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Medicine

चूहे में रीढ़ की हड्डी की चोट की एक मॉडल के रूप में फोकल Ischemia Photothrombosis प्रेरित

Published: July 16, 2015 doi: 10.3791/53161
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri
* These authors contributed equally

Introduction

घाव रीढ़ की हड्डी में चोट (एससीआई) अनुसूचित जाति के ज्ञानेन्द्रिय और स्वायत्त कार्यों को प्रभावित करने वाले एक विनाशकारी नैदानिक ​​स्थिति है। एससीआई जीवित मरीजों को अक्सर काफी अपने दैनिक गतिविधियों और जीवन 1 की गुणवत्ता को प्रभावित करता है कि अंगों का पक्षाघात दुर्बल साथ छोड़ रहे हैं। प्रायोगिक एससीआई मॉडल एससीआई के pathophysiology और संबद्ध तंत्रिका मरम्मत प्रक्रियाओं को समझने के लिए वैज्ञानिक जांच में एक अनिवार्य उपकरण हो गया है। इन मॉडलों को भी कार्यात्मक वसूली करने के उद्देश्य से कर रहे हैं कि विभिन्न प्रयोगात्मक न्यूरोप्रोटेक्टिव हस्तक्षेप के पूर्व नैदानिक ​​प्रभावकारिता परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। वर्तमान में, व्यवहार में एससीआई मॉडल के बहुमत यंत्रवत् बाधित और अनुसूचित जाति को घायल करने के लिए भौतिक कुंद बल के प्रयोग को रोजगार। इन विधियों अनुसूचित जाति 2 की कुचलन, संपीड़न, अव्यवस्था और transection शामिल हैं। यह सुझाव दिया गया है कि प्राथमिक यांत्रिक अपमान घायल अनुसूचित जाति में में ischemia के सेट के रूप में एक माध्यमिक चोट के बाद 3,4। माध्यमिक ischemia के एटियलजि ऊतक शोफ 5-7 से रक्त वाहिकाओं में बाधा डालने से कभी कभी व्यापक ऊतक अध: पतन, parenchymal नकसीर और भी शामिल है। अनुसूचित जाति की अखंडता को आगे प्रभावित होता माध्यमिक चोट का एक परिणाम के रूप में, न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं गंभीर रूप से समारोह और व्यवहार्यता में प्रभावित कर रहे हैं और इस्कीमिक Penumbra निम्नलिखित स्ट्रोक के विकास के अनुरूप चोट के जीर्ण अवस्था के दौरान विकास रोधगलितांश की ओर जाता है जो एपोप्टोसिस, गुजरना 8,9। Excitotoxicity, मुफ्त कट्टरपंथी उत्पादन, और सूजन की तरह कई तंत्र एससीआई 10,11 निम्नलिखित इस्कीमिक कोशिका मृत्यु के लिए जिम्मेदार होने की सूचना दी गई है। इसके अलावा, अनुसूचित जाति ischemia के अक्सर रोगियों 12,13 में अंगों का पक्षाघात के लिए नेतृत्व जो thoraco-उदर महाधमनी धमनीविस्फार मरम्मत सर्जरी के लिए एक गंभीर समस्या है। इस तरह के उच्च नैदानिक ​​प्रभाव के बावजूद उच्च reproducibility के साथ रीढ़ की हड्डी ischemia के बहुत कुछ मॉडलों वर्तमान में उपलब्ध हैं।

NT "> Photothrombosis (पीटी) तकनीक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, काफी गैर इनवेसिव है। मस्तिष्क 14-20 में फोकल ischemia के शामिल करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि है और मस्तिष्क 17 के उजागर क्षेत्र में एक सटीक फोकल इस्कीमिक घाव का उत्पादन -21। इस गुलाब बंगाल (आरबी) 16-20,22 या Erythrosine बी जैसे प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित रंगों के प्रणालीगत प्रशासन द्वारा हासिल की है उचित प्रकाश स्रोत के साथ रक्त वाहिकाओं के स्थानीय विकिरण द्वारा पीछा 23। डाई के photoactivation मुक्त कण की पीढ़ी का कारण बनता है जो चिकनी संवहनी अन्तःचूचुक की अखंडता को बाधित, और प्लेटलेट्स बाद में पोत 24 द्वारा आपूर्ति क्षेत्र में एक रोधगलितांश में थक्का परिणामों के द्वारा। रक्त के प्रवाह में अवरोध एक थक्का रूपों, जो जमा करने के कारण। के कारण पर नियंत्रण करने में आसानी तीव्रता और विकिरण की अवधि इस प्रक्रिया के एक अत्यधिक वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रोधगलितांश अर्जित करता है। इसके अलावा, इस विधि एक infarc प्रेरित करने के लिए नियोजित किया जा सकताischemia के प्रभाव के स्थानिक (जैसे, बनाम सफेद पदार्थ ग्रे मैटर) समझ को सक्षम करने के विभिन्न संरचनात्मक स्थानों पर टी।

वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य चूहों में अनुसूचित जाति ischemia के लिए एक आसान और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल विकसित करना है। हम चूहों में अनुसूचित जाति ischemia के एक पीटी मॉडल की प्रक्रिया का वर्णन किया। ऊतक विज्ञान और immunostaining परिणाम से पीटी प्रभावी रूप से अनुसूचित जाति रोधगलन, न्यूरोनल हानि और प्रतिक्रियाशील gliosis पैदा कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया।

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Protocol

नोट: चूहों (C57BL / 6J, पुरुष) वृद्ध 10-12 सप्ताह के इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया। सभी प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे और मिसौरी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. पूर्व सर्जरी

  1. और शल्य चिकित्सा आटोक्लेव पहले दिन सभी सर्जिकल उपकरणों बाँझ। (121 ओ सी, 15 साई, 30/30 चक्र) सुखाने के 30 मिनट के द्वारा पीछा 30 मिनट के लिए 15 साई में 121 ओ सी पर उपकरणों और आटोक्लेव लपेटें। आगे उपयोग करें जब तक एक स्वच्छ और बाँझ वातावरण में यंत्र रखें।
  2. ताजा गुलाब बंगाल (आरबी) समाधान (बाँझ खारा में 20 मिलीग्राम / एमएल) सर्जरी से पहले हर समय तैयार करें। आगे सुर के दौरान इस्तेमाल किया जब तक पूरी तरह से आरबी, भंवर तो 19 डब्ल्यू लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब और प्रकाश से बचाने के बिजली उत्पादन के साथ 50/60 हर्ट्ज पर 5 मिनट के लिए sonication के द्वारा पीछा ट्यूब को भंग करने के लिएGery।
  3. बाँझ खारा में ketamine / xylazine का एक मिश्रण तैयार करें। संवेदनाहारी मिश्रण का 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा बनाने के लिए और बाँझ खारा के 550 μl: और ketmaine के 325 μl (100 मिलीग्राम / एमएल शेयर एकाग्रता): xylazine के 125 μl (20 मिलीग्राम / एमएल शेयर एकाग्रता) जोड़ें।
  4. Homeothermic हीटिंग पैड पूर्व गर्म।
  5. दीपक सत्ता को स्थिर करने के लिए 30 मिनट के लिए धातु halide दीपक (FN1 महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के लिए प्रकाश स्रोत) पूर्व गर्म।
  6. 10X उद्देश्य और ईमानदार FN1 महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप में क्षेत्र डायाफ्राम का समायोजन करके एक लजीला व्यक्ति का उपयोग कर 1 मिमी की एक व्यास के प्रबुद्ध क्षेत्र के आकार को समायोजित करें।

2. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया

  1. Ketamine (130 मिलीग्राम / किग्रा बी WT।) और xylazine की एक खुराक के साथ माउस anesthetize (10 मिलीग्राम / किग्रा बी WT।)। 1.3 में कॉकटेल के आधार पर, माउस बी WT के ग्राम प्रति 4 μl। जरूरत है। एक शराब झाड़ू के साथ इंजेक्शन के स्थल जीवाणुरहित और इंट्रा के माध्यम से anesthetics प्रशासन-peritoneal (आईपी) मार्ग। जानवर की प्रेरण और वसूली में देरी होगी इस रूप में रक्त वाहिकाओं या मांसपेशी में एनेस्थेटिक्स इंजेक्षन करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
  2. सुखाने को रोकने और हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए हीटिंग पैड पर पशु जगह करने के लिए माउस के दोनों आंखों को कृत्रिम आँसू मरहम लागू करें।
  3. पशु की तैयारी
    1. पैर के अंगूठे चुटकी प्रतिक्रिया का उपयोग करके उचित शल्य स्तर संज्ञाहरण के लिए जानवरों की जाँच करें।
    2. पशु संज्ञाहरण की शल्य चिकित्सा के स्तर तक पहुँच गया है, एक बिजली के बाल trimmer का उपयोग कर पशु के midline के आसपास पृष्ठीय सतह पर हेयर क्लिप। Betadine समाधान के लिए तीन बार के द्वारा पीछा 70% इथेनॉल के साथ शल्य साइट रगड़ कर साफ करें। अगले कदम के लिए जब तक एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा के साथ साइट कवर।
  4. पतली हड्डी करने के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए
    1. शल्य मंच (चित्रा 1 ए) पर homeothermic हीटिंग पैड पर एक प्रवण स्थिति में माउस रखें। ठीक माउस सुरक्षितएक थूथन क्लैंप का उपयोग करते हुए आसन एक लम्बी गर्दन क्षेत्र (चित्रा 1 ए, बी) बनाए रखने के लिए।
    2. टी 12 के लिए थोरैसिक कशेरुकाओं T9 से देने पृष्ठीय मध्य रेखा के साथ शल्य कैंची का उपयोग (लगभग 1 सेमी लंबे) एक चीरा बनाओ। शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए त्वचा को एक तरफ ले जाएं।
    3. एक स्केलपेल का प्रयोग, ध्यान T9 पर पृष्ठीय कांटों का पर्दाफाश करने के लिए पेशी साफ - टी 12 कशेरुकाओं। बाँझ कपास झाड़ू के साथ कोमल दबाव लागू करने के द्वारा प्रत्येक चरण में रक्तस्राव को रोकने के। अलग T10 - आसपास पेशी से टी 12 कशेरुकाओं और स्थिर करने और किसी भी आंदोलन को रोकने के लिए एक कशेरुकी दबाना का प्रयोग कर उन्हें सुरक्षित (चित्रा 1 ए, बी)।
    4. ध्यान से और धीरे पतली, T10 या T11 बांस के पृष्ठीय सतह हड्डी चमकाने ड्रिल बिट के साथ एक उच्च गति ड्रिल का प्रयोग अनुसूचित जाति (चित्रा 1C) के पृष्ठीय सतह पर पीछे रीढ़ की नस और अन्य छोटे जहाजों कल्पना करने के लिए।
    5. कारण thinning के प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न गर्मी के लिए थर्मल नुकसान को रोकने के लिए,मलबे को हटाने के लिए लगातार चूषण के साथ साथ सामान्य नमक की एक सौम्य और निरंतर प्रवाह लागू होते हैं।
    6. मुख्य पोत स्पष्ट रूप से दिखाई देता है जब तक एक स्केलपेल का उपयोग सावधानी से हड्डी सतह चिकनी। इस प्रक्रिया के दौरान रीढ़ की हड्डी को नुकसान नहीं ख्याल रखना।
    7. रक्त वाहिनियों की कल्पना की है एक बार, एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर रेट्रो कक्षीय साइनस मार्ग के माध्यम से 30 मिलीग्राम / किग्रा (शरीर के वजन) की एक खुराक पर आरबी प्रशासन।
    8. आरबी इंजेक्शन के बाद 3 मिनट के बाद एक लेजर डॉपलर प्रवाहमापी का उपयोग करते हुए रक्त के प्रवाह को मापने यदि आवश्यक (2A चित्रा, बी)। पूरी प्रक्रिया के दौरान अपूतिता बनाए रखें।

पीटी के 3. प्रेरण

  1. ऊंचाई समायोजित कर सकते हैं जो एक प्रयोगशाला जैक के ऊपर एक XY स्थिति समायोज्य मंच पर पशु रखें। T11 रीढ़ की हड्डी के उजागर क्षेत्र FN1 महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) के 10x उद्देश्य के तहत सीधे है तो माउस की स्थिति को समायोजित करें।
  2. ली की सत्ता सेट12% से कम ght स्रोत और पतला रीढ़ की हड्डी के बीच में 0.75 मिमी की एक व्यास के साथ T11 क्षेत्र चमकाना: - जो 580 एनएम, एक हरे रंग का प्रकाश (तरंग दैर्ध्य 540 के साथ (नोट: यह क्षेत्र पीछे रीढ़ की नस और अन्य केशिकाओं भी शामिल है) 2 मिनट के लिए 10X उद्देश्य के माध्यम से माइक्रोस्कोप में फिल्टर क्यूब) द्वारा हासिल की। शुरुआत और विकिरण के अंत (चित्रा 3 बी, सी) पर चित्र लेने और इस बिंदु पर प्रयोग के समय रिकॉर्ड।
  3. 2.4.8 के रूप में रीढ़ की हड्डी के ऊपर एक ही स्थिति के लिए लेजर डॉपलर जांच रखकर 10 मिनट यदि आवश्यक हो तो के लिए फिर से रक्त प्रवाह को मापने (2A चित्रा, बी)।
  4. किसी भी नकसीर के लिए और अगर विकिरण की जांच करने के बाद कोई नहीं मिला पशु suturing के लिए आगे बढ़ें। एक absorbable सीवन या 4-0 आकार रेशम सीवन का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी के दोनों ओर पर मांसपेशियों के साथ सतही प्रावरणी सीवन। उजागर अनुसूचित जाति को नुकसान नहीं ख्याल रखना। 4-0 रेशम सीवन के साथ त्वचा सीवन। Betadine या आयोडीन लागू करेंsuturing के बाद त्वचा के किनारों के लिए।

4. के बाद सर्जरी की देखभाल

  1. Suturing के बाद वसूली के लिए हीटिंग पैड पर जानवरों की जगह। ठीक होने के बाद दोनों हिंद अंगों के आंदोलन को देख कर न्यूरोलॉजिकल घाटा के संकेत के लिए जानवरों की जाँच करें। यह sternal अवलंबन बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक पहुंच के बाहर जानवर मत छोड़ो।
  2. घर पिंजरे में जानवरों के स्थानांतरण। पूरी तरह से ठीक है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है कि पशु वापस नहीं है।
  3. नियमित अंतराल पर जानवरों की जाँच करें। गंभीर मस्तिष्क संबंधी घाटे के मामले में, मूत्राशय की निकासी, दर्दनाशक दवाओं के प्रशासन (- 0.1 मिलीग्राम / किग्रा buprenorphine, 0.05) की तरह उचित देखभाल प्रदान करते हैं। निर्जलीकरण के लिए जाँच करें और गंभीर मामले में सामान्य खारा subcutaneously प्रशासन। आमतौर पर, buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) शल्य साइट में दर्द को दूर करने के लिए suturing के बाद प्रशासित किया जाएगा।
  4. जानवरों के तुरंत नहीं कर रहे हैंजानवरों को आसानी से भोजन तक पहुँच सकते हैं ताकि सर्जरी के बाद euthanized, हम पिंजरे मंजिल पर उच्च पानी सामग्री आहार रखा जाएगा।

5. Transcardial छिड़काव, Nissl धुंधला और immunostaining

  1. पहले से 17-20 के रूप में वर्णित transcardially पशु छिड़कना।
    1. प्रोटोकॉल में पहले बताया और transcardially ठंडा 4% paraformaldehyde के पीबीएस में (पीएफए) के द्वारा पीछा फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.4), के साथ छिड़कना के रूप में पशु anesthetize।
    2. छिड़काव के बाद, रीढ़ की हड्डी (अनुसूचित जाति) को हटाने और 4 डिग्री सीओ / एन पीबीएस में 4% पीएफए ​​में पोस्ट-ठीक। 30% sucrose के साथ पीबीएस में तय अनुसूचित जाति स्थानांतरण और 2 के लिए इसे रख - यह ट्यूब के नीचे डूब तक 3 दिनों के लिए।
    3. एक cryostat का उपयोग 30 माइक्रोन मोटी वर्गों में रीढ़ की हड्डी में कटौती और एक जिलेटिन लेपित गिलास स्लाइड पर या 0.01 एम पीबीएस के साथ एक 48 अच्छी तरह से थाली में क्रमानुसार उन्हें जगह है।
  2. Nissl धुंधला: एक Nissl staini प्रदर्शन पीटी की वजह से चोट का निरीक्षण करने के लिएरीढ़ की हड्डी वर्गों पर एनजी के रूप में पहले 17-20 का वर्णन किया।
    1. संक्षेप में, 0.25% cresyl बैंगनी साथ हर पांचवें रीढ़ की हड्डी गिलास स्लाइड पर टुकड़ा और दाग इकट्ठा। दाग वर्गों (चित्रा 4) की छवियों को ले लो।
  3. Immunostaining: पहले एक अस्थायी खंड विधि 17,18,20 का उपयोग कर के रूप में वर्णित।
    1. खरगोश विरोधी NeuN एंटीबॉडी (1: 300), और खरगोश विरोधी: संक्षेप में, खरगोश विरोधी glia fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (300 1) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन incubating द्वारा रीढ़ की हड्डी वर्गों दाग Iba1 एंटीबॉडी (1: 500) गधा विरोधी खरगोश एलेक्सा 568 संयुग्मित आईजीजी (1: 400) के द्वारा पीछा आरटी पर 4 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी। एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन (चित्रा 5) के साथ छवियों को ले लो।

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Representative Results

इस अध्ययन का उद्देश्य एक पीटी मॉडल का उपयोग चूहों में रीढ़ की हड्डी ischemia के उत्पादन के लिए किया गया था। रीढ़ की हड्डी (T10 - टी 12) के ऊपर हड्डी के वांछित क्षेत्र के बाद पतला किया गया था, गुलाब बंगाल रेट्रो कक्षीय साइनस मार्ग के माध्यम से इंजेक्ट किया गया था, और ischemia पीटी द्वारा प्रेरित किया गया था चित्रा 1 ए, बी में तैनात माउस को दिखाने के लिए एक कस्टम बनाया शल्य। सर्जरी के दौरान मंच। माउस एक थूथन दबाना द्वारा जगह में आयोजित किया गया था और दो ​​समायोज्य कशेरुकी रीढ़ की हड्डी को स्थिर करने के लिए clamps चित्रा 1C टी 10 की रीढ़ की हड्डी के ऊपर एक पतला खिड़की शो -। T12। मुख्य रक्त वाहिका और अपनी शाखाओं स्पष्ट रूप से देखे जा सकते हैं। Ischemia के प्रेरण की पुष्टि करने के लिए, रक्त के प्रवाह में परिवर्तन करने से पहले और पीटी के बाद एक लेजर डॉपलर प्रवाहमापी का उपयोग करके मापा गया था (2A चित्रा, बी)। विश्लेषण के लिए, रक्त के प्रवाह के% में कमी photothrombosis से पहले आधारभूत रक्त प्रवाह का उपयोग कर की गणना की गई। डब्ल्यू तुलना में रक्त प्रवाह प्रकाश रोशनी के तुरंत बाद 20% ~ को गिरा दियापूर्व रोशनी करने के लिए बेसल स्तर रबर। चित्रा 3 बी, सी शुरुआत है और पीटी के अंत में रीढ़ की हड्डी की रक्त वाहिकाओं के फ्लोरोसेंट छवियों से पता चलता है। लेजर डॉपलर प्रवाहमापी की माप के साथ संगत ischemia के प्रेरण, सुझाव दे रक्त वाहिकाओं (चित्रा -3 सी) में 2 मिनट प्रेरित खून का थक्का, रोशनी के लिए। पीटी और Nissl धुंधला प्रदर्शन किया गया था के बाद पीटी की वजह से चोट का निरीक्षण करने के लिए, चूहों 3 दिन के बलिदान किया गया। Nissl धुंधला निम्नलिखित लिया छवियों स्पष्ट रूप से पीटी के बाद रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को नुकसान और कोशिका मृत्यु का संकेत है, आसपास के क्षेत्र से सीमांकन किया जा सकता है कि रोधगलितांश क्षेत्र (चित्रा 4) से पता चला है। Immunostaining NeuN, GFAP और Iba1 के लिए प्रदर्शन किया था। GFAP अभिव्यक्ति (भी बॉक्सिंग क्षेत्र में देखते हैं, चित्रा 5 ब) इस्कीमिक कोर की सीमा में वृद्धि की गई थी, जबकि NeuN + न्यूरॉन्स, इस्कीमिक कोर (चित्रा 5A) में ग्रे मामले में खो गए थे। Iba1 + microglia एक GLOBOID में mor का प्रदर्शनphology वृद्धि हुई Iba1 अभिव्यक्ति (चित्रा 5C) के साथ (अर्थात।, छोटे और कम प्रक्रियाओं के साथ एक बढ़े हुए सेल शरीर, बॉक्सिंग क्षेत्र देखें)। कारण अस्थायी खंड धुंधला करने के लिए इस्कीमिक कोर क्षेत्र में एक ऊतक नुकसान नहीं हुआ था हालांकि, पूरे पेरी-रोधगलितांश क्षेत्र में GFAP और Iba1 अभिव्यक्ति में वृद्धि स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। इन परिणामों के अनुसूचित जाति ischemia के बाद Penumbra में neuronal मौत और प्रतिक्रियाशील gliosis संकेत मिलता है। दूसरी ओर, पर्याप्त कार्यात्मक घाटे हिंद अंगों का पक्षाघात (मूवी देखें) का संकेत है, पीटी के बाद यानी, अक्षम लोगों के लिए हिंद अंग आंदोलन एक दिन, घायल चूहों में मनाया गया।

चित्र 1
रीढ़ की हड्डी में चित्रा 1. पीटी प्रेरित ischemia के मॉडल। (ए) रीढ़ की हड्डी पीटी के लिए शल्य चिकित्सा मंच की तस्वीरें। इनसेट: वर्टिब्रल clamps के बढ़े।(बी) माउस एक थूथन दबाना द्वारा और मंच पर दो कस्टम बनाया वर्टिब्रल clamps के द्वारा आयोजित किया गया था। हड्डी टी 10 में पतला हो गया था कि सूचना -। T12 क्षेत्र और दो ​​धातु वर्टिब्रल clamps के रीढ़ की हड्डी को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया (सी) एक ज़ूम छवि के लिए T10-11 में रीढ़ की हड्डी के ऊपर पतला-हड्डी के साथ क्षेत्र दिखा पीटी की प्रेरण। मुख्य रक्त वाहिकाओं और उसकी शाखाओं पर ध्यान दें। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2

चित्रा 2. स्पाइनल कॉर्ड रक्त प्रवाह माप। (ए) के जांच की स्थिति के लिए एक लेजर डॉपलर प्रवाहमापी और stereotaxic डिवाइस का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी की सतह रक्त प्रवाह माप की स्थापना। (बी)पीटी पहले और बाद में स्पाइनल कॉर्ड रक्त के प्रवाह को मापा गया था। इस प्रयोग में, पीटी एक 12% बिजली उत्पादन के साथ 2 मिनट के लिए एक प्रकाश स्रोत के साथ रोशन द्वारा प्रेरित किया गया था। विकिरणित सतह का व्यास 0.75 मिमी था और रीढ़ की हड्डी के बीच में था। रक्त प्रवाह पीटी से पहले स्थिर संकेत प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए ऊपर के लिए और पीटी के बाद 10 मिनट के लिए ऊपर दर्ज किया गया था। प्रत्येक माउस से डेटा पूर्व प्रकाश रोशनी करने के लिए मूल्य के लिए सामान्यीकृत किया गया था। ग्राफ 3 चूहों से डेटा का औसतन मूल्य से पता चलता है। तीर पीटी की शुरुआत का संकेत है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन

एक चित्रा 3. रीढ़ की हड्डी ischemia के पीटी-प्रेरित किया। (ए) तस्वीरमाउस रीढ़ की हड्डी में प्रेरण पीटी के लिए माइक्रोस्कोप पर रख दिया गया। माउस की स्थिति आयामी XY ग्लाइडिंग मंच और एक प्रयोगशाला जैक का उपयोग तीन में समायोजित किया जा सकता है। 10X उद्देश्य से लाइट रीढ़ की हड्डी की सतह पर ध्यान केंद्रित किया गया। (ईसा पूर्व) के इंजेक्शन के बाद (सी) रोशनी (बी) के पहले और बाद में रीढ़ की हड्डी में रक्त वाहिकाओं के फ्लोरोसेंट छवियों बंगाल गुलाब। विकिरण (सी) के 2 मिनट (तीर देखें) के बाद खून का थक्का सूचना है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
रीढ़ की हड्डी के चित्रा 4. Nissl धुंधला। सामान्य (वर्गों में शामिल हैं कि व्याख्यान चबूतरे-टू-दुम रीढ़ की हड्डी की अनुप्रस्थ वर्गों की एक श्रृंखला के Nissl धुंधला छवियों1 और 6) और पीटी प्रेरित उपरिकेंद्र (वर्गों 2-5)। चूहों 3 दिन पीटी के बाद बलिदान किया गया। प्रत्येक रीढ़ की हड्डी की धारा 30 माइक्रोन मोटी है। दो वर्गों के बीच का अंतराल 750 माइक्रोन है। 3 छवि में धराशायी लाइन रोधगलितांश क्षेत्र की रूपरेखा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5

NeuN, GFAP और Iba1 चित्रा 5. Immunostaining। NeuN (ए) के फ्लोरोसेंट छवियों, GFAP सामान्य (ऊपरी पैनल) से (बी) और Iba1 (सी) धुंधला और कम (पैनल) रीढ़ की हड्डी वर्गों पीटी घायल हो गए। घायल माउस 3 दिन पीटी के बाद बलिदान कर दिया गया था। धराशायी लाइनों सामान्य ऊतकों से रोधगलन क्षेत्रों को अलग। बॉक्सिंग क्षेत्रों में 50 के पैमाने पट्टी के साथ GFAP और Iba1 अभिव्यक्ति के उच्च संकल्प छवियों को दिखानेमाइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1
मूवी । रीढ़ की हड्डी में पीटी व्यवहार घाटे प्रेरित किया। फिल्म एक सामान्य और एक पिंजरे में एक पीटी घायल माउस के आंदोलन से पता चलता है। हिन्द-अंग (अंगों का पक्षाघात) के पक्षाघात का संकेत है, inured रीढ़ की हड्डी के साथ माउस के दोनों हिंद अंग खींचने पर ध्यान दें। फिल्म घायल माउस में पीटी के बाद 24 घंटे के लिए लिया गया था।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम अनुसूचित जाति ischemia के एक photothrombotic मॉडल का वर्णन किया। कारण प्रगति के लिए जेनेटिक इंजीनियरिंग में यह संभव अनुसूचित जाति में इस्कीमिक pathophysiology में शामिल विशिष्ट जीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बनाया गया है, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसजेनिक चूहों में वृद्धि हुई है। अध्ययन का उद्देश्य रीढ़ की हड्डी ischemia के एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माउस मॉडल विकसित करने के लिए किया गया था। यहाँ हम चूहों में एससीआई के लिए प्रेरित करने के लिए एक कॉर्टिकल पीटी मॉडल रूपांतरित किया। सर्जरी T11 वक्ष बांस के स्तर पर चूहों की पृष्ठीय पहलू पर पीछे रीढ़ की नस और केशिकाओं के बाद खुल गए थे। तब आरबी, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित डाई, वांछित संवहनी वितरण प्राप्त करने के लिए रेट्रो कक्षीय साइनस मार्ग के माध्यम से इंजेक्ट किया गया था। उजागर रक्त वाहिका तो थक्का की और बाद में एक रोधगलितांश पर गठन को प्रेरित करने के लिए एक हरे रंग की रोशनी से विकिरणित किया गया था। ऊतकीय और immunostaining के तरीकों से हमारे परिणाम पीटी रीढ़ की हड्डी और reacti में एक रोधगलितांश प्रेरित पता चला है किपेरी-रोधगलितांश क्षेत्र में gliosis किया है। पिछले अंग पक्षाघात जैसे न्यूरोलॉजिकल घाटा भी मनाया गया। इन आंकड़ों पीटी एससीआई के बाद pathophysiology और कोशिका मृत्यु के तंत्र के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल है कि सलाह देते हैं। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम अनुसूचित जाति के पृष्ठीय सतह पर रक्त वाहिनियों के दृश्य के लिए बांस की पतली सतह के लिए एक उच्च गति ड्रिल का इस्तेमाल होता है। यह कदम सावधानी से ड्रिल रीढ़ की गुहा में प्रवेश और अनुसूचित जाति को नुकसान करने के लिए कारण हो सकता है अतिरिक्त दबाव के आवेदन के रूप में किया जाना चाहिए। दूसरी ओर, असमान thinning के अनुचित रोशनी में परिणाम हो सकता है और अनियमित दौरे उत्पादन हो सकता है। इस मुद्दे के समाधान के लिए, ड्रिलिंग के प्रत्येक छोटे कदम के बाद खुर्दबीन के नीचे की हड्डी की सतह के लगातार निरीक्षण हड्डी की मोटाई का मूल्यांकन करने के लिए और आगे ड्रिल के उपयोग का आकलन करने के लिए सिफारिश की है। बाँझ खारा का उपयोग उजागर सतह के बेहतर दृश्य के लिए के रूप में अच्छी तरह से मलबे वार्शआउट की सिफारिश की है। विपक्ष को बनाए रखने केपूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान उग्रवादी अपूतिता, पशु की उचित शल्य चिकित्सा के बाद देखभाल पशु बचे रहने में सुधार लाने और प्रयोगों की सफलता की दर में वृद्धि कर सकते हैं।

पीटी के हमारे वर्तमान मॉडल कर सकते हैं (जैसे पारा लैंप, धातु halide दीपक, या 488 एनएम तरंग लंबाई की लेजर के रूप में) एक प्रकाश स्रोत के साथ एक महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ सुसज्जित है कि किसी भी प्रयोगशाला के रूप में किसी भी महंगे उपकरणों की खरीद, की आवश्यकता नहीं है इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, इस तकनीक जटिल हैं और जो कर रहे हैं महाधमनी के संयुक्त रोड़ा, बाएं अवजत्रुकी और आंतरिक स्तन धमनी 25 और संशोधित महाधमनी पार clamping के विधि 26 जैसे अन्य अनुसूचित जाति ischemia के मॉडल की तुलना में एपर्चर आकार का समायोजन करके रोधगलितांश के आकार पर नियंत्रण प्रदान करता है बेहद आक्रामक। हमारे मॉडल में दृश्य के लिए बांस की पतली पृष्ठीय सतह के लिए एक उच्च गति ड्रिल एससीआई प्रेरित करने के लिए कई प्रयोगशालाओं द्वारा एक Laminectomy करने के लिए वैकल्पिक, पसंद की विधि के रूप में चुना गया था।Laminectomy कारण वर्टिब्रल रक्त वाहिकाओं के transection करने के लिए अत्यधिक रक्तस्राव के कारण हो सकता है और इस इमेजिंग के लिए क्षेत्र अस्पष्ट हो सकता है कशेरुकाओं के काटने शामिल है। कुछ प्रोटोकॉल यह संपीड़न में हो सकता है laminectomy के दौरान अत्यधिक रक्तस्राव बाहर खाली करने के लिए कपास swabs के उपयोग की सलाह है हालांकि जो अनुसूचित जाति के लिए अतिरिक्त चोट के कारण हो सकता है। इसके अलावा रीढ़ की हड्डी के उजागर सतह रक्त और उसके घटकों के साथ सीधे संपर्क के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रयोग करने के लिए अनावश्यक परिवर्तनशीलता जोड़ सकते हैं जो कटौती की हड्डियों के तेज किनारों में आ सकते हैं। वर्तमान पीटी मॉडल का उपयोग करना, विभिन्न आकार और गहराई के साथ रोधगलन प्रकाश स्रोत, उजागर सतह के जोखिम और क्षेत्र की अवधि की तीव्रता के सरल हेरफेर द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन अनुसूचित जाति में T11 के मध्य क्षेत्र पर ischemia के उत्पन्न हालांकि, इस पद्धति का भी व्याख्यान चबूतरे-टू-दुम साथ विभिन्न स्थानों पर दौरे के साथ ही रीढ़ की हड्डी, जो मिग के पार्श्व दिशा उत्पन्न कर सकते हैंहिंदुस्तान टाइम्स के अंगों का पक्षाघात पर ischemia के क्षेत्र विशेष के प्रभाव को समझने को फायदा होगा। रोशनी रीढ़ की हड्डी की सतह पर है, हालांकि दूसरी ओर, प्रकाश ऊतक में निश्चित गहराई तक घुसना सकता है और चोट भी ग्रे मामले में प्रेरित किया जा सकता है। गुलाब बंगाल पूरे परिसंचरण तंत्र में वितरित किया जाता है के रूप में पशु प्रजातियों वही कर रहे हैं, और उम्र और वजन के समान होते हैं, तो हम लगातार घाव पीटी द्वारा प्रेरित कॉर्टिकल ischemia के रूप में उत्पन्न हो जाएगा उम्मीद है।

पीटी प्रेरित ischemia के अन्य प्रमुख लाभ जानवरों की बहुत कम मृत्यु दर है। कम मृत्यु दर में लंबे समय तक जीवित रहने के अध्ययन के अस्तित्व और मोटर समारोह वसूली पर इस्कीमिक चोट के अस्थायी प्रभाव unraveling में उपयोगी हो सकता है, जो किया जा सकता है इसका मतलब है। यह मॉडल भी आमतौर पर चोट 14,19,27-29 की जीर्ण अवस्था में देर होती है जो सेलुलर मरम्मत तंत्र को समझने में सहायता कर सकते हैं। यह मॉडल भी कर सकते हैं ख जो काफी मोटर समारोह घाटे का उत्पादनई कार्यात्मक वसूली पर न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंटों की प्रभावकारिता का आकलन किया। इसके अलावा, इस मॉडल को भी इस तरह के axonal अध: पतन और उत्थान, neuronal और astrocytic सीए 2 + संकेतन और दो ​​photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग लाइव चूहों में अधिक भार के रूप में एससीआई के बाद रोग परिवर्तन के अध्ययन के लिए अनुमति देगा।

अन्य सभी एससीआई मॉडल की तरह, पीटी कमियां से रहित नहीं है। इस तकनीक का नुकसान कॉर्टिकल पीटी में देखा उन लोगों के लिए समान हैं। कमियों के कुछ ही कई न्यूरोप्रोटेक्टिव दवाओं का लक्ष्य है जो एक anatomically स्पष्ट इस्कीमिक Penumbra, की कमी है, और reperfusion के अभाव में शामिल हैं। यह अच्छी तरह से reperfusion की निम्न वृद्धि हुई ischemia के प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन, भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ और बढ़ साइटोकाइन उत्पादन 30-32 की तरह परिवर्तन की विशेषता है कि जाना जाता है। पीटी में reperfusion की कमी के कारण अनुसूचित जाति में reperfusion की चोट के साथ जुड़े परिवर्तन इस मॉडल का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए मुश्किल रहेगा मतलब है।हालांकि, पीटी प्रेरित ischemia के प्रयोग के लाभ नुकसान पल्ला झुकना और इस तकनीक का एक प्रदर्शन करने के लिए आसान है और चूहों में एससीआई पैदा करने में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है।

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Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान [अनुदान कोई द्वारा समर्थित किया गया। R01NS069726] और सहायता अनुदान में अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान [अनुदान नहीं। 13GRNT17020004] एसडी करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rose Bengal Sigma-Aldrich 330000 20 mg/ml in sterile saline
C57BL/6J Jackson lab 664 22 - 25 g
Ketamine  VEDCO NDC-50989-996-06 100 mg/ml
Xylazine  VEDCO NDC-50989-234-11 100 mg/ml
Betadine solution Purdue NDC-67618-150-01 10% povidone iodine topical solution
Normal saline Abott Laboratories 04930-04-10 For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying
Artificial tears ointment  Rugby NDC-0536-6550-91 83% white petrolatum
Ethanol Decon labs.Inc 2716 70% ethanol for disinfection
Metal halide lamp EXFO, Canada X-Cite 120 PC  Set power at 12%
Spring scissors  Fine Science Tool 15000-10 for minor dissection
Scissors (angled to side) Fine Science Tool 14063-011 No. 3 handle
Standard scalpel Fine Science Tool 10003-12 for removing muscle
Scalpel blade Feather 2976 No. 10
Forceps (curved) Fine Science Tool 11150-10 for holding tissue
Forceps (straight) Fine Science Tool 11151-10 for holding tissue
Needle holder  Fine Science Tool 12002-12 for suturing
Tissue adhesive glue 3M Vetbond 1469SB to adhere to edges of the cut skin
Monofilament polypropylene  USSC Sutures VP-521 Size = 4-0 (for fascia)
Perma-hand silk Ethicon 683G Size = 4-0 (for skin)
Micro drill Roboz Surgical Instrument Co. Inc. RS-6300 with bone polishing drill bit
Laser doppler flowmeter Moor Instruments moorVMS-LDF1 for monitoring change in blood flow
Heating pad Fine Science Tool 21052-00 to prevent hypothermia
Lab-Jack Fisher scientific  14-673-50 4 x 4 in plate to adjust the height of the animal
X-Y gliding stage  Amscope GT100 for positioning the animal under microscope  

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References

  1. Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
  2. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  3. Young, W. Secondary injury mechanisms in acute spinal cord injury. J Emerg Med. 11, Suppl 1. 13-22 (1993).
  4. Crowe, M. J., Bresnahan, J. C., Shuman, S. L., Masters, J. N., Beattie, M. S. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat Med. 3 (1), 73-76 (1997).
  5. Soubeyrand, M., et al. Effect of norepinephrine on spinal cord blood flow and parenchymal hemorrhage size in acute-phase experimental spinal cord injury. Eur Spine J. 23 (3), 658-665 (2014).
  6. Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (2012).
  7. Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis). Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
  8. Liu, X. Z., et al. Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J Neurosci. 17 (14), 5395-5406 (1997).
  9. Liu, L., et al. An experimental study of cell apoptosis and correlative gene expression after tractive spinal cord injury in rats. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 42 (23), 1434-1437 (2004).
  10. Hirose, K., et al. Activated protein C reduces the ischemia/reperfusion-induced spinal cord injury in rats by inhibiting neutrophil activation. Ann Surg. 232 (2), 272-280 (2000).
  11. Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
  12. Guerit, J. M., Dion, R. A. State-of-the-art of neuromonitoring for prevention of immediate and delayed paraplegia in thoracic and thoracoabdominal aorta surgery). Ann Thorac Surg. 74 (5), S1867-S1869 (2002).
  13. Schepens, M. A., Heijmen, R. H., Ranschaert, W., Sonker, U., Morshuis, W. J. Thoracoabdominal aortic aneurysm repair: results of conventional open surgery. Eur J Vasc Endovasc Surg. 37 (6), 640-645 (2009).
  14. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp Transl Stroke Med. 1, 8 (2009).
  15. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  16. Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 1. Time course of hemodynamic consequences. J Cereb Blood Flow Metab. 6 (2), 184-194 (1986).
  17. Zhang, W., et al. Neuronal protective role of PBEF in a mouse model of cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (12), 1962-1971 (2010).
  18. Li, H., Zhang, N., Sun, G., Ding, S. Inhibition of the group I mGluRs reduces acute brain damage and improves long-term histological outcomes after photothrombosis-induced ischaemia. ASN Neuro. 5 (3), 195-207 (2013).
  19. Li, H., et al. Histological, cellular and behavioral assessments of stroke outcomes after photothrombosis-induced ischemia in adult mice. BMC Neurosci. 15, 58 (2014).
  20. Wang, T., Cui, W., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2 (1), 33-42 (2010).
  21. Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J Neurosci Methods. 117 (1), 43-49 (2002).
  22. Boquillon, M., Boquillon, J. P., Bralet, J. Photochemically induced, graded cerebral infarction in the mouse by laser irradiation evolution of brain edema. J Pharmacol Toxicol Methods. 27 (1), 1-6 (1992).
  23. Kim, G. W., Lewen, A., Copin, J., Watson, B. D., Chan, P. H. The cytosolic antioxidant, copper/zinc superoxide dismutase, attenuates blood-brain barrier disruption and oxidative cellular injury after photothrombotic cortical ischemia in mice. Neuroscience. 105 (4), 1007-1018 (2001).
  24. Schmidt, A., et al. Photochemically induced ischemic stroke in rats. Exp Transl Stroke Med. 4 (1), 13 (2012).
  25. Lang-Lazdunski, L., et al. Spinal cord ischemia. Development of a model in the mouse. Stroke. 31 (1), 208-213 (2000).
  26. Wang, Z., et al. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J Neurosci Methods. 189 (2), 246-251 (2010).
  27. Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. J Vis Exp. (76), (2013).
  28. Lu, H., et al. Induction and imaging of photothrombotic stroke in conscious and freely moving rats. J Biomed Opt. 19 (9), 96013 (2014).
  29. Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Front Neuroenergetics. 6 (1), (2014).
  30. Bell, M. T., et al. Toll-like receptor 4-dependent microglial activation mediates spinal cord ischemia-reperfusion injury. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S152-S156 (2013).
  31. Smith, P. D., et al. The evolution of chemokine release supports a bimodal mechanism of spinal cord ischemia and reperfusion injury. Circulation. 126 (11 Suppl 1), S110-S117 (2012).
  32. Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50 (4), 264-274 (2012).

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चिकित्सा अंक 101 रीढ़ की हड्डी में चोट photothrombosis गुलाब बंगाल ischemia महामारी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी प्रतिक्रियाशील gliosis रोधगलितांश अंगों का पक्षाघात
चूहे में रीढ़ की हड्डी की चोट की एक मॉडल के रूप में फोकल Ischemia Photothrombosis प्रेरित
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Li, H., Roy Choudhury, G., Zhang, N., Ding, S. Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice. J. Vis. Exp. (101), e53161, doi:10.3791/53161 (2015).

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