| Trabalhar Adj. Não. (Trabalho Número de Ajuste) | Comandos robô use a laser SICK (para a determinação da superfície do substrato), 1 Gun, Gun 2, ou 3 Gun. |
| Get_1 | Comandos robô ot recuperar e carregar Gun 1 |
| Find_Tip1_YZ | O robô encontra a extremidade da ponta da pistola 1 em Y e Z |
| Find_Tip1_X | O robô encontra a extremidade da ponta da pistola 1 na direcção X |
| Ponto Dispense | O robô irá dispensar uma gota de bioink no determinado X, Y, Z posição |
| Pallet No. (Número Pallte) | Incorpora um design codificadas manualmente para impressão, por exemplo, uma matriz. |
| Dispense Tempo | É o tempo previsto para a deposição de cada gota individual. </ td> |
| Store_1 | Comanda o robô para retornar Gun 1 para o toolnest, e retornar à posição inicial: (0,0,0). |
Tabela 1. programáveis Computação comandos de software. Esta carta descreve os comandos de software de computador programável, que são usados para controlar o braço robótico e otimizar os parâmetros de impressão.
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Discussion
O foco principal da engenharia de tecidos é fazer a ponte entre a escassez de órgãos e necessidades de transplante através do desenvolvimento de substitutos biológicos capazes de restaurar, manter ou melhorar a functio tecido nativo. Isto levou à fabricação directa de andaimes com um complexo, geometria externa anatomicamente correcto, e o controlo preciso sobre a geometr interna. Bioprinting tridimensional é um método utilizado para gerar as construções tridimensionais de vários tamanhos e formas a partir de um modelo digital usando um Approac camada-por-camada. A fabricação de construções biomiméticos tridimensionais desempenha um papel essencial no avanço da engenharia de tecidos.
Existem aspectos críticos do processo de design que impactam functio biomimético da construção gerado. A capacidade de controlar a temperatura do substrato e o biomaterial é essencial para o mecanismo de gelificação dos hidrogeles e a manutenção da sua mepropriedades biomecânicas, que influenciam, por conseguinte, a distribuição de células, proliferação, diferenciação e dentro do hidrogel. Órgãos consistem em muitos tipos de células, de modo que os vários dispensadores são críticos para a produção de estruturas de tecido, do tipo heterogéneos. A computer-aided design da arquitetura externa permite a produção de substitutos de tecidos personalizados para feridas ou tecidos distintos. Isto é essencial para o desenvolvimento de substituições específicas do paciente. A arquitectura interna é igualmente importante porque afecta as relações célula-célula no interior da estrutura através da colocação das células apropriadas em contacto íntimo uns com os outros e permitindo-lhes para formar in vivo -like junções célula-célula. A colocação precisa de células determina como as células de comunicar e se relacionar com os outros para formar redes vasculares e imitar a sua bioactividade em tecidos nativos. Bioprinting tridimensional proporciona células dispersas de forma homogénea dentro do bioink, bem como uma excelente precisão espacial em placement das células. Scaffolds gerados também têm altas densidades celulares locais, o que é essencial para a diferenciação celular e na formulação de matriz extracelular.
Apresentado aqui é um bioprinter 3D robótico que fiável e consistente dispensa gotas homogêneas de células individuais ou de células misturadas com hidrogel biomimético. Bioprinters similares usaram uma tecnologia de pré-fusão. De acordo com a hipótese de adesão diferencial, células individuais, quando colocado num dispositivo de molde ou semelhante, se fundirão e organizar com base na concentração e distribuição de moléculas de adesão na célula surfac. Estes dispositivos criar varetas pré-fundido ou outras formas geométricas que são, então, carregados no distribuidor e colocados em estreita proximidade com outras barras de pré-fundidos ou pré-fabricados, os quais, em seguida, fundem-se uma Shap geométrico maior. Geometrias finais estão limitados pelo que pode ser construído a partir de estas entidades pré-fabricados. O bioprinter implementado aqui compreende uma única temperaturaambiente controlado, em que as células e as misturas de células de hidrogel não estão limitados pela necessidade de pré-fusão. Sob estas condições, o bioprinter não é unicamente dependente da hipótese de adesão diferencial. A inclusão de materiais de hidrogel pode ajudar a guiar a distribuição celular e permitir que as células a fundir, ou não, dependendo das propriedades desejadas para a experimentação específica. A selecção de hidrogeles biomiméticos para a célula-encapsulação também tem um profundo efeito sobre o fenótipo da célula. Os materiais são conhecidos por terem um efeito sobre a fixação das células, assim como o tamanho das células e morpholog. As características reológicas, como viscosidade, de hidrogéis ditar a sua influência sobre as microenvironmen celulares. Alginato nativo é inerte e não se comunica facilmente com células que participam no controlo do fenótipo. No entanto, usando alginatos que são quimicamente modificados por conjugação péptido e oxidação, as construções resultantes exibem degradabilidade controlada e aumentada de célulasfixação, migração e proliferatio. Alterando as propriedades físico-químicas de um biomaterial pode influenciar developmen tecido.
Bioprinting tridimensional utilizando um fluido de distribuio, máquina e gravação directa é limitado pelo grau de resolução das construções de impressos, a disponibilidade de materiais de hidrogel, a morte celular pós-impressão inicial, e a capacidade para vascularizar o biomimética. Uma característica importante do bioprinting é a sua resolução. Cada método de impressão é definido pelo menor tamanho limite técnico dos menores detalhes realizáveis. Há uma relação dinâmica entre o tamanho limite inferior e escala atingível da construção impressa: quanto maior a resolução dos detalhes minuciosos, menor construção máximo. O bioprinter é capaz de depositar volumes tão pequenos quanto 230 nl em padrões altamente específicos e organizados, dando-lhe uma resolução maior do que máquinas semelhantes. Os hidrogéis foram comumente usado em bioprinting devido à suahidrofilicidade, a biocompatibilidade, a semelhança estrutural com a matriz extracelular, e facilidade de modificatio. O alto teor de água de hidrogéis melhora a sua biocompatibilidade, mas reduz muito a sua resistência mecânica e. Existe uma falta de hidrogéis ideais com as propriedades mecânicas apropriadas para a entrega de fluidos durante o fabrico bioaditivo-extrusão. Por conseguinte, existe uma grande procura para o desenvolvimento de hidrogéis que são imunologicamente inerte, possuem mecanismos de gelificação cytocompatible que pode ser extrudida com sucesso usando distribuição de fluido, e também produzem uma matriz de células carregadas com um intervalo óptimo de mecânica. Antes do processo de impressão, o hidrogel bioink-célula carregado deve ser armazenada em seringas para uma quantidade de tempo, de comprometer a célula. Durante o processo de impressão, a tensão de cisalhamento induzido nas células durante a extrusão também pode ser prejudicial para o seu. O bioprinter é capaz de produzir (> 90%) construções altamente viáveis, ultrapassando assim o problema de initial morte celular. Vascularização desempenha um papel fundamental na transmissão, de apoio, ou preservar a função biomimética de bioprinted. A difusão do oxigênio é m; Por conseguinte, na maior bioprinted constrói a hipóxia é um. As técnicas convencionais são incapazes de produzir construções com vasculatura incorporado, limitando bastante o tamanho de andaimes produzíveis. A avaliação da viabilidade das células do bioprinter mostrou proliferação celular significativa nas construções de impressos ao longo de 8 dias. Portanto, a técnica demonstra a sua capacidade para gerar suportes que permitem o crescimento celular, a comunicação, e a formação de redes, os requisitos de vascularização.
O bioprinter proporciona a capacidade de utilizar uma variedade de materiais para depositar rapidamente hidrogéis de células carregadas em padrões específicos. Embora esta técnica produz estruturas heterogéneas com propriedades ajustáveis, que é incapaz de deposição simultânea e mistura reactiva. Para alguns tipos de biomateriais, esta deposição metHod iria melhorar o mecanismo de gelificação e para encurtar o tempo de andaime produçõe. A adição de um distribuidor multi-seringa pode permitir uma gama mais ampla de biomateriais para a técnica biofabrication. Investigação da actividade celular em construções bioprinted durante um longo período de tempo, iria fornecer mais informações sobre as características de hidrogel, a formação da rede celular, vascularização e das construções.
O método de deposição de bioprinter descrito pode ainda envolver roboticamente posicionamento e de condução das três distribuidores para depositar uma pluralidade de materiais biológicos para o topo de materiais previamente depositados num padrão predeterminado. Este passo pode ser repetido utilizando padrões ascendente até que um órgão tridimensional ou tecido é produzido. Por conseguinte, a impressora Palmetto é apropriado para distribuir de forma fiável os hidrogéis de células carregadas para criar uma construção tridimensional que é capaz de reter a vasculatura e a viabilidade celular elevada, e poderiaser utilizado em aplicações de engenharia de tecidos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Suporte Governo sob Grant No. EPS-0903795 concedidas pela Fundação Nacional de Ciência, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), e Grant 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37 °C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37 °C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80 °C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80 °C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37 °C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37 °C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20 °C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20 °C until use |
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