Introduction
La ingeniería de tejidos utiliza los principios de la biología y la ingeniería en el desarrollo de sustitutos funcionales para mantener, restaurar o mejorar tejido nativo y. La capacidad de generar construcciones biomiméticos tridimensionales en la demanda que facilitaría los avances científicos y tecnológicos en la ingeniería de tejidos, así como en los sensores basados en células, drogas / detección de toxicidad, modelos tisulares o tumorales, y otra. La organización tridimensional de construcciones de ingeniería tisular es un componente fundamental del método de fabricación, ya que debe imitar de cerca la interacción altamente organizada de las células y la matriz extracelular en el tejido nativo.
Andamios tridimensionales biodegradables y forma de formación son factores críticos en la generación de nuevas construcciones de tejido ya que las células migran para formar una capa de dos dimensiones de las células, pero carecen de la capacidad de crecer en favorecida tridimensional. El andamio sirve como una base temporal para la célulael apego y la proliferación, por lo que debe ser construido a partir de materiales con porosidad y biodegradabilidad controlable, y suficiente integrit mecánica. Los materiales de andamiaje no deben ser citotóxico o crear una respuesta adversa del huésped. Los hidrogeles han sido utilizados comúnmente en las técnicas de ingeniería de tejidos, y debido a su hidrofilia, los hidrogeles permitir el intercambio de líquido y gas en todo el structur. Mediante la combinación de diferentes hidrogeles, las propiedades del hidrogel sintetizados se pueden modificar para cumplir el requisito de aplicación distinta.
El enfoque de la ingeniería de tejidos convencional consiste en la creación de andamios porosos de sacrificio acelular que se sembraron con células post-fabricatio. Muchas técnicas se han empleado, tales como unión de fibras, colada con disolvente, y se funden piezas de fundición, pero resultó ser mínimamente éxito para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Métodos de unión de fibra permiten fibras para estar alineados en formas específicas, sino que sólo son capaces de producing andamio muy delgada. Métodos de fundición de disolvente produjeron construcciones altamente porosas, sin embargo la membrana producido más grande fue sólo de 3 mm thic. Por lo tanto, la creación de construcciones tridimensionales no es factible el uso de estas técnicas. Técnicas de moldeo en estado fundido tuvieron éxito en la producción de andamios tridimensionales, pero se requieren temperaturas tan altas que los materiales biológicos no pueden ser incorporados durante el proces de producción. Los andamios sembrados después de la fabricación están limitados en su capacidad para cumplir los requisitos de la ingeniería de tejidos para producir andamios tridimensionales con microestructuras pre-definidos o controlables y. Otro problema importante con las tecnologías de siembra andamio sólidos es la deficiencia de la vascularización y la mala mecánica.
Bioprinting desde entonces se ha extendido a tres dimensiones mediante el uso de, geles termo-reversible no tóxicos y biodegradables para superar las desventajas de la convencional. Algunos de los sólidos de forma libre fabricación techniques siendo empleadas actualmente son bioprinting y de inyección de tinta de impresión láser asistida. Técnicas bioprinting asistida por láser utilizan una fuente pulsada láser, una placa de destino, y un sustrato de recepción para generar tridimensional. Sin embargo, esta técnica está limitada debido a la baja el rendimiento, la viabilidad celular baja, y sólo puede producir arreglos limitadas de estructuras fabricadas porque sólo prepolímeros fotorreticulables pueden ser utilizados para formar un hidrogel reticulado. La impresión de inyección de tinta fue desarrollado como una metodología sin contacto que reproduce datos de imagen digital sobre un sustrato mediante el depósito de tinta picolitros. Sin embargo, la impresión de inyección de tinta no produce un constructo de alta resolución, construye experiencia rápida desnaturalización de las proteínas, y muchas de las células se lisan durante la deposición.
En la actualidad, se han desarrollado nuevos métodos de fabricación bioprinting aditivo. En estos sistemas de células, proteínas, factores de crecimiento, e hidrogeles biomiméticos son típicamente integrados en mater matrizmate- durante el proceso de fabricación y al mismo tiempo depositado utilizando actuadores controlados por el ordenador para generar constructos de células cargado a base de andamios tridimensionales que imitan estrechamente la microarquitectura del nativa. Los hidrogeles de células cargados constituyen la bioink, que puede ser heterogéneo, que consta de múltiples tipos de células, o homogénea. Aditivo sistemas de fabricación depósito bioink gota a gota o capa por capa a través de jeringas desechables y consejos a un escenario controlado por ordenador capaz de moverse en las direcciones x, y, z. A través de los programas informáticos, la arquitectura de andamios impresos puede ser fácilmente manipulado en función de los requisitos de la aplicación. A diferencia de las técnicas convencionales, tecnologías médicas tridimensionales (imágenes por resonancia magnética, tomografía computarizada) se pueden incorporar en los diseños, la generación de construcción específica del paciente. Estos métodos también permiten la posibilidad de producir reemplazos vascularizados porque construcciones se producen con una l mayordensidad celular vecinal, permitiendo interacciones célula-célula y la mejora de la probabilidad de Surviva post-implantación.
La impresora Palmetto es un sistema multi-dispensador tridimensional hecha a la medida que utiliza métodos programables fabricación robóticos para generar construcciones de tejido heterogéneo en tres dimensiones (Figura 1). Se permite el uso de una pluralidad de materiales en combinaciones únicas para producir estructuras heterogéneas. La inicialización del bioprinter es uno de los pasos más importantes en bioprinting porque le permite establecer una serie de parámetros para optimizar la capacidad de impresión de los constructos bioprinted.
El bioprinter comprende un proceso de tipo discontinuo con secuencias de arranque, funcionamiento y apagado controlado por un controlador lógico programable (PLC), que el usuario opera a través de un panel de control de pantalla táctil interactiva (Figura 1, A). Para evitar la contaminación de biomateriales lógicos del bioprinter está encerrado en un poli positivamente-presionados (metacrilato de metilo) (PMMA) con una cámara de arrestancia partículas de alta eficiencia (HEPA) -filtered sistema de circulación de aire (Figura 1, B, C). El interior de la impresora se puede esterilizar utilizando las fuentes de luz ultravioleta incorporados en la (Figura 1, D). El componente central de la bioprinter es un robot de posicionamiento totalmente programable que se puede colocar de manera reproducible una punta del dispensador con una precisión de 10 micrómetros (Figura 1, E). Hay tres dispensadores, que son capaces de depositar volúmenes tan pequeños como 230 nl utilizando un tornillo rotativo (Figura 1, F). Ellos son independientemente programable utilizando equipos independientes que gobiernan los parámetros de impresión para cada dispensador (Figura 1, G). Dispensación Rotary-tornillo utiliza la rotación de un tornillo accionado por motor para mover hacia abajo bioink una jeringa y fuera de la punta de la jeringa. Estos dispensadores están montados sobre una neumáticaNest Herramienta Ly controlado (Figura 2A, B), permitiendo que el robot para cambiar dispensador montado en el brazo robótico del eje Z bajo control programado (Figura 1, H).
El robot XYZ recibe instrucciones de impresión desde un equipo que ejecuta el software de diseño (Figura 1, I). Cada programa contiene ubicaciones de dispensación, las rutinas de calibración, y protocolos dispensador cambiante. El diseño de las construcciones generadas principalmente consiste en las coordenadas XYZ, donde cada dispensador depositará material. El bioprinter comprende dos sensores de luz ópticos (Figura 2C) que determinan las coordenadas XYZ del extremo de la punta de la jeringa. Estos sensores envían información de coordenadas para el robot, que las utiliza para calcular las posiciones de los extremos de punta del dispensador. Hay un láser de desplazamiento adicional (Figura 2D) que proyecta un diodo de 633 nm rayo láser rojo del tamaño del punto 30 x 100 micrómetros para medir la distancia con un Accuracy de 0,1 micrómetros. Cuando el haz está muy centrado el robot determina la distancia Z de la superficie de impresión. Esta medición, y la medición de los sensores de luz óptica de la extremo de la punta en Z, permite el cálculo de Z precisa coordenadas utilizadas para colocar la punta del dispensador en relación con la superficie de impresión. Las puntas de dosificación se mueven lateralmente y verticalmente a través del sensor de luz óptica orientada eje X para encontrar los centros Y y Z, y lateralmente a través de un sensor de eje Y para encontrar el centro del eje X. La superficie de impresión se asigna utilizando la fórmula para un plano en el espacio xyz: ax + by + cz = d para determinar donde la superficie es relativa a la posición del extremo de la punta de dispensación. La etapa de la impresora (Figura 1, J) tiene una muestra de placa de Petri de hasta 80 mm de diámetro y utiliza un baño de agua de recirculación para mantener la temperatura de ajuste (Figura 1, K). Etapa temperatura puede ajustarse dentro de un rango de -20 y permanece estable dentro. Hay una cámara USB montadoen el robot Z-brazo para proporcionar una vista ampliada de la punta dispensadora durante el proceso de impresión (Figura 1, L). Hay una segunda cámara montada hacia la parte superior del interior de la cámara que proporciona una visión completa de la bioprinter durante el proceso de impresión (Figura 1, L).
Un software de dibujo diseño asistido por ordenador determina el patrón de deposición y permite al usuario generar gotas espaciadas de forma incremental y estructuras complejas (Figura 3). Vías tridimensionales pueden ser codificados manualmente en el software de diseño compatible con la impresora o importados de un software independiente de dibujo asistido por ordenador de diseño (Figura 4, Tabla 1). El software compatible con la impresora permite variaciones de los parámetros de impresión tales como el método de deposición (single deposición de gotas o la deposición vía continua), la geometría tridimensional de las vías, velocidad de deposición, distancia entre el extremo de la punta de la jeringa y substsuperficie de impresión tasa, la cantidad de tiempo para depositar una gota individual, y la altura y la velocidad de la jeringa se levanta entre la deposición de las gotas. Cada programa contiene XYZ ubicaciones de dispensación, las rutinas de calibración punta y protocolos dispensador de cambio para proporcionar un ambiente estéril, sin intervención del operador, durante la impresión. El controlador lógico programable (PLC) del robot recibe instrucciones del equipo que ejecuta el software de diseño y controla el tiempo de los eventos de los controladores externos (por ejemplo, los dispensadores). Para ello, el PLC utiliza un mecanismo de bucle para controlar los dispensadores , dispositivo de posicionamiento robótico, y los factores ambientales.
Tridimensional bioprinting-escritura directa utilizando un sistema de dispensación de líquido rotativo de tornillo permite que el proceso de depositar las células a ser más eficiente, precisa y fácil que los métodos anteriores. Este estudio muestra la bioprinter hecha a la medida es capaz de generar ceconstrucciones de hidrogel-ll cargados con alta viabilidad celular.
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Protocol
1. Preparación de la gelatina sustrato que contiene para tridimensional Bioprinting de alginato hidrogeles
- Prepare el substrato de calcio / gelatina siguiendo el método de sustrato de calcio / gelatina descrito por Pataky et al 11 para evitar la viabilidad reducida asociada con alto contenido. El método de sustrato de calcio / gelatina se encuentra a continuación.
- Combinar dihidrato de cloruro de calcio (1,5% en peso), cloruro de sodio (0,9% en peso), y la gelatina porcina (2% en peso) en agua destilada y hervir durante 2 min para crear una solución de gelatina 100 mM.
- Vierta 5 ml de la solución de gelatina / calcio en 100 mm placas de Petri estándar, haga girar la solución a su alrededor para una capa uniforme sobre la superficie, y colóquelo sobre una superficie plana en la nevera para gel de O / N (permite gelificar al menos 8 h antes de su uso).
- Para aumentar la opacidad de la superficie del sustrato, añadir dióxido de titanio (0,3% en peso) a la solución gelatina / CaCl 2. Se agita durante 10 min. Autoclave la solución de gelatina / TiO 2 en el ciclo de líquidos durante 30 min para esterilizarlo.
- Añadir 3 ml de la solución de gelatina / TiO 2 a la superficie de las placas de gelatina previamente preparadas. Agitar la mezcla para asegurarse de que se distribuye de manera uniforme por toda la superficie. Dejar cuajar en el 4 ° C nevera O / N (permita a gel por lo menos 8 horas antes de su uso). Los soportes deben ser utilizados dentro de los 3 días.
2. El alginato Oxidación
- Oxidar el bioink alginato de sodio siguiendo el método de alginato parcialmente oxidado por Bouhadir et al 30 se describe a continuación.
- Para hacer una solución de alginato oxidado 5%, disolver 1 g de alginato de sodio en 100 ml de agua destilada. Añadir una solución acuosa de peryodato de sodio (0,25 M, 0,25 mmol), el agente oxidante, para producir una solución de oxidación 5%. Se agita durante 19 horas a temperatura ambiente. Añadir 40 ml de etilenglicol a la solución después de 24 horas para terminar el reacción.
- Disolver 2,5 g de cloruro de sodio en la solución. Añadir una cantidad en exceso de alcohol etílico (2: 1 ratio) para precipitar los alginatos oxidados. Centrifugar la solución a 1000 xg para recoger los precipitados y volver a disolver en agua destilada. Repita el lavado con etanol.
- Liofilizar los gránulos de alginato oxidados y almacenar a -20 ° C hasta que esté listo para su uso.
- Determinar el grado de oxidación mediante la medición del porcentaje de peryodato de sodio consumido antes de ser terminado por el glicol de etileno.
- Preparar una solución de yoduro de potasio (20% w / v, tampón de fosfato pH 7,0 de sodio) y una solución thyodene (10% w / v, tampón de fosfato pH 7,0 de sodio). Mezclar las dos soluciones con el alginato oxidado a TA.
- Poco a poco caer la solución de peryodato de alginato de sodio y reaccionado en la mezcla de soluciones de yoduro de potasio y theodyne. Medir la absorbancia de la mezcla espectrofotométricamente a 426 nm. Cuando se ha alcanzado unamáxima, registre el volumen utilizado de alginato de sodio y solución de peryodato como V 1.
- La reacción es
. La cantidad de peryodato de sodio sin reaccionar es 
- Restar la cantidad de peryodato de sodio sin reaccionar de la concentración original para determinar la cantidad de peryodato de sodio consumido. Utilizando la fórmula anterior, determinar el grado de oxidación final del alginato.
. La cantidad de peryodato de sodio sin reaccionar es 
3. El alginato Péptido Conjugación
- Ligandos conjugadas con una secuencia arginina-glicina-aspartato expuesta (péptido) en el alginato oxidado previamente preparado siguiendo el método de conjugación RGD-Alginato por Rowley et al 31 se describe a continuación para promover la unión celular y la difusión.
- Utilice carbod acuosaquímica iimide con G 4 RGDSPto conjugada 31.
- Disolver 1 g de 5% de alginato oxidado en un ácido etanosulfónico 0,1 M 2- (N-morfolino) (MES), pH = 4. Añadir 1-etil- (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, 0,54 mmol) y N-hidroxisuccinimida ( NHS, 0,27 mmol) en 2: 1 proporción para formar amida intermedia.
- Añadir 0,28 mmol péptido, de acoplamiento a la cadena principal del polímero de alginato a través de la amina terminal. Se agita a RT O / N.
- Detener la reacción de acoplamiento mediante la adición de 2,5 g de cloruro de sodio a la solución. Añadir una cantidad en exceso de alcohol etílico (2: 1 ratio) para precipitar los alginatos oxidados. Centrifugar la mezcla a 4000 xg durante 5 min para recoger los precipitados. Aspirar los medios de comunicación en la campana de cultivo de células y volver a disolver los precipitados en agua destilada. Repita el lavado con etanol.
- Liofilizar los precipitados hasta que queda completamente seco (aparecerá como una sustancia blanca en polvo) y almacenar en el -20 ° C nevera para más tardeusar.
4. adiposo humano Las células estromales Cell Tissue Culture (de hADSC)
- Cultura adiposo humano las células del estroma de tejido (de hADSC) en 75 cm (matraces T75) matraces de cultivo de células tratadas, cubierto con 15 ml DMEM bajo en glucosa con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina, glutamina al 1%, y 1% antimicina. Cambiar los medios de comunicación, en la campana de cultivo de células, cada dos días hasta que hayan alcanzado la confluencia (80-90%).
- Una vez confluentes, transferir los matraces T75 a la campana de cultivo celular y suspender la hADSC de usar el método de enzima tripsina digestión.
- En el capó, aspirar todos los medios de cultivo celular apagado de las células. Enjuague con 5 ml de fosfato de Dulbecco solución salina tamponada con calcio y magnesio (DPBS ++). Aspirar el DPBS ++ fuera de las células.
- Mientras que en la campana, hacer una solución de tripsina y DPBS ++ mediante la mezcla de 1 ml de tripsina y 4 ml de DPBS ++. Cada matraz requiere 5 ml de la solution, así que el volumen apropiado para el número de matraces confluentes. Añadir 5 ml de la tripsina / DPBS ++ a cada matraz y ponerlos en la incubadora durante 2 min.
- Después de 2 minutos, retire los frascos y golpee suavemente los lados de ellos para aflojar las células de los fondos. Mira cada frasco con un microscopio para asegurar que las células se suspenden. Colocar los frascos de nuevo en la campana de cultivo celular y añadir 3 ml de medio de cultivo celular apropiado a cada matraz. Esto termina la reacción tripsina.
- Transferir los medios de comunicación de las células cargadas de cada matraz y poner en un cónico de 50 ml. Centrifugar ellos en 1000 xg durante 5 min. Las células deben aparecer como una pequeña pastilla blanca en la parte inferior de la cónica. Traslado de regreso a la campana de cultivo celular y aspirar los medios de comunicación. Resuspender las células en 2 ml de medio de cultivo celular.
- Contar las células usando un hemocitómetro bajo el microscopio. Una vez que las células han sido contados, en la campana de la cultura, la alícuota de la cantidad de medios de comunicación que contiene ~ 1,3 millon células y la transferencia a un cónico de 15 ml. Centrifugar el cónica 15 ml que contiene las células de nuevo durante 5 min a 1000 x g.
- En la campana de cultivo, resembrar las células restantes en varios frascos T-75, la adición de una concentración de células de ~ 350.000 a cada matraz. Añadir 15 ml de medio DMEM y volver a la incubadora hasta la confluencia de nuevo.
- Una vez que el ciclo de centrifugación es completa, devuelva el cónica 15 ml al cultivo celular. Aspirar los medios de comunicación a partir del sedimento celular y resuspender las células en solución de alginato acuosa a una concentración de 1,3 millones de células por mililitro de bioink, terteriating la solución a menudo por lo que hay una distribución homogénea de células de todo el bioink. Cargue la solución de células cargadas en un 3 ml jeringa compatible con la impresora estéril y el tornillo en la 22 G punta de plástico estéril.
5. Bioprinter Configuración
- Encienda el bioprinter, cada uno de los ordenadores del dispensador y el recirculating baño de agua.
- Establezca manualmente la recirculación temperatura del baño de agua para el mecanismo de gelificación.
- Establezca manualmente los parámetros de impresión para cada distribuidor en el equipo dispensador de correlación. Ajuste el volumen de dispensación de 230 nl, número de backsteps a 0, y la tasa de dispensación de 10μl sec.
- Abra el software de diseño y el programa para la visualización de la pantalla de la cámara USB en el ordenador.
- Usando el software, introducir manualmente las coordenadas para una matriz de puntos 5 x 5 con 2,4 mm de separación entre las gotas.
- Establezca los parámetros de impresión de ser: distancia entre el extremo de la punta y la superficie del sustrato = 0,1 mm; altura jeringa se levanta entre los depósitos = 20 mm; la cantidad de tiempo por deposición = 1 seg.
- Guarde el programa y enviarlo al robot.
- Coloque la placa de Petri de gelatina / TiO2 -Con un contenido en el escenario de la impresora C 4 °. Cierre y bloquee la puerta de la cámara.
- Utilice el PLC para iniDar formato las fuentes de luz ultravioleta, y esterilizar la cámara durante 90 segundos.
- Una vez que la esterilización es completa, abrir la cámara y cargue la jeringa que contiene de hADSC suspendido en alginato en la pistola 1. Cierre y bloquee la puerta de la cámara.
- Utilice el PLC para activar el sistema de ventilación, espere 30 segundos para la presión interna de equilibrio.
- En el ordenador, ejecute el programa que contiene los parámetros de la vía y la impresión geométricas.
- Durante todo el proceso de impresión, ver la pantalla de la cámara USB en el equipo para confirmar la impresión precisa y uniforme.
- Una vez finalizada la impresión, permitir que las construcciones de gel durante 40 min.
6. Análisis de Viabilidad Celular
- Cubra las construcciones que no van a ser fotografiado inmediatamente después de la impresión en DMEM y almacenar en la incubadora hasta el momento de formación de imágenes.
- Para cuantificar la viabilidad de las construcciones, mancha usando un ensayo de viabilidad / citotoxicidad de base fluorescente, unnd imagen mediante microscopía confocal.
- Siguiendo las instrucciones del kit, preparar una solución de tinción que contienen calceína AM y homodímero de etidio-1. Para hacer 10 ml de solución de tinción, añadir 20 l de la etidio homodímero-1 y 5 l de la calceína am a 10 ml de agua estéril, fosfato solución salina tamponada con cultivo de tejidos grado de Dulbecco (+ magnesio, + de calcio; DPBS ++).
- Sumergir los constructos bioprinted en la solución de tinción durante 15 min en la oscuridad.
- Imagen de las construcciones teñidas utilizando un sistema de microscopio confocal en los días 0 y 8. Tomar varias imágenes de cada construcción bioprinted, utilizando parámetros Z-stack de 30 rebanadas ópticos en una profundidad de 300 m, y contar manualmente las células. Si las células aparecen de color amarillo o cuentan como viva verde, y si rojo, contarlos como muerto.
- Calcular el porcentaje de viabilidad celular como el número de células vivas dividido por el número total de células en la construcción; Viabilidad Celular = número decélulas vivas (verde + amarillo) / número de células totales (verde + amarillo + rojo) x 100%.
- Calcular la cantidad de proliferación celular para cada muestra como el número de células de 8 días dividido por el número de células en el día 0; Proliferación Celular = recuento de células en vivo los días 8 / células vivas cuenta en el día 0 x 100%.
7. Análisis Conjugación de péptidos RGD
- Para analizar el éxito de la conjugación péptido RGD en el alginato, alginato comparar RGD-conjugado y alginato no conjugado. Para ello, la imagen de las construcciones impresas usando (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, Dihydrochloride) (DAPI) y phalloidin manchas.
- Realice los phalloidins solución de trabajo diluyendo 5 l de la solución metanólica con 200 l de DPBS ++. Almacenar a -20 ° C hasta su uso.
- Hacer una solución 300 mM de stock de la mancha DAPI siguiente la ecuación: (0,10509 g / L) / (350,3 g / mol) = 3 × 10 -4 M = 0,0003 M = 0,300 mM = 300 mM. Hacer ªe DAPI solución de trabajo diluyendo la solución madre de 1: 100 en DPBS ++ para obtener 3 M solución. Almacenar a -20 ° C hasta su uso.
- Sumerja completamente la muestra en paraformaldehído al 4%. Incubar durante 1 hora a RT. Lavar tres veces con DPBS ++, permitiendo que la solución actúe durante 5 minutos cada lavado. Transferir la muestra de gel del pozo a un portaobjetos de vidrio, volteando el gel sobre en el proceso. Sumergir el gel en 0,1% de Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) en DPBS ++ durante 10 min. Lavar tres veces con DPBS ++, permitiendo 5 minutos para cada lavado.
- Tinción de las construcciones impresas con faloidina por inmersión en la solución de trabajo. Cubra con papel aluminio y se incuba durante 4 horas. Quite la mancha faloidina y lavar tres veces con DPBS ++. El primer lavado debe ser rápido, los últimos lavados deben sentarse durante 5 minutos cada uno.
- Tinción de las construcciones impresas con DAPI sumergiéndolos en la solución de trabajo de DAPI. Cubrir con papel de aluminio y se incuba a TA durante 30 min. lavartres veces con DPBS ++, lo que permite cada lavado para sentarse durante 5 min. Observe y la imagen de las muestras en un sistema de microscopio confocal.
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Representative Results
Los resultados demuestran la bioprinter es capaz de depositar hidrogeles de células cargado en ubicaciones tridimensionales específicas precisa y consistente utilizando el software asistido por ordenador. Estos programas determinan la colocación de cada gotita y controlan muchos de los parámetros para la distribución (Figura 3,4). La repetibilidad del bioprinter para depositar apropiadamente biomateriales es fundamental para su éxito en aplicaciones de ingeniería tisular.
La viabilidad celular, uno de los requisitos de una técnica bioprinting éxito, se analizó 1 hr y 8 días post-impresión. La viabilidad celular alta es esencial para la fabricación de construcciones biomiméticos y es una representación directa de un bioink adecuada. Conjugación péptido RGD mejora la viabilidad celular durante períodos prolongados de tiempo, promoviendo la propagación de células. Microscopía de fluorescencia se utilizó para cuantificar la viabilidad celular en las construcciones después de el proceso de impresión. Bioink alginato con un concentración de 15% y la oxidación del 5% tenían un día 0 viabilidad de 98%, día 4 de 96%, y 8 días de 95% (Figura 5). Estos resultados indican la técnica de deposición de la escritura directa bioprinter extruye células lo suficientemente suave para producir construcciones que se mantienen viables durante y después del proceso de impresión (Figura 1, 2). La viabilidad celular alta muestra el 5% y el 15% de oxidación alginato concentración bioink era un vehículo adecuado para la deposición celular y proporciona un ambiente adecuado para la supervivencia celular. Los recuentos de células similares en cada una de las áreas mostraron una distribución homogénea de células en el bioink alginato, un aspecto fundamental de la resolución de impresión.
La mayoría de los tejidos tienen combinaciones complejas y gradientes de constituyentes de la matriz extracelular, cada uno con influencias biológicas y mecánicas específicas. Un biomaterial debe ser biomimético del medio ambiente nativo y facilitar las funciones celulares. La alta porosidad del andamio alginato permite allas células para comunicarse y relacionarse con los demás, y también pueden facilitar el flujo de nutrientes y metabolitos entre el andamio y su entorno. La adhesión celular a la matriz extracelular es una fase preliminar de la formación de tejido que ocurre antes de la proliferación celular y la organización de las moléculas de la matriz extracelular en el tejido funcional. La proliferación de las células juega un papel vital en el crecimiento de la curación y tejido de la herida, y por lo tanto es un factor muy importante en el análisis de constructos bioprinted para aplicaciones de ingeniería de tejidos. El alginato mejorada la unión celular RGD-conjugado en construcciones impresas, lo que mejora la propagación de células y la proliferación. La proliferación de las células en los andamios impresos se cuantificó contando tres áreas separadas en días 0 y 8 (Figura 6). La proliferación de las células en general se encontró que era 219,674% después de 8 días de cultivo. Estos resultados significan el andamio tiene biocompatibilidad adecuada para ser utilizado unasa matriz extracelular sintética para la entrega de las células para reparar el tejido dañado o no funcional.
Para analizar el éxito de RGD conjugación péptido en la bioink alginato, se realizó un experimento de comparación utilizando células cargadas, RGD-conjugado concentración de 15%, 5% bioink alginato de oxidación y célula-cargado, no conjugado concentración de 15%, 5% de oxidación bioink alginato. Tinción DAPI para núcleos y tinción faloidina para la actina se utilizaron para analizar la propagación de células en construcciones impresas en día 8. Imágenes de cada muestra (por lo menos tres imágenes al azar por muestra) se toman usando un sistema de microscopio confocal utilizando parámetros Z-pila de 30 rebanadas ópticas más de una profundidad 300 (figura 7). La propagación de células se muestra en la muestra con alginato-RGD conjugado demuestra la incorporación exitosa del péptido en el alginato. La migración celular es un paso importante en el desarrollo del tejido; Por lo tanto, la conjugación de péptidos RGD en alginato mejora la likelihood de aplicación in vivo usando este bioink.
Figura 1. Controlador Palmetto impresora. Lógico Programable coordina las acciones de todas las funciones de la impresora (A). Una cámara de contención hermética (B) con la ingesta de filtrado (C) y de escape (C) mantiene una presión positiva interna regulada para reducir la posibilidad de contaminación. Luces UV Dual (D) montados en el techo de la cámara se pueden programar para funcionar a intervalos seguros. A Janome 2300N XYZ Robot (E) está programado y controlado por un ordenador integrado (I). Tres controladores dispensador (G) están programados para regular la salida de pistolas dispensadoras (F) disponibles para ser cargados en el brazo de eje Z de robot (H) bajo control por ordenador. La temperatura del portamuestras robot (J) se encuentra entre 4 y 40 ° C por un controlador baño de agua (K). Cámaras digitales duales (L) están disponibles t o controlar la actividad de la impresora y la formación de la muestra. Una cámara está montada en el brazo del eje Z robot y ofrece una imagen ampliada de la punta del dispensador de la pistola cargada. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Nido de herramientas, sensores ópticos, y el Desplazamiento láser de Bioprinter. A. Unloaded vista de herramientas nido desde el frente. B. vista de herramientas nido Cargado desde el frente. C. Sensores ópticos de medición del extremo de la punta de distribución en el espacio tridimensional. D. Distancia láser de medición de la coordenada Z de la superficie de impresión. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Visual PathBuilder Software. Imagen de diseño asistido por ordenador software de dibujo utilizado para el diseño de la arquitectura externa de construcciones bioprinted. Este programa ofrece la posibilidad de generar gotas espaciadas de forma incremental y geometrías complejas. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. JR-C Puntos Software. Captura de pantalla del software de diseño compatible con la impresora. Este programa permite al usuario controlar el método de deposición (es decir, la deposición sola gota o deposición vía continua), la velocidad de deposición, distancia entre el extremo punta de la jeringa y la impresión de su superficie bstrate, el tiempo asignado para la deposición de cada gota, y la colocación de tres dimensiones de las gotitas (consulte la Tabla 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Imagen fluorescente de Stained hADSCs Post-Impresión. La viabilidad celular / citotoxicidad imágenes fluorescentes de hADSC de en construcción bioprinted tomada usando un sistema de microscopio confocal (parámetros Z-stack de 30 rebanadas ópticos más de una profundidad) después de 0 (A) y 8 ( B) días. El hADSC fueron etiquetados de post-impresión utilizando un ensayo de viabilidad celular / citotoxicidad de los mamíferos. Las células vivas se tiñen verde, y las células muertas se tiñen de color rojo.3156fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. cuantificada viabilidades de Bioprinted Constructos. El número de células vivas y muertas se cuantificó usando un ensayo de viabilidad / citotoxicidad. Los recuentos de células vivas / muertas para el Día 0 se muestran en (A), y las cuentas para el día 8 en (b). El número de células vivas contado para cada área en los días 0 y 8 se muestran en (C) y se utiliza para cuantificar la proliferación celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Comparación de Cell-Laden, Non-conjugado y RGD-conjugado alginatos. imágenes fluorescentes de bioprinted de hADSC en no conjugado (A), y en RGD-conjugado (B) tomada concentración 15% 5% bioink alginato de oxidación usando un sistema de microscopio confocal (parámetros Z-pila de 30 rebanadas ópticos más de una profundidad). El hADSC de se tiñeron con phalloidin y DAPI manchas analizar la propagación de células en cada una de las construcciones. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tabla de Comandos | |
| Comando | Respuesta Robot |
| PTP Point | Brazo robótico se mueve a posiiton indicada en X, Y, Z espacio |
| Find_Base_Z | Utiliza el láser SICK para medir tque la impresión de la superficie del sustrato; La distancia entre el extremo de la punta de la jeringa y la superficie del sustrato se ajusta manualmente. |
| Trabajar Adj. No. (Trabajo Número de ajuste) | Comandos robot utilizar láser SICK (para determinar la superficie del sustrato), Arma 1, Arma 2, o 3 Pistola. |
| Get_1 | Comandos robot ot recuperar y cargar pistola 1 |
| Find_Tip1_YZ | El robot encuentra el extremo de punta de pistola 1 en el Y y Z |
| Find_Tip1_X | El robot encuentra el extremo de punta de pistola 1 en la dirección X |
| Punto de dispensación | El robot dispensará una gotita de bioink en el determinado X, Y, Z posición |
| Pallet No. (Número Pallte) | Incorpora un diseño codificado manualmente para la impresión, por ejemplo, una matriz. |
| Dispense Tiempo | Es el tiempo asignado para la deposición de cada gota individual. </ td> |
| Store_1 | Comandos del robot para volver Pistola 1 al toolnest, y volver a la posición inicial: (0,0,0). |
Tabla 1. programables Computer comandos de software. Esta tabla describe los comandos de software de ordenador programables, que se utilizan para controlar el brazo robótico y optimizar los parámetros de impresión.
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Discussion
El enfoque principal de la ingeniería de tejidos es cerrar la brecha entre la escasez de órganos y necesidades de trasplante mediante el desarrollo de sustitutos biológicos capaces de restaurar, mantener o mejorar functio tejido nativo. Esto ha llevado a la fabricación directa de andamios con un complejo, geometría externa anatómicamente correcta, y el control preciso sobre el Geometr interna. Bioprinting tridimensional es una metodología utilizada para generar construcciones tridimensionales de diversos tamaños y formas a partir de un modelo digital utilizando un approac capa por capa. La fabricación de construcciones biomiméticos tridimensionales juega un papel esencial en el avance de la ingeniería de tejidos.
Hay aspectos críticos del proceso de diseño que afecta functio biomimético de la construcción generados. La capacidad de controlar la temperatura del biomaterial y el sustrato es esencial para el mecanismo de gelificación de los hidrogeles y el mantenimiento de su mepropiedades mecáni-, por lo tanto, influyen en la distribución de células, proliferación y diferenciación dentro del hidrogel. Órganos consisten en muchos tipos de células, por lo que los múltiples dispensadores son críticos para la producción, estructuras como tejidos heterogéneos. El diseño asistido por ordenador de la arquitectura externa permite la producción de sustitutos de tejidos personalizados para heridas o tejidos distintos. Esto es esencial para el desarrollo de reemplazos específicos del paciente. La arquitectura interna es igualmente importante porque afecta a las relaciones célula-célula dentro de la estructura mediante la colocación de las células apropiadas en contacto íntimo entre sí y permitiendo que forman in vivo -como uniones célula-célula. La colocación precisa de las células determina cómo las células se comunican y la red entre sí para formar redes vasculares e imitan su bioactividad en los tejidos nativos. Bioprinting tridimensional proporciona células homogéneamente dispersas dentro de la bioink, así como una excelente precisión en la p espaciallacement de las células. Andamios generados también tienen altas densidades celulares locales, lo cual es esencial para la diferenciación celular y la formulación de la matriz extracelular.
Se presenta aquí una bioprinter robótico 3D que dispensa fiable y consistente gotas homogéneos de células individuales o células mezcladas con hidrogel biomimético. Bioprinters similares han utilizado una tecnología de pre-fusión. De acuerdo con la hipótesis de la adhesión diferencial, las células individuales cuando se coloca en un dispositivo de molde o similar, se fundirán y organizar basado en la concentración y distribución de moléculas de adhesión en el surfac celular. Estos dispositivos crean barras de pre-condensado u otras formas geométricas que se cargan en el dispensador y se colocan en estrecha proximidad a otras barras de pre-condensado o pre-hechos, que luego se funden en un shap geométrica más grande. Geometrías finales son limitadas por lo que se puede construir a partir de estas entidades pre-hechos. El bioprinter implementado aquí comprende una temperatura únicaambiente controlado en el que las células y las mezclas de células de hidrogel no están limitados por la necesidad de pre-fusión. Bajo estas condiciones, el bioprinter no es únicamente dependiente de la hipótesis de la adhesión diferencial. La inclusión de materiales de hidrogel puede ayudar a guiar la distribución celular y permitir que las células se fusionen, o no, dependiendo de las propiedades deseadas para la experimentación específica. La selección de hidrogeles biomiméticos para la encapsulación celular también tiene un profundo efecto en el fenotipo celular. Materiales son conocidos por tener un efecto sobre la unión celular, así como el tamaño celular y morpholog. Las características reológicas, tales como viscosidad, de hidrogeles dictan su influencia sobre las microenvironmen celulares. Alginato nativo es inerte y no se comunica fácilmente con células que participan en el control de fenotipo. Sin embargo, el uso de alginatos que se modifican químicamente mediante conjugación péptido y la oxidación, las construcciones resultantes mostrar controlados degradabilidad y el aumento de la célulaapego, la migración y proliferatio. La alteración de las propiedades fisicoquímicas de un biomaterial puede influir developmen tejido.
Bioprinting tridimensional usando un suministrador de fluido, máquina de escritura directa está limitado por el grado de resolución de las construcciones impresas, la disponibilidad de materiales de hidrogel, la muerte celular post-impresión inicial, y la capacidad de vascularizar la biomimética. Una característica importante de la bioprinting es su resolución. Cada método de impresión se define por el tamaño límite técnico inferior de los detalles más pequeños alcanzables. Existe una relación dinámica entre el tamaño límite inferior y la escala posible de la construcción impresa: cuanto mayor sea la resolución de los pequeños detalles, la construcción máximo menor. El bioprinter es capaz de depositar volúmenes tan pequeños como 230 nl en patrones muy específicos y organizados, lo que supone una resolución mayor que máquinas similares. Los hidrogeles han sido utilizados comúnmente en bioprinting debido a suhidrofilicidad, biocompatibilidad, similitud estructural con la matriz extracelular, y la facilidad de modificatio. El alto contenido de agua de los hidrogeles mejora su biocompatibilidad, pero reduce en gran medida su resistencia mecánica y. Hay una falta de hidrogeles óptimos con las propiedades mecánicas adecuadas para suministro de fluido durante la extrusión bioaditivo-fabricación. Por lo tanto, hay una gran demanda para el desarrollo de hidrogeles que son inmunológicamente inerte, tienen mecanismos de gelificación citocompatible que se pueden extruir con éxito utilizando suministro de fluido, y también producir una matriz de células cargadas de una gama óptima de mecánica. Antes de que el proceso de impresión, el hidrogel bioink de células Laden se debe almacenar en las jeringas para una cantidad de tiempo, comprometiendo la celda de. Durante el proceso de impresión, el esfuerzo cortante inducida en las células durante la extrusión también puede ser perjudicial para su. El bioprinter es capaz de producir (> 90%) construcciones altamente viables, por lo tanto la superación de la cuestión de la ila muerte celular nitial. Vascularización juega un papel vital en la transmisión, el apoyo o la preservación de la función biomimético de bioprinted. La difusión de oxígeno es m; por lo tanto, en mayor bioprinted construye hipoxia es una. Las técnicas convencionales son incapaces de producir constructos con vasculatura incrustado, lo que limita en gran medida el tamaño de los andamios producibles. La evaluación de la viabilidad celular del bioprinter mostró proliferación celular significativa en las construcciones impresas más de 8 días. Por lo tanto, la técnica demuestra su capacidad para generar andamios que permiten el crecimiento celular, la comunicación y la formación de redes, los requisitos de la vascularización.
El bioprinter proporciona la capacidad de usar una variedad de materiales para depositar rápidamente hidrogeles de células cargado en patrones específicos. Aunque esta técnica produce construcciones heterogéneas con propiedades sintonizables, que es incapaz de deposición concurrente y la mezcla reactiva. Para algunos biomateriales, esta deposición se reunióhod mejoraría el mecanismo de gelificación y acortar el tiempo de productio andamio. La adición de un dispensador de multi-jeringa podría permitir una gama más amplia de biomateriales para la técnica de Biofabrication. Investigación de la actividad de las células en los constructos bioprinted más de un período de tiempo proporcionaría más información sobre las características de hidrogel, formación de la red celular y la vascularización de las construcciones más tiempo.
El método de deposición de bioprinter descrito puede implicar más robóticamente posicionamiento y la conducción de los tres dispensadores para depositar una pluralidad de materiales biológicos en la parte superior de los materiales previamente depositados en un patrón predeterminado. Este paso se puede repetir utilizando patrones ascendente hasta que se produce un órgano tridimensional o tejido. Por lo tanto, la impresora Palmetto es adecuado para dispensar de forma fiable hidrogeles de células cargados para crear una construcción tridimensional que es capaz de retener la vasculatura y la viabilidad celular alta, y podríaser usado en aplicaciones de ingeniería de tejidos.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la ayuda del Gobierno bajo la Concesión No. EPS-0903795 otorgados por la National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), y Grant 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37 °C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37 °C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80 °C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80 °C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37 °C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37 °C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20 °C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20 °C until use |
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