Bioengineering

Viabilité de Bioprinted cellulaires constructions Utilisation d'une imprimante cartésienne Distributeur Trois

Published: September 22, 2015 doi: 10.3791/53156

Sarah Grace Dennis¹, Thomas Trusk², Dylan Richards³, Jia Jia³, Yu Tan³, Ying Mei³, Stephen Fann¹, Roger Markwald³, Michael Yost¹

¹Department of Surgery, Medical University of South Carolina, ²Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina, ³Department of Bioengineering, Clemson University

Introduction

L'ingénierie tissulaire utilise les principes de la biologie et de l'ingénierie dans le développement de substituts fonctionnels pour maintenir, restaurer ou améliorer tissu natif et. La capacité de générer des constructions biomimétiques en trois dimensions à la demande serait de faciliter les progrès scientifiques et technologiques dans l'ingénierie tissulaire, ainsi que dans les capteurs à base de cellules, médicaments / dépistage de la toxicité, modèles de tissus ou une tumeur, et d'autres. L'organisation tridimensionnelle des constructions de génie tissulaire est une composante fondamentale de la méthode de fabrication, car il doit étroitement imiter l'interaction hautement organisé des cellules et la matrice extracellulaire dans le tissu natif.

Échafaudages biodégradables en trois dimensions et la forme de formation sont des facteurs critiques dans la génération de nouvelles constructions de tissu parce que les cellules migrent pour former une couche à deux dimensions de cellules, mais pas la capacité de croître en trois dimensions désirée. L'échafaudage sert de base temporaire pour cellulairel'attachement et la prolifération, de sorte qu'il doit être construit à partir de matériaux à porosité et la biodégradabilité contrôlable et integrit mécanique suffisante. Les matériaux d'échafaudage ne doivent pas être cytotoxiques ou une réponse indésirable créer à partir de l'hôte. Les hydrogels ont été couramment utilisé dans les techniques d'ingénierie tissulaire, et en raison de leur caractère hydrophile, les hydrogels permettre l'échange de fluide et de gaz à travers le structur. En combinant différents hydrogels, les propriétés de l'hydrogel synthétisé sont modifiables à répondre à l'exigence d'application distincte.

L'approche de l'ingénierie tissulaire classique implique la création d'échafaudages sacrificielles poreuses acellulaire qui sont ensemencés avec des cellules post-fabricatio. De nombreuses techniques ont été employées, telles que le collage de la fibre, coulée au solvant, moulage et faire fondre, mais avérée peu efficace pour les applications d'ingénierie tissulaire. Des méthodes de liaison des fibres des fibres permettent à être alignés dans des formes spécifiques, mais ils ne sont capables de production échafaudage très mince. Méthodes de coulée de solvant produites constructions très poreuses, cependant la membrane plus grand produit était seulement 3 mm thic. Par conséquent, la création de constructions à trois dimensions est impossible en utilisant ces techniques. Techniques de moulage par fusion prouvé réussi à produire des échafaudages tridimensionnels, mais de telles températures élevées sont nécessaires que les matériaux biologiques ne peuvent être incorporés pendant le procès de production. Les échafaudages ensemencés post-fabrication sont limitées dans leur capacité à répondre aux exigences de l'ingénierie tissulaire pour produire des échafaudages tridimensionnels avec microstructures prédéfinis ou contrôlables et. Un autre problème majeur avec les technologies échafaudage de semis solides est l'insuffisance de vascularisation et une mauvaise mécanique.

Bioprinting a depuis été étendue à trois dimensions à l'aide de gels, non toxiques, biodégradables thermo-réversible à remédier aux inconvénients de classique. Quelques-uns du solide freeform fabrication techniques actuellement employées sont bioprinting impression jet d'encre et laser assistée. Techniques de bioprinting assistée par laser utilisent une source laser pulsée, une plaque de cible, et un substrat de réception afin de générer trois dimensions. Cependant, cette technique est limitée en raison du faible débit, la faible viabilité des cellules, et ne peut que produire régime limité de structures fabriquées car seuls photoréticulables prépolymères peuvent être utilisés pour former un hydrogel réticulé. Impression jet d'encre a été développé comme une méthode non-contact qui reproduit les données d'images numériques sur un substrat par dépôt d'encre picolitres. Toutefois, l'impression à jet d'encre ne produit pas une haute résolution construction, construit expérience rapide dénaturation des protéines, et la plupart des cellules sont lysées pendant le dépôt.

Actuellement, de nouvelles méthodes de fabrication de bioprinting additif ont été développés. Dans ces systèmes, des cellules, des protéines, des facteurs de croissance, et biomimétiques hydrogels sont généralement intégrés dans la matrice-mèreEIAA au cours du processus de fabrication et en même temps déposé utilisation de servomoteurs commandés par ordinateur pour générer des constructions cellulaires chargé base échafaudage en trois dimensions qui imitent la microarchitecture du natif. Les hydrogels chargés de cellules constituent le bioink, qui peut être hétérogène, constitué de plusieurs types de cellules ou homogène. Systèmes de fabrication additive dépôt bioink goutte-à-goutte ou de la couche par couche par l'intermédiaire de seringues et embouts jetables sur une scène capable de se déplacer dans les x, y et z contrôlé par ordinateur. Grâce à un logiciel informatique, l'architecture d'échafaudages imprimés peut être facilement manipulé en fonction des besoins de l'application. Contrairement aux techniques classiques, les technologies médicales tridimensionnelles (imagerie par résonance magnétique, tomographie par ordinateur) peuvent être incorporés dans les dessins, générant construction spécifique au patient. Ces méthodes permettent également la possibilité de produire des constructions en raison des remplacements vascularisés sont produites avec un l ultérieuredensité cellulaire Ocal, permettant des interactions cellule-cellule et l'amélioration de la probabilité de post-implantation Surviva.

L'imprimante Palmetto est un système multi-distributeur en trois dimensions sur mesure qui utilise des méthodes de fabrication de robots programmables pour générer constructions de tissu hétérogènes tridimensionnels (Figure 1). Il permet l'utilisation d'une pluralité de matériaux dans des combinaisons uniques de réaliser des structures hétérogènes. L'initialisation de la bioprinter est l'une des étapes les plus importantes dans bioprinting car il vous permet de définir une série de paramètres pour optimiser l'imprimabilité des constructions bioprinted.

Le bioprinter comprend un procédé de type discontinu avec démarrage, fonctionnement séquences d'arrêt et contrôlées par un contrôleur logique programmable (PLC), que l'utilisateur opère par le biais d'un panneau de commande à écran tactile interactif (figure 1, A). Pour éviter la contamination des biomatériaux logiques du bioprinter est enfermé dans un poly-pression positive (méthacrylate de méthyle) (PMMA) chambre avec un arrestance de particules à haute efficacité (HEPA) -filtered système de circulation d'air (Figure 1, B, C). L'intérieur de l'imprimante peut être stérilisé en utilisant des sources de lumière ultraviolette intégrées (Figure 1, D). La composante centrale de la bioprinter est un robot de positionnement entièrement programmable qui peut reproductible placer un embout de distribution avec une précision de 10 microns (Figure 1, E). Il existe trois distributeurs qui sont capables de déposer des volumes aussi petits que 230 nl aide d'une vis rotative (Figure 1, F). Ils sont indépendamment programmable à l'aide des ordinateurs distincts qui régissent les paramètres d'impression pour chaque distributeur (figure 1, G). Rotary-vis de distribution utilise la rotation d'une vis motorisé pour se déplacer vers le bas bioink une seringue et sur l'embout de la seringue. Ces distributeurs sont montés sur un pneumatiqueOutil Nest ment contrôlée (figure 2A, B), ce qui permet au robot de passer distributeur monté sur le bras robotisé de l'axe Z sous contrôle programmé (Figure 1, H).

Le robot XYZ reçoit des instructions d'impression à partir d'un logiciel de conception ordinateur exécutant (Figure 1, I). Chaque programme contient les emplacements de distribution, les routines de calibrage, et des protocoles de distribution changeante. La conception de constructions générées compose essentiellement de la coordonnées XYZ où chaque distributeur se déposer de la matière. Le bioprinter comprend deux capteurs de lumière optiques (figure 2C) qui déterminent les coordonnées XYZ de l'extrémité de pointe de la seringue. Ces capteurs envoient des informations de coordonnées de robot, qui les utilise pour calculer les positions des extrémités de pointe de distribution. Il est un laser de déplacement supplémentaire (figure 2D) qui projette un 633 nm diode rouge faisceau laser de la taille du spot 30 x 100 micromètres pour mesurer la distance avec un accuracy de 0,1 micromètre. Lorsque le faisceau est fortement axé le robot détermine la distance en Z de la surface d'impression. Cette mesure, et l'optique de mesure de l'extrémité de pointe en Z des capteurs de lumière, permet le calcul de Z coordonnées exactes utilisé pour placer la pointe du distributeur par rapport à la surface d'impression. Les pointes de distribution se déplacent latéralement et verticalement à travers le capteur de lumière optique X-axe orienté de trouver les centres Y et Z, et latéralement à travers un capteur d'axe Y pour trouver le centre de l'axe-X. La surface d'impression est mappé en utilisant la formule pour une surface plane dans l'espace xyz: ax + by + cz = D pour déterminer où la surface est par rapport à la position de l'extrémité de la pointe de distribution. L'étape d'impression (Figure 1, J) occupe une boîte de Petri de l'échantillon de 80 mm de diamètre et utilise un bain d'eau de remise en circulation pour maintenir la température de consigne (Figure 1, K). Température de l'étage peut être réglée dans une plage de -20 et reste stable au sein. Il ya une caméra USB montésur le robot à bras en Z pour fournir une vue agrandie de l'embout de distribution au cours du processus d'impression (Figure 1, L). Il y a une seconde caméra montée vers le haut de l'intérieur de la chambre qui fournit une représentation complète de la bioprinter pendant le processus d'impression (figure 1, L).

Un logiciel de dessin de conception assistée par ordinateur détermine le motif de dépôt et permet à l'utilisateur de générer des gouttelettes espacées de façon incrémentielle et des structures complexes (figure 3). Voies en trois dimensions peuvent être codées manuellement dans le logiciel de conception imprimante compatible ou importées à partir d'un logiciel séparé assistée par ordinateur dessin de conception (figure 4, tableau 1). Le logiciel d'impression compatible permet variations des paramètres d'impression tels que le procédé de dépôt (dépôt de gouttelettes unique ou dépôt en continu de la voie), de la géométrie en trois dimensions des voies, la vitesse de dépôt, la distance entre l'extrémité d'embout de seringue et substTaux surface d'impression, la quantité de temps pour déposer une goutte individuelle, et la hauteur et la vitesse de la seringue est levée entre le dépôt des gouttes. Chaque programme contient XYZ lieux de distribution, les routines de calibrage de pointe, et des protocoles de distribution changeante de fournir un environnement stérile, sans intervention de l'opérateur, lors de l'impression. Le contrôleur logique programmable (PLC) du robot reçoit des instructions de l'ordinateur exécutant le logiciel de conception et de contrôle le calendrier des événements à partir des contrôleurs externes (par exemple, les distributeurs). Pour ce faire, l'automate utilise un mécanisme de bouclage pour contrôler les distributeurs , dispositif de positionnement robotique, et les facteurs environnementaux.

Trois dimensions bioprinting écriture directe utilisant un système de distribution de liquide rotatif-vis permet le processus de dépôt de cellules pour être plus efficace, plus précis et plus facile que les méthodes précédentes. Cette étude montre l'bioprinter construit sur mesure est capable de générer des CEhydrogel constructions de LL-chargé avec la viabilité cellulaire élevée.

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Protocol

1. Préparation de gélatine substrat contenant pour Three-Dimensional Bioprinting d'alginate hydrogels

Préparer le substrat calcium / gélatine selon la méthode de substrat calcium / gélatine décrite par Pataky et al ¹¹ pour éviter viabilité réduite associée à une teneur élevée. La méthode de substrat calcium / gélatine est listé ci-dessous.
1. Moissonneuse chlorure de calcium dihydraté (1,5% en poids), du chlorure de sodium (0,9% en poids), et de la gélatine porcine (2% en poids) dans de l'eau distillée et porter à ébullition pendant 2 min à créer une solution de gélatine à 100 mM.
Verser 5 ml de la solution de gélatine / calcium dans 100 mm boîtes de Pétri standard, tourbillonner la solution autour de lui pour un revêtement uniforme sur la surface, et le placer sur une surface plane dans le réfrigérateur pour gel O / N (permet de gélifier au moins 8 h avant utilisation).
Pour augmenter l'opacité de la surface du substrat, ajouter le dioxyde de titane (0,3% en poids) à la / CaCl ₂ une solution de gélatine. Agiter pendant 10 min. Autoclave la solution de gélatine / TiO ₂ sur le cycle de liquides pendant 30 min à stériliser.
1. Ajouter 3 ml de la / TiO ₂ de solution de gélatine à la surface des plaques de gélatine préparés précédemment. Agiter le mélange pour assurer qu'elle est répartie uniformément sur la surface. Laisser gel dans le réfrigérateur à 4 ° C O / N (laisser gélifier au moins 8 heures avant utilisation). Les supports doivent être utilisés dans les 3 jours.

2. Alginate oxydation

Oxyder le bioink d'alginate de sodium suivant le procédé de l'alginate partiellement oxydé par Bouhadir et al ³⁰ décrit ci-dessous.
1. Pour faire une solution d'alginate oxydé 5%, dissoudre 1 g d'alginate de sodium dans 100 ml d'eau distillée. Ajouter une solution aqueuse de periodate de sodium (0,25 M, 0,25 mmol), de l'agent oxydant, pour produire une solution d'oxydation de 5%. Agiter pendant 19 heures à température ambiante. Ajouter 40 ml d'éthylène glycol à la solution après 24 h pour terminer la reaction.
2. Dissoudre 2,5 g de chlorure de sodium dans la solution. Ajouter une quantité en excès de l'alcool d'éthyle (2: 1 ratio) pour précipiter les alginates oxydés. Centrifuger à 1000 xg pour recueillir les précipités et re-les dissoudre dans de l'eau distillée. Répétez le lavage à l'éthanol.
3. Lyophiliser les pastilles d'alginate oxydés et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
Déterminer le degré d'oxydation en mesurant le pourcentage de periodate de sodium avant d'être consommé par la terminaison de l'éthylène glycol.
1. Préparer une solution d'iodure de potassium (20% p / v, pH 7,0 tampon de phosphate de sodium) et une solution de thyodene (10% p / v, pH 7,0 tampon de phosphate de sodium). Mélanger les deux solutions avec l'alginate oxydé à température ambiante.
2. Peu à peu tomber la solution de periodate d'alginate de sodium et réagi dans le mélange de solutions d'iodure de potassium et theodyne. Mesurer l'absorbance du mélange par spectrophotométrie à 426 nm. Lorsque celui-ci atteint unmaximal, enregistrer le volume utilisé de solution de periodate alginate de sodium et que V _1.
3. La réaction est . La quantité de periodate de sodium qui n'a pas réagi est
4. Soustraire le montant de periodate de sodium qui n'a pas réagi de la concentration initiale pour déterminer la quantité de sodium consommée periodate. En utilisant la formule précédente, déterminer le degré d'oxydation finale de l'alginate.

3. Alginate Peptide Conjugaison

Ligands conjugués avec une séquence arginine-glycine-aspartate exposée (peptide) dans l'alginate oxydé préalablement préparé en suivant le procédé de conjugaison de l'alginate de RGD Rowley et al ³¹ décrit ci-dessous, de promouvoir la fixation des cellules et la diffusion.
Utilisez carbod aqueusechimie iimide avec G ₄ RGDSPto conjugué ^31.
Dissoudre 1 g de 5% d'alginate oxydé en un acide éthanesulfonique 0,1 M 2- (N-morpholino) (MES), pH = 4. Ajouter 1-éthyl- (diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC, 0,54 mmol) et de N-hydroxysuccinimide ( NHS, 0,27 mmol) à 2: 1 pour former l'amide intermédiaire.
Ajouter 0,28 mmol peptide, un couplage à la chaîne principale du polymère d'alginate par l'intermédiaire de l'aminé terminale. Agiter à RT O / N.
Arrêter la réaction de couplage en ajoutant 2,5 g de chlorure de sodium à la solution. Ajouter une quantité en excès de l'alcool d'éthyle (2: 1 ratio) pour précipiter les alginates oxydés. Centrifuger le mélange à 4000 xg pendant 5 minutes pour recueillir les précipités. Aspirer les médias dans la hotte de culture cellulaire et re-dissoudre les précipités dans de l'eau distillée. Répétez le lavage à l'éthanol.
Lyophiliser les précipités jusqu'à ce qu'il soit complètement séché (apparaîtra comme une substance poudreuse blanche) et de les stocker dans le réfrigérateur à -20 ° C pour plus tardutiliser.

4. adipeux humain cellules stromales de Tissue Culture cellulaire (de hADSC)

Cellules de stroma de tissu adipeux humain de culture (de hADSC) dans 75 cm traitées flacons de culture cellulaire (flacons T75), recouvert de 15 ml bas DMEM en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine, 1% de glutamine et 1% antimycine. Changer les médias, dans la hotte de culture de cellules, tous les deux jours jusqu'à ce qu'ils aient atteint la confluence (80-90%).
Une fois confluentes, transférer les flacons T75 à la hotte de culture cellulaire et de la suspension de hADSC en utilisant le procédé de digestion enzymatique de la trypsine.
1. Dans la hotte, aspirer la totalité du milieu de culture cellulaire hors des cellules. Rincer avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec calcium et de magnésium (DPBS ++). Aspirer le DPBS ++ hors des cellules.
2. Alors que dans le capot, faire une solution de trypsine et DPBS ++ en mélangeant 1 ml de trypsine et 4 ml DPBS ++. Chaque flacon nécessite 5 ml de la solution, alors assurez le volume approprié pour le nombre de flacons confluentes. Ajouter 5 ml de la trypsine / DPBS ++ à chaque ballon et les mettre dans l'incubateur pendant 2 min.
3. Après 2 min, retirer les flacons et tapoter sur les côtés de leur desserrer les cellules des fonds. Regardez chaque ballon sous un microscope pour assurer que les cellules sont suspendues. Placez les flacons de retour dans la hotte de culture cellulaire et ajouter 3 ml de milieux de culture cellulaire appropriée à chaque flacon. Ceci met fin à la réaction de la trypsine.
4. Transférer le milieu cellulaire chargé dans chaque flacon et mis dans un 50 ml conique. Centrifuger eux à 1000 g pendant 5 min. Les cellules doivent apparaître comme une petite pastille blanche dans le fond du cône. Transfert retour à la hotte de culture cellulaire et aspirer les médias. Remettre en suspension les cellules dans 2 ml de milieu de culture cellulaire.
5. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre sous un microscope. Une fois que les cellules ont été comptés, dans la hotte de culture, aliquote la quantité de support contenant ~ 1,3 million cellules et le transfert de 15 ml conique. Centrifuger la conique de 15 ml contenant les cellules à nouveau pendant 5 min à 1000 x g.
6. Dans la hotte de culture, les cellules restantes réensemencer dans plusieurs flacons T-75, en ajoutant une concentration de 350.000 cellules ~ à chaque flacon. Ajouter 15 ml de milieu DMEM et revenir à l'incubateur jusqu'à confluence à nouveau.
7. Une fois le cycle de centrifugation est terminée, le retour 15 ml conique de la culture cellulaire. Aspirer le support du culot de cellules et remettre en suspension les cellules dans une solution d'alginate aqueuse à une concentration de 1,3 millions de cellules par millilitre de bioink, terteriating la solution souvent il n'y a donc une répartition homogène des cellules dans tout le bioink. Chargez la solution de cellules chargées dans une seringue de 3 ml d'imprimante compatible stérile et visser le 22 G embout en plastique stérile.

5. Bioprinter Setup

Allumer le bioprinter, chacun des ordinateurs de distributeur, et le recirculating bain d'eau.
1. Régler manuellement la température du bain d'eau de recirculation pour le mécanisme de gélification.
2. Définir manuellement les paramètres d'impression pour chaque distributeur sur l'ordinateur corrélation de distributeur. Réglez le volume de distribution à 230 nl, nombre de backsteps à 0, et le taux de distribution de 10 ul -sec.
Ouvrez le logiciel de conception et le programme pour visualiser l'écran de la caméra USB sur l'ordinateur.
1. En utilisant le logiciel, saisir manuellement les coordonnées d'un réseau de 5 x 5 points avec 2.4 mm espacement entre les gouttes.
2. Définissez les paramètres d'impression d'être: distance entre extrémité de pointe et la surface de substrat = 0,1 mm; hauteur seringue est levé entre les dépôts = 20 mm; la quantité de temps par dépôt = 1 sec.
3. Enregistrez le programme et l'envoyer au robot.
Placer le plat de gélatine / TiO ₂ contenant Petri sur la scène de l'imprimante C à 4 ° C. Fermez et verrouillez la porte de la chambre.
Utilisez le PLC surInItialize les sources de lumière ultraviolette, et la stérilisation de la chambre pendant 90 secondes.
Une fois la stérilisation est terminée, ouvrez la chambre et charger la seringue contenant en suspension dans alginate dans Gun 1. Fermer de hADSC et verrouiller la porte de la chambre.
Utilisez le PLC pour activer le système de ventilation, attendre 30 secondes pour la pression interne de l'équilibre.
Sur l'ordinateur, exécutez le programme contenant les paramètres de la voie et d'impression géométriques.
Tout au long du processus d'impression, regarder l'affichage de la caméra USB sur l'ordinateur pour confirmer l'impression précise et uniforme.
Une fois l'impression terminée, permettre les constructions à du gel pendant 40 min.

6. évaluation de la viabilité cellulaire

Couvrir les constructions qui ne vont pas à imager immédiatement post-impression dans DMEM et de stocker dans l'incubateur jusqu'à ce que le temps de l'imagerie.
Pour quantifier la viabilité des constructions, les teindre en utilisant un test de viabilité / cytotoxicité fluorescente à base, une image en utilisant la microscopie confocale.
1. En suivant les instructions du kit, préparer une solution de coloration contenant la calcéine AM et éthidium homodimère-1. Pour 10 ml de solution de coloration, ajouter 20 ul de l'éthidium homodimère-1 et 5 ul de la calcéine heures à 10 ml de solution stérile, tampon phosphate salin (+ magnésium + calcium; DPBS ++) de culture de tissus de qualité Dulbecco.
2. Plonger les constructions bioprinted dans la solution de tache pendant 15 minutes dans l'obscurité.
3. Image les constructions colorées en utilisant un système de microscope confocal aux jours 0 et 8. prendre plusieurs photos de chaque construction bioprinted, en utilisant des paramètres Z-stack de 30 tranches optiques sur une profondeur de 300 um, et de compter manuellement les cellules. Si les cellules semblent jaune ou verte comptent eux aussi vivant, et si rouge, les compter comme morts.
Calculer le pourcentage de viabilité cellulaire comme le nombre de cellules vivantes divisé par le nombre total de cellules dans la construction; La viabilité cellulaire = nombre decellules vivantes (vert + jaune) / nombre de cellules totales (vert + jaune + rouge) x 100%.
Calculer la quantité de prolifération de cellules pour chaque échantillon comme le nombre de cellules de 8 jours, divisé par le nombre de cellules au jour 0; La prolifération cellulaire = nombre de cellules vivantes au jour 8 / cellules vivantes compte au jour 0 x 100%.

7. RGD peptide Conjugaison Analyse

Pour analyser le succès de RGD peptide conjugaison sur l'alginate, l'alginate de comparer RGD-conjugué et alginate non-conjugué. Pour cela, l'image des constructions imprimés faire en utilisant (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (DAPI) et phalloidin taches.
1. Faire les phalloidins solution de travail en diluant 5 ul de la solution mère méthanolique avec 200 ul de DPBS ++. Conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
2. Faire une solution stock de 300 um de la tache DAPI suivant l'équation: (0,10509 g / L) / (350,3 g / mol) = 3 × 10 ^-4 M = 0,0003 = 0,300 M mm = 300 um. Assurez-èmesolution e DAPI de travail en diluant la solution de stock 1: 100 dans du DPBS ++ pour obtenir 3uM solution. Conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
Immerger complètement l'échantillon dans 4% de paraformaldehyde. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver trois fois avec du DPBS ++, laissant la solution reposer pendant 5 min à chaque lavage. Transférer l'échantillon de gel du bien à une lame de verre, en feuilletant le gel au cours du processus. Immerger le gel dans 0,1% de Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) dans du DPBS ++ pendant 10 min. Laver trois fois avec du DPBS ++, permettant 5 min pour chaque lavage.
Colorer les constructions avec la phalloïdine imprimés en les immergeant dans la solution de travail. Couvrir de papier aluminium et laisser incuber pendant 4 heures. Enlever la tache de phalloïdine et laver trois fois avec DPBS ++. Le premier lavage doit être rapide, les derniers lavages devraient s'asseoir pendant 5 minutes chacun.
Colorer les constructions imprimés avec DAPI en les immergeant dans la solution de travail DAPI. Couvrir de papier aluminium et laisser incuber à température ambiante pendant 30 min. lavagetrois fois avec DPBS ++, permettant à chaque lavage pour reposer pendant 5 min. Observer et l'image les échantillons sur un système de microscope confocal.

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Representative Results

Les résultats démontrent la bioprinter est capable de déposer des cellules hydrogels chargés dans des emplacements spécifiques en trois dimensions précise et cohérente en utilisant le logiciel assisté par ordinateur. Ces logiciels de déterminer l'emplacement de chaque gouttelette et le contrôle de nombreux paramètres de distribution (figure 3,4). La répétabilité de la bioprinter à déposer de manière appropriée biomatériaux est essentielle à sa réussite dans les applications d'ingénierie tissulaire.

La viabilité des cellules, l'une des exigences d'une technique de bioprinting succès, a été analysé 1 h et 8 jours post-impression. La viabilité cellulaire élevée est essentiel pour la fabrication de constructions biomimétiques et est une représentation directe d'un bioink adéquate. RGD peptide conjugaison améliore la viabilité des cellules sur des périodes de temps prolongées par la promotion de l'étalement cellulaire. Microscopie à fluorescence a été utilisé pour quantifier la viabilité cellulaire dans des constructions après le processus d'impression. Bioink alginate avec un concentration de 15% et de l'oxydation de 5% avaient un jour 0 viabilité de 98%, 96 jours de 4% et 8 jours de 95% (figure 5). Ces résultats indiquent la technique de dépôt de la bioprinter écriture directe expulse cellules assez doucement pour produire des constructions qui demeurent viables pendant et après le processus d'impression (figure 1, 2). La viabilité cellulaire élevée reprend l'oxydation 5% et 15% de concentration d'alginate bioink était un véhicule approprié pour le dépôt de cellules et fourni un environnement adéquat pour la survie cellulaire. Cellulaires chiffres similaires dans chacune des régions ont montré une distribution de cellules homogène dans le bioink alginate, un aspect fondamental de la résolution d'impression.

La plupart des tissus et des gradients ont des combinaisons de constituants de la matrice extracellulaire, chacun avec des influences biologiques et mécaniques spécifiques complexes. Un biomatériau devrait être biomimétique de l'environnement natif et de faciliter les fonctions cellulaires. La porosité élevée de l'échafaudage d'alginate permet auaux cellules de communiquer et d'échanger avec l'autre, et peuvent également faciliter le flux de nutriments et de métabolites entre l'échafaudage et son environnement. L'adhésion cellulaire à la matrice extracellulaire est une phase préliminaire de la formation des tissus qui se produit avant la prolifération cellulaire et l'organisation des molécules de la matrice extracellulaire dans un tissu fonctionnel. La prolifération des cellules joue un rôle vital dans la croissance de la guérison et de tissus de la plaie, et est donc un facteur très important lors de l'analyse des constructions bioprinted pour les applications d'ingénierie tissulaire. L'alginate amélioré la fixation des cellules de RGD-conjugué dans les constructions imprimés, entraînant une amélioration de l'étalement cellulaire et la prolifération. La prolifération des cellules dans les échafaudages imprimés a été quantifiée par comptage de trois zones distinctes sur les jours 0 et 8 (figure 6). La prolifération cellulaire total a été jugée 219,674% après 8 jours de culture. Ces résultats signifient l'échafaud a biocompatibilité suffisante pour être utilisé unesa matrice extracellulaire synthétique pour fournir des cellules pour réparer les tissus endommagés ou non fonctionnel.

Pour analyser le succès de RGD peptide conjugaison sur le bioink d'alginate, une expérience comparative a été réalisée en utilisant la cellule chargée, la concentration RGD conjugué à 15%, 5% d'alginate d'oxydation bioink et cellule-charge, concentration non conjugué à 15%, 5% d'oxydation bioink alginate. DAPI pour les noyaux et phalloidin coloration pour l'actine ont été utilisés pour analyser l'étalement cellulaire dans les constructions imprimés le jour 8. Les images de chaque échantillon (au moins trois images aléatoires par échantillon) prenaient en utilisant un système de microscope confocal en utilisant des paramètres Z-Stack of 30 tranches optiques sur une profondeur 300 (figure 7). La cellule représentée sur l'étalement de l'échantillon avec RGD conjugué alginate prouve l'incorporation réussie du peptide sur l'alginate. La migration cellulaire est une étape importante dans le développement du tissu; par conséquent, la conjugaison de peptides RGD sur alginate permet d'améliorer le likelihood d'application in vivo en utilisant ce bioink.

Figure 1. Palmetto imprimante. Programmable Logic Controller coordonne les actions de toutes les fonctions de l'imprimante (A). Une chambre de confinement étanche à l'air (B) avec admission filtré (C) et d'échappement (C) maintient une pression positive régulée interne pour réduire le risque de contamination. Lumières UV double (D) monté dans le plafond de la chambre peuvent être programmés pour fonctionner à intervalles sûrs. Un robot XYZ 2300N Janome (E) est programmé et contrôlé par un ordinateur intégré (I). Trois contrôleurs de distributeur (G) sont programmés de façon à réguler la sortie des pistolets de distribution (F) disponibles pour être chargés sur le bras d'axe Z robot (H) sous commande d'ordinateur. La température du porte-échantillon de robot (J) est réglée entre 4 et 40 ° C par un dispositif de commande du bain d'eau (K). Appareils photo numériques doubles (L) sont disponibles t o surveiller l'activité de l'imprimante et la formation de l'échantillon. Une caméra est montée sur le bras de l'axe Z-robot et fournit une image agrandie de la pointe de distribution de l'arme à feu chargée. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Outil Nest, Capteurs optiques et laser déplacement de Bioprinter. A. Déchargé vue outil de nid de l'avant. B. Chargé de vue outil de nid de l'avant. C. Capteurs optiques mesurant l'extrémité de pointe de distribution dans l'espace en trois dimensions. D. Distance laser mesurant la coordonnée Z de la surface d'impression. S'il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. visuelle PathBuilder Software. Image de conception assistée par ordinateur un logiciel de dessin utilisé pour la conception de l'architecture extérieure de constructions bioprinted. Ce programme offre la possibilité de générer des gouttelettes incrémentielle espacées et des géométries complexes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. JR-C Points Logiciels. Capture d'écran du logiciel de conception imprimante compatible. Ce programme permet à l'utilisateur de contrôler le procédé de dépôt (c.-à-dépôt unique de chute ou de dépôt en continu de la voie), la vitesse de dépôt, la distance entre l'extrémité de la pointe de la seringue et l'impression su bstrate surface, le temps imparti pour le dépôt de chaque goutte, et le placement en trois dimensions de gouttelettes (voir le tableau 1). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. image fluorescente de Stained hADSCs Post-impression. La viabilité des cellules / cytotoxicité images fluorescentes de hADSC'S à construction bioprinted prises à l'aide d'un système de microscope confocal (paramètres Z-stack de 30 tranches optiques sur une profondeur) après 0 (A) et 8 ( b) les jours. Le hADSC ont été marqués de post-impression en utilisant un dosage viabilité des cellules / cytotoxicité de mammifère. Les cellules vivantes sont colorées vert, et les cellules mortes sont colorées en rouge.3156fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. quantifiés viabilités des Bioprinted constructions. Le nombre de cellules vivantes et mortes a été quantifiée en utilisant un dosage de viabilité / cytotoxicité. Les morts vivants / comptages cellulaires pour jour 0 sont présentés dans (A), et les comptes pour la Journée 8 (B). Le nombre de cellules vivantes comptées pour chaque zone aux jours 0 et 8 sont présentés dans (C) et ont été utilisés pour quantifier la prolifération cellulaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7. Comparaison de Cell-Laden, Nsur-conjugué et de RGD conjugué alginates. images fluorescentes de bioprinted hADSC ce en non conjugué (A), et en RGD-conjugué (B) 15% de concentration 5% d'alginate d'oxydation bioink prise en utilisant un système de microscope confocal (paramètres Z-pile de 30 tranches optiques sur une profondeur). Le hADSC de ont été marqués par la phalloïdine et DAPI taches d'analyser la cellule propagation dans chacune des constructions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau des commandes

Commande	Réponse de Robot
PTP point	Bras se déplace robotisés à la posiiton indiqué dans X, Y, Z de l'espace
Find_Base_Z	Utilise le laser pour mesurer t SICKil l'impression de la surface du substrat; La distance entre l'extrémité de la pointe de la seringue et la surface du substrat est réglée manuellement.
Travailler Adj. No. (travail Nombre d'ajustement)	Robot de commandes à utiliser laser SICK (pour déterminer la surface du substrat), 1 Gun, Gun 2, ou 3 Gun.
Get_1	Robot de commandes OT récupérer et charger Gun 1
Find_Tip1_YZ	Le robot trouve l'extrémité de pointe de Gun 1 dans les directions Y et Z
Find_Tip1_X	Le robot trouve l'extrémité de pointe de Gun 1 dans la direction X
Point de distribution	Le robot va distribuer une gouttelette de bioink déterminé dans le X, Y, Z position
No. de palettes (Nombre Pallte)	Incorpore une conception codées manuellement pour l'impression, par exemple, un tableau.
Dispense Temps	Est le temps imparti pour le dépôt de chaque goutte individuelle. </ td>
Store_1	Commandes au robot de retourner Gun 1 à l'toolnest, et revenez à la position de la maison: (0,0,0).

Tableau 1. programmables informatiques de commandes logicielles. Ce tableau décrit les commandes de logiciels informatiques programmables, qui sont utilisés pour contrôler le bras robotisé et optimiser les paramètres d'imprimabilité.

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Discussion

L'objectif principal de l'ingénierie tissulaire est de combler le fossé entre la pénurie d'organes et les besoins de transplantation en développant des substituts biologiques capables de restaurer, maintenir ou améliorer functio de tissu natif. Cela a conduit à la fabrication directe d'échafaudages avec un complexe, géométrie externe anatomiquement correcte, et un contrôle précis sur la geometr interne. Bioprinting en trois dimensions est une méthode utilisée pour générer des constructions tridimensionnelles de différentes tailles et formes à partir d'un modèle numérique en utilisant un approac couche par couche. La fabrication de constructions biomimétiques tridimensionnelles joue un rôle essentiel dans la promotion de l'ingénierie tissulaire.

Il ya des aspects critiques du processus de conception qui influent functio biomimétique de la construction généré. La capacité de contrôler la température du substrat et le biomatériau est essentielle pour le mécanisme de gélification des hydrogels et le maintien de leur moipropriétés méca- influençant donc, la distribution cellulaire, la prolifération, la différenciation et à l'intérieur de l'hydrogel. Les organes sont constitués de nombreux types de cellules, de sorte que les multiples distributeurs sont essentiels pour la production de structures hétérogènes, comme les tissus. La conception assistée par ordinateur de l'architecture externe permet la production de substituts de tissus personnalisés pour des blessures ou des tissus distincts. Cela est essentiel pour le développement de substituts spécifiques à un patient. L'architecture interne est tout aussi important car il affecte les relations cellule-cellule au sein de la structure en plaçant les cellules appropriées en contact intime avec l'autre et leur permettant de former in vivo -comme jonctions cellule-cellule. Placement précis de cellules détermine la façon dont les cellules communiquent et le réseau avec l'autre pour former des réseaux vasculaires et imitent leur bioactivité dans les tissus natifs. Bioprinting Three-dimensional fournit des cellules dispersées de façon homogène au sein de l'bioink, ainsi que d'une excellente précision sur p spatialelacement des cellules. Échafaudages générés ont également des densités de cellules élevées, locale qui est essentiel pour la différenciation cellulaire et la formulation de matrice extracellulaire.

Présenté ici est un bioprinter 3D robotique qui distribue de façon fiable et cohérente gouttes homogènes de cellules individuelles ou de cellules mélangées avec hydrogel biomimétique. Bioprinters similaires ont utilisé une technologie de pré-fusion. Conformément à l'adhérence différentielle hypothèse, des cellules individuelles lorsqu'elles sont placées dans un dispositif de moulage ou similaire, se fondre et à organiser en fonction de la concentration et de la distribution des molécules d'adhésion sur la surfac cellulaire. Ces dispositifs créent tiges de pré-fusion ou d'autres formes géométriques qui sont ensuite chargés dans le distributeur et placés à proximité d'autres tiges pré-fondue ou pré-faites, qui fusionnent ensuite dans un Shap géométrique plus grande. Géométries finaux sont limités par ce qui peut être construit à partir de ces entités déjà créés. Le bioprinter œuvre comprend ici une température unique,environnement contrôlé dans lequel les cellules et les mélanges de cellules hydrogel ne sont pas limités par la nécessité de pré-fusion. Dans ces conditions, la bioprinter est dépendant pas uniquement sur l'hypothèse d'adhérence différentielle. L'inclusion de matériaux d'hydrogel peut aider à guider la distribution de cellules et permettre aux cellules de fusible, ou non, en fonction des propriétés souhaitées pour l'expérimentation spécifique. La sélection des hydrogels biomimétiques pour la cellule-encapsulation a aussi un effet profond sur le phénotype cellulaire. Les matériaux sont connus pour avoir un effet sur la fixation des cellules, ainsi que la taille des cellules et morpholog. Les caractéristiques rhéologiques telles que la viscosité, de hydrogels dictent leur influence sur les microenvironmen cellulaires. Alginate natif est inerte et ne communique pas avec facilement les cellules qui participent au contrôle de phénotype. Cependant, en utilisant les alginates qui sont modifiés chimiquement par conjugaison de peptides et de l'oxydation, les constructions résultantes affichage commandé dégradabilité et la cellule a augmentél'attachement, la migration et proliferatio. Modifiant les propriétés physico-chimiques d'un biomatériau peut influencer développemen de tissus.

Bioprinting en trois dimensions en utilisant un fluide-distribution, la machine à écriture directe est limitée par le degré de résolution des constructions imprimés, de la disponibilité des matériaux d'hydrogel, post-impression de la mort cellulaire initiale, et la capacité de vasculariser la biomimétique. Une caractéristique importante de la bioprinting est sa résolution. Chaque méthode d'impression est définie par la taille limite inférieure technique des moindres détails réalisables. Il existe une relation dynamique entre la taille de la limite inférieure et l'échelle réalisables de la construction imprimée: plus la résolution des détails infimes, la construction maximale inférieure. Le bioprinter est capable de déposer des volumes aussi petits que 230 nl dans les modèles très spécifiques et organisés, ce qui lui donne une résolution plus élevée que les machines similaires. Les hydrogels ont été couramment utilisé dans bioprinting en raison de leurhydrophilie, la biocompatibilité, la similarité structurale de la matrice extracellulaire, et la facilité d'modificatio. La forte teneur en eau des hydrogels améliore leur biocompatibilité, mais réduit considérablement leur résistance mécanique et. Il y a un manque d'hydrogels optimaux avec des propriétés mécaniques appropriées pour la distribution de fluide au cours de la fabrication bioadditive-extrusion. Par conséquent, il ya une grande demande pour développer des hydrogels qui sont immunologiquement inerte, dotés de mécanismes de gélification cytocompatible qui peut être extrudé avec succès en utilisant la distribution de fluide, et aussi de produire une matrice de cellules chargées avec une gamme optimale de mécanique. Avant le processus d'impression, l'hydrogel bioink cellulaire chargé doit être stocké dans des seringues pour une quantité de temps, ce qui compromet la cellule de. Pendant le processus d'impression, la contrainte de cisaillement induite sur les cellules lors de l'extrusion peut également être préjudiciable à leur. Le bioprinter est capable de produire très viables (> 90%) des constructions, surmontant ainsi la question de l'ila mort cellulaire préside d'abord. Vascularisation joue un rôle essentiel dans la transmission, de support ou de préserver la fonction biomimétique de bioprinted. La diffusion de l'oxygène est m; donc plus grande bioprinted construit hypoxie est un. Des techniques classiques sont incapables de produire des constructions avec système vasculaire intégré, ce qui limite considérablement la taille des échafaudages productibles. L'évaluation de la viabilité des cellules de la bioprinter montré prolifération cellulaire significative dans les constructions imprimés de plus de 8 jours. Par conséquent, la technique prouve sa capacité à générer des échafaudages qui permettent la croissance cellulaire, la communication et la formation de réseaux, les exigences de la vascularisation.

Le bioprinter offre la possibilité d'utiliser une variété de matériaux à déposer rapidement hydrogels de cellules chargées dans les schémas spécifiques. Bien que cette technique permet de produire des constructions hétérogènes ayant des propriétés accordables, il est incapable de dépôt simultané et le mélange réactif. Pour certains biomatériaux, ce dépôt a rencontréhod permettrait d'améliorer le mécanisme de gélification et de raccourcir le temps de productio échafaudage. L'ajout d'un distributeur multi-seringue pourrait permettre à un plus large éventail de biomatériaux pour la technique de biofabrication. Enquête sur l'activité des cellules dans des constructions bioprinted sur une période de temps, offrirait plus d'informations sur les caractéristiques d'hydrogel, la formation du réseau cellulaire, et la vascularisation des constructions plus.

Le procédé de dépôt de la bioprinter décrit peut en outre impliquer un robot de positionnement et d'entraînement des trois distributeurs pour déposer une pluralité de matériaux biologiques sur des matériaux précédemment déposées selon un motif prédéterminé. Cette étape peut être répétée en utilisant les modes de croissant jusqu'à ce qu'un organe ou un tissu tridimensionnel est produit. Par conséquent, l'imprimante Palmetto est adapté pour distribuer de façon fiable des hydrogels chargés de cellules pour créer une construction en trois dimensions qui est capable de retenir le système vasculaire et la viabilité cellulaire élevée, et pourraitêtre utilisé dans des applications d'ingénierie tissulaire.

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le support de gouvernement en vertu de la concession numéro EPS-0903795 attribués par la National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), et Grant 8P20 GM103444 (YM PI).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Positioning Robot (JR2000 XYZ)	Janome
Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers	Fishman Corporation
Optical Light Sensors:	Keyensce
Displacement Laser: OD Mini	SICK
Recirculating Water Bath: Polystat	Cole-Parmer	EW-12122-02
USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP	AnMo Electrionics/YSC Technologies	AD7013MT
Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points	Janome		Comes with purchase of Janome Robot
Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder	RatioServ		Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads
Printer 3 cc Syringes:	Fishman Corporation	122051
22 G Dispenser Tips	Fishman Corporation	Z520122
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	10035-04-8
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Porcine Gelatin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Titanium Dioxide	Sigma-Aldrich	13462-67-7
Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate)	FMC BioPolymer	9005-38-3
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	7647-01-0
Ethylene Glycol	Mallinckrodt Baker, Inc	9300-01
Sodium Periodate	Sigma-Aldrich	7790-28-5
hADSC	Lonza	PT-5006	Store in vials in liquid nitrogen until use.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Gibco Life Technologies	11965-092	Warm in 37 °C water before use.
Trypsin/EDTA	Lonza	CC-5012	Warm in 37 °C water before use.
Calcein AM	Gibco Life Technologies	C3100MP	Store in the dark at -80 °C until use.
Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	L-3224	Store in the dark at -80 °C until use.
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M2933
N-Hydroxysuccinimide	Sigma-Aldrich	130672
1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)	Sigma-Aldrich	E1769	10 G
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium	Life Technologies	14040133	Warm in 37 °C water before use.
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium	Life Technologies	14190144	Warm in 37 °C water before use.
RGD Peptides	International Peptides
Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain	Invitrogen Life Technologies	A22283	Store at -20 °C until use
(4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain	Life Technologies	R37606	Store at -20 °C until use

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Viabilité de Bioprinted cellulaires constructions Utilisation d'une imprimante cartésienne Distributeur Trois

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