Introduction
Traumatisk ryggmargsskade (SCI) er en ødeleggende klinisk tilstand som påvirker sensorimotor og autonome funksjoner i SC. Pasienter overlevende SCI er ofte igjen med ødeleggende paraplegia som vesentlig påvirker deres daglige aktiviteter og livskvalitet 1. Eksperimentell SCI modeller har vært et uunnværlig redskap i den vitenskapelige undersøkelsen å forstå patofysiologien av SCI og tilknyttede nevrale reparasjonsprosesser. Disse modellene har også blitt brukt til å teste prekliniske effekten av ulike eksperimentelle nevro intervensjoner som er rettet mot funksjonell bedring. Foreløpig flertall av SCI modeller i praksis ansette bruk av fysisk stump kraft til mekanisk forstyrre og skade SC. Disse metodene inkluderer bloduttredelse, kompresjon, forvridning og transeksjon av SC 2. Det har vært antydet at etter den primære mekaniske fornærmelse en sekundær skade i form av ischemia sett i i det skadde SC 3,4. Årsakene til sekundær iskemi inkluderer omfattende vev degenerasjon, parenkymatøs blødning og noen ganger av obstruksjon av blodårer ved vev ødem 5-7. Som et resultat av den sekundære skade integriteten til SC er videre påvirket, blir neuroner og gliaceller alvorlig svekket funksjon og levedyktighet, og gjennomgår apoptose som fører til infarkt vekst under den kroniske fasen av skade, analogt til vekst av iskemisk penumbra følgende slag 8,9. Flere mekanismer som excitotoxicity, frie radikaler, og betennelser har blitt rapportert å være ansvarlig for iskemisk celledød følgende SCI 10,11. I tillegg er SC iskemi en alvorlig komplikasjon av thoraco-abdominal aortaaneurisme reparasjon operasjoner som ofte fører til paraplegi hos pasientene 12,13. På tross av så høy klinisk effekt svært få modeller av ryggmargen iskemi med høy reproduserbarhet er tilgjengelig for øyeblikket.
nt "> Photothrombosis (PT) er en vanlig brukt metode for induksjon av fokal iskemi i hjernen 14-20. Teknikken er forholdsvis ikke-invasiv, reproduserbar og gir en presis focal ischemisk lesjon i det eksponerte området av hjernen 17 -21. Dette oppnås ved systemisk administrering av fotoaktive fargestoffer som Rose Bengal (RB) 16-20,22 eller erytrosin B 23 etterfulgt av lokal bestråling av blodkar med passende lyskilde. fotoaktivering av fargestoff fører til dannelse av frie radikaler som forstyrre integriteten av den glatte vaskulært endotel, og føre til at blodplatene til å akkumulere, som senere danner en trombe. obstruksjon av blodstrømmen av trombe resulterer i en infarkt i regionen som leveres av beholderen 24. På grunn av enkel kontroll på intensiteten og varigheten av bestrålingen denne fremgangsmåten gir en meget jevn og reproduserbar infarkt. Videre kan denne metoden bli anvendt for å indusere en infarct på forskjellige anatomiske steder som muliggjør romlig (f.eks grå materie vs. hvit substans) forståelse av virkningen av iskemi.Målet med denne studien er å utvikle en enkel og reproduserbar modell for SC ischemi i mus. Vi har beskrevet fremgangsmåten i en PT modell av SC ischemi i mus. Resultater fra histologi og farging vist at PT effektivt kan indusere SC infarkt, neuronal tap og reaktiv gliose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Mus (C57BL / 6J, male) aldrende 10 - 12 uker, ble anvendt i denne studien. Alle prosedyrer ble utført i henhold til NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av University of Missouri Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Pre-kirurgi
- Dagen før operasjonen autoklav og sterilisere alle kirurgiske instrumenter. Pakk instrumentene og autoklav ved 121 ° C ved 15 psi i 30 minutter etterfulgt av 30 minutter av tørking (121 ° C, 15 psi, 30/30 syklus). Plasser instrumentene i et rent og sterilt miljø inntil videre bruk.
- Forbered frisk Rose Bengal (RB) oppløsning (20 mg / ml i sterilt saltvann) hver gang før operasjonen. For å løse opp RB, vortex røret deretter etterfulgt av ultralyd i 5 min ved 50/60 Hz med utgangseffekt på 19 W. Wrap røret i aluminiumsfolie og beskytte den mot lys inntil videre brukes under surgery.
- Lag en blanding av ketamin / xylazin i sterilt saltvann. Legg 125 mL av xylazin (lager konsentrasjon: 20 mg / ml) og 325 ul (ketmaine lager-konsentrasjon: 100 mg / ml) og 550 ul sterilt saltvann for å lage et sluttvolum på 1 ml anestesiblanding.
- Pre-varme homeothermic varmeputen.
- Pre-varme metallhalogen (lyskilde for FN1 epi-fluorescens mikroskop) i 30 min for å stabilisere lampestrøm.
- Juster størrelsen på det opplyste regionen til en diameter på 1 mm ved hjelp 10X objektiv og en reticle ved å justere feltblenderen i oppreist FN1 epi-fluorescens mikroskop.
2. Kirurgisk prosedyre
- Bedøve mus med en dose av ketamin (130 mg / kg B. wt.) Og xylazin (10 mg / kg B. vekt.). Basert på cocktail i 1.3, 4 pl per g mus B. vekt. er nødvendig. Sterilisere injeksjonsstedet med en spritserviett og administrere anestetika gjennom intra-peritoneal (IP) rute. Pass på ikke å injisere bedøvelsesmidler inn i blodårene eller muskel som dette ville forsinke induksjon og utvinning av dyret.
- Gi kunstig tåre salve til begge øynene av musen for å hindre uttørking og plassere dyret på varmeputen for å hindre nedkjøling.
- Utarbeidelse av dyr
- Sjekk dyret for riktig kirurgisk nivå anestesi ved hjelp av tå klype respons.
- Når dyret har nådd nivået for kirurgisk anestesi, klippe håret på den dorsale overflaten rundt midtlinjen av dyret ved hjelp av en elektrisk hår trimmer. Skrubb kirurgiske området med 70% etanol, etterfulgt av Betadine løsning tre ganger. Dekk området med en steril operasjonslaken til neste trinn.
- Kirurgisk inngrep for å tynne bein å avsløre ryggmargen
- Plasser musen i en utsatt posisjon over homeothermic oppvarming pad på kirurgisk plattform (figur 1A). Skikkelig feste musestilling ved hjelp av en snute klemme for å holde en langstrakt halsområdet (figur 1 A, B).
- Lag et snitt (ca 1 cm lang) ved hjelp av kirurgisk saks langs ryggmidtlinjen som strekker seg fra thorax ryggvirvler T9 til T12. Flytt til side huden å eksponere kirurgiske området.
- Ved hjelp av en skalpell, fjerner nøye muskelen å eksponere dorsal pigger på T9 - T12 ryggvirvler. Stoppe blødninger i hvert trinn ved å trykke lett med steril bomullspinne. Separate T10 - T12 ryggvirvler fra omliggende muskler og feste dem ved hjelp av en ryggvirvel klemme for å stabilisere og forhindre enhver bevegelse (figur 1 A, B).
- Ved hjelp av en høy hastighet drill med bein polering borekrone, nøye og forsiktig tynn dorsalflaten på T10 eller T11 vertebra å visual bakre rygg venen og andre små fartøy på dorsal overflaten av SC (figur 1C).
- For å hindre termisk skade på grunn av varme som genereres under tynning prosedyren,bruke en mild og konstant strøm av fysiologisk saltvann sammen med konstant sug for å fjerne rusk.
- Ved hjelp av en skalpell glatte nøye benoverflaten til hovedbeholderen er klart synlig. Vær forsiktig så du ikke skader på ryggmargen under denne prosessen.
- Når blodkar blir visualisert, RB administreres i en dose på 30 mg / kg (kroppsvekt) ved retro-orbital sinus ruten ved hjelp av en insulinsprøyte.
- Måle blodstrømmen ved hjelp av en laser Doppler strømningsmåler etter 3 min etter injeksjon RB om nødvendig (figur 2A, B). Oppretthold asepsis under hele prosedyren.
3. Induksjon av PT
- Plasser dyret på en XY posisjon justerbar scenen over en Lab-Jack som kan justere høyden. Justere posisjonen til musen så den eksponerte delen av T11 ryggmarg er direkte under 10x målet med FN1 epi-fluorescens mikroskop (figur 3A).
- Still inn effekten av liGHT kilde på 12%, og bestråler T11 område med en diameter på 0,75 mm i midten av tynnet ryggmargen (Merk: Dette området omfatter den bakre rygg venen og andre kapillærer) med et grønt lys (bølgelengde 540-580 nm, som er oppnås ved hjelp av filteret kube i mikroskop) gjennom 10X objektiv i 2 min. Ta bilder ved begynnelsen og slutten av bestråling (figur 3B, C) og registrere tidspunktet for forsøket på dette punktet.
- Måle blodstrømmen på nytt i 10 minutter om nødvendig ved å plassere en laser-doppler-proben til den samme posisjon over ryggmargen som i 2.4.8 (figur 2A, B).
- Etter bestråling sjekk for eventuelle blødning og hvis ingen funnet fortsette å sy dyret. Sutur overfladiske fascia sammen med musklene på hver side av ryggmargen ved hjelp av en absorberbare sutur eller 4-0 størrelse silke sutur. Pass på å ikke skade utsatt SC. Sutur huden med 4-0 silke sutur. Påfør Betadine eller jodtil kantene av huden etter suturering.
4. Post-kirurgi Care
- Etter suturering, plasserer dyret på varmeputen for utvinning. Etter utvinning sjekke dyrene for tegn til nevrologiske utfall ved å observere bevegelsene til både hind-lemmer. Ikke la dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
- Overfør dyrene til hjemmet buret. Ikke returnere dyr som har gjennomgått kirurgi til selskap med andre dyr før fullt restituert.
- Kontroller dyrene med jevne mellomrom. Ved alvorlige nevrologiske utfall, gi forsvarlig omsorg som evakuering av blære, administrasjon av smertestillende (buprenorfin, 0,05 til 0,1 mg / kg). Sjekk for dehydrering og administrere fysiologisk saltvann subkutant i alvorlig sak. Vanligvis vil buprenorfin (0,1 mg / kg) administreres etter suturere for å lindre smerter i operasjonsstedet.
- Hvis dyrene ikke er umiddelbartavlivet etter operasjonen, vil vi sette høyt vanninnhold diett på buret gulvet, slik at dyrene kan nå maten lett.
5. Transcardial Perfusjons, Nissl farging og Farging
- Tran perfuse dyret som tidligere beskrevet 17-20.
- Bedøve dyr som beskrevet tidligere i protokollen og tran perfuse med fosfatbuffer saltvann (PBS, pH 7,4), etterfulgt av iskald 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS.
- Etter perfusjon, fjerner ryggmargen (SC) og post-fikse det i 4% PFA i PBS ved 4 ° CO / N. Overfør den faste SC i PBS med 30% sukrose og holde den i 2 - 3 dager inntil det synker til bunnen av røret.
- Ved hjelp av en kryostat kutte ryggmargen til 30 mikrometer tykke seksjoner og plassere dem i serie på en gelatinbelagte glass eller i en 48-brønners plate med 0,01 M PBS.
- Nissl farging: For å inspisere skaden forårsaket av PT utføre en Nissl staining på ryggmargs seksjoner som tidligere beskrevet 17-20.
- Kort, samle hver femte ryggmargen skive på glass og beis med 0,25% cresylfiolett. Ta bilder av de fargede seksjoner (figur 4).
- Farging: Som tidligere beskrevet ved hjelp av en flytende delen metode 17,18,20.
- I korthet, beis ryggmargen seksjonene ved inkubering O / N ved 4 ° C med kanin-anti-glia fibrillært surt protein (GFAP) polyklonalt antistoff (1: 300), kanin-anti-Neun-antistoff (1: 300), og kanin-anti- Iba1 antistoff (1: 500) etterfulgt av esel antikanin Alexa 568-konjugert IgG (1: 400) sekundære antistoffer i 4 timer ved RT. Ta bilder med et fluorescerende mikroskop (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne studien var å produsere ryggmarg ischemi i mus ved hjelp av en PT-modell. Etter ønsket region av bein over ryggmargen (T10 - T12) ble tynnet, ble Rose Bengal injiseres gjennom retro-orbital sinus rute, og iskemi ble indusert av PT Figur 1A, B viser musa plassert i en skreddersydd kirurgisk. plattformen under operasjonen. Musen ble holdt på plass av en snute klemme og to justerbare vertebrate klemmer til å stabilisere ryggmargen Figur 1C viser et fortynnet vindu over ryggmargen av T10 -. T12. Hovedpulsåren og dets grener kan tydelig visualisert. For å bekrefte induksjon av ischemi, ble forandringer i blodstrømmen målt ved hjelp av en laser Doppler strømningsmåler før og etter PT (figur 2A, B). For analyse, var nedgangen i% av blodstrøm beregnes med baseline blodstrømmen før photothrombosis. Blodstrømmen falt til ~ 20% umiddelbart etter lys belysning i forhold with basalnivået før belysning. Figur 3B viser C fluorescerende bilder av ryggmargs blodkar på begynnelsen og slutten av PT. Belysning i 2 min indusert blodpropp i blodårer (figur 3C), noe som tyder på induksjon av ischemi, i samsvar med målinger av laser Doppler strømningsmåler. For å inspisere skaden forårsaket av PT, ble musene avlivet tre dager etter PT og Nissl farging ble utført. Bilder tatt etter Nissl farging viste infarktet regionen som kan være tydelig avgrenset fra den omkringliggende regionen, noe som indikerer ryggmarg vevsskade og celledød etter PT (figur 4). Farging ble utført for Neun, GFAP og Iba1. Neun + nevroner gikk tapt i den grå materie i iskemisk kjerne (figur 5A), mens GFAP uttrykk ble økt i kanten av iskemisk kjerne (Figur 5B, også se eske region). De Iba1 + mikroglia viste en Globoid morphology (ie., en forstørret cellekroppen med kortere og færre prosesser, se eske region) sammen med økt Iba1 uttrykk (figur 5C). Selv om det var en vev tap i iskemisk kjernen regionen på grunn av flytende delen flekker, kan en økning i GFAP og Iba1 uttrykk i hele peri-infarkt region observeres tydelig. Disse resultatene tyder på neuronal død og reaktiv gliose i penumbra etter SC iskemi. På den annen side ble betydelige funksjonelle underskudd observert i den skadde mus, dvs. deaktivert hind-lem bevegelse en dag etter PT, indikerer lammelse av hind-lemmer (se video).
Figur 1. PT-indusert ischemi-modellen i ryggmargen. (A) Fotografier av kirurgi plattform for ryggmargen PT. Innfelt: forstørret ryggvirvel klemmer.(B) Musen ble holdt av en snute klemme og ved to spesiallagde vertebrale klemmer på scenen. Legg merke til at benet ble tynnet på T10 -. T12 regionen og to metall vertebrale klemmer ble brukt for å stabilisere ryggmargen (C) En zoom-in bilde som viser den regionen med tynnet-bone over ryggmargen på T10-11 for induksjon av PT. Legg merke til de viktigste blodkar og dets grener. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Ryggmargsblodstrømsmåling. (A) Oppsettet av ryggmargen overflaten blodstrømsmåling med laser Doppler strømningsmåler og stereotaksisk enhet for å plassere sonden. (B)Ryggmargsblodstrømmen før og etter PT ble målt. I dette eksperimentet, ble PT indusert ved å belyse med en lyskilde i 2 min med 12% effekt. Diameteren på den bestrålte overflate var 0,75 mm, og var i midten av ryggmargen. Blodstrømmen ble målt i opp til 5 minutter for å oppnå stabiliserte signal før PT og opp til 10 minutter etter PT. Data fra hver mus ble normalisert til verdien før lys belysning. Grafen viser gjennomsnittsverdien av data fra tre mus. Pilen indikerer starten av PT. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. PT-indusert ryggmarg ischemi. (A) Fotografi av enmus plassert på mikroskopet for induksjon PT i ryggmargen. Plasseringen av musen kan justeres i tredimensjonalt bruke XY gliding scenen og en Lab-Jack. Lyset fra 10X objektiv ble fokusert på overflaten av ryggmargen. (BC) Fluorescent bilder av blodårene i ryggmargen før (B) og etter (C) belysning etter injeksjonen av rose Bengal. Legg merke til blodpropp etter 2 min av bestråling (C) (se pilene). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Nissl farging av ryggmargen. Nissl flekker bilder av en rekke rostral til kaudal ryggmargstverrgående seksjoner som inkluderer normale (§§1 og 6) og PT-indusert Epicenter (§§ 2-5). Musene ble avlivet 3 dager etter PT. Hver ryggmarg delen er 30 mikrometer tykt. Intervallet mellom to seksjoner er 750 mikrometer. Den stiplede linjen i 3. bilde skisserer infarktet regionen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Farging av Neun, GFAP og Iba1. Fluorescent bilder av Neun (A), GFAP (B) og Iba1 (C) flekker fra normale (øverste panelene) og PT-skadet (nedre paneler) ryggmargs seksjoner. Den skadde mus ble ofret tre dager etter at PT. De stiplede linjene skille infarkt regionene fra normale vev. Eske regionene viser bilder av GFAP og Iba1 uttrykk høy oppløsning med en skala bar på 50mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Movie . PT i ryggmargen indusert atferds underskudd. Filmen viser bevegelsen av en normal og en PT-skadet mus i et bur. Legg merke dra av begge hind-lemmer av musen med inured ryggmargen, noe som indikerer lammelse av hind-lemmer (paraplegi). Filmen ble tatt 24 timer etter at PT i det skadde musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien beskrevet en photothrombotic modell SC iskemi. På grunn av fremskritt i genteknologi har det vært en bølge i kommersielt tilgjengelig transgene mus som har gjort det mulig å studere effekten av spesifikke gener som er involvert i ischemisk patofysiologien i SC. Målet med studien var å utvikle en reproduserbar musemodell for ryggmarg iskemi. Her har vi tilpasset et kortikale PT modell for å indusere SCI i mus. Etter kirurgi bakre rygg venen og kapillærer på dorsal aspekt av mus på nivået av thorax T11 vertebra ble eksponert. Deretter RB, en kommersielt tilgjengelig foto fargestoff, ble injisert via retro-orbital sinus rute for å oppnå ønsket vaskulær fordeling. Den eksponerte blodkar ble deretter bestrålt med et grønt lys til å indusere dannelsen av blodpropp og senere på en infarktet. Våre resultater fra histologiske og farging metoder viste at PT indusert en infarkt i ryggmargen og Reactive gliose i peri-infarkt regionen. Nevrologiske utfall som hind lem lammelse ble også observert. Disse data tyder på at PT er en passende modell for å studere patofysiologi og mekanismer for celledød etter SCI. Det kritiske trinnet i protokollen er bruken av en høyhastighets drill for å tynne overflaten av vertebra for visualisering av blodkaret på den dorsale overflaten av SC. Dette trinnet bør være nøye utføres som anvendelse av overtrykk kan føre til at bore for å angi hulrom og spinal skade SC. På den annen side, kanskje ujevn tynning resultere i urettmessig belysning og kan gi uregelmessige infarkter. For å løse dette problemet, er hyppig inspeksjon av overflaten av benet i henhold mikroskop etter hvert kort trinnet med boring anbefalt å vurdere tykkelsen av benet og til å vurdere bruk av boret ytterligere. Bruken av steril saltløsning er anbefalt for utvasking av rester, så vel som for bedre visualisering av den eksponerte overflaten. Vedlike constant asepsis under hele kirurgisk prosedyre, riktig post-kirurgisk behandling av dyret kan forbedre dyreoverlevelsesevne og øke suksessraten av forsøkene.
Vår nåværende modell av PT krever ikke kjøp av noen dyre instrumenter, som ethvert laboratorium som er utstyrt med en epi-fluorescens mikroskop med en lyskilde (for eksempel kvikksølv lampe, metall halogen, eller laser av 488 nm bølgelengde) kan utføre denne prosedyren. I tillegg gir denne teknikken kontroll over størrelsen av infarktet ved å justere åpningen størrelse i forhold til andre SC ischemi modeller som kombineres okklusjon av aorta, venstre subclavian og indre brystarterie 25 og modifisert aorta kryssklem metode 26 som er kompliserte og er ekstremt invasiv. I vår modell en høy hastighet drill å tynne dorsalflaten av ryggvirvel for visualisering ble valgt som et alternativ til laminektomi, metoden for valg av mange laboratorier for å indusere SCI.Laminectomy innebærer kutting av ryggvirvlene som kan føre til overdreven blødning på grunn av tran av ryggvirvel blodkar og dette kan tilsløre feltet for bildebehandling. Selv om enkelte protokoller anbefaler bruk av bomullspinner til å tømme overdreven blødning under laminectomy det kan resultere i kompresjon som kan føre til ytterligere skade på SC. Videre den eksponerte overflaten av ryggmargen kan komme i direkte kontakt med blod og dens bestanddeler, så vel som skarpe kanter av de skårne ben som kan legge unødig variabilitet til eksperimentet. Ved å bruke dagens PT-modellen, kan infarkt med forskjellig størrelse og dybde bli dannet ved enkel manipulering av intensiteten av lyskilden, eksponeringsvarighet og området av den eksponerte overflaten. Selv om denne studien ble generert ischemi på den sentrale regionen av T11 i SC, kan denne metoden også generere infarkter på forskjellige steder langs rostralt-til-hale samt sideretningen av ryggmargen, som MIGht nytte forstå regionspesifikke effekten av iskemi på paraplegi. På den annen side, selv om belysningen er på overflaten av ryggmargen, kan lyset å penetrere viss dybde i vevet, og skaden kan også bli indusert i den grå materie. Som Rose Bengal er fordelt i hele sirkulasjonssystemet, hvis dyrearter er de samme, og alder og vekt er like, forventer vi konsistent lesjon vil bli generert som i kortikal ischemi indusert av PT.
Den annen hovedfordel med PT-indusert ischemi er meget lav dødelighet av dyr. Lav dødelighet betyr langsiktige overlevelse studier kan gjennomføres som kan være nyttig i å rakne den tidsmessige effekten av iskemisk skade på overlevelse og motorisk funksjon utvinning. Denne modellen kan også hjelpe til å forstå de cellulære reparasjonsmekanismer som vanligvis opptrer sent i den kroniske fasen av skade 14,19,27-29. Denne modellen produserer også betydelige motor funksjons underskudd som kan be brukt til å vurdere effekten av nervecellene agenter på funksjonell bedring. I tillegg vil denne modellen også tillater studiet av patologiske forandringer etter SCI som axonal degenerering og regenerering, og neuronal astrocytic Ca 2+ signalering og overbelastning i levende mus ved anvendelse av to-foton mikroskopi.
Som alle andre SCI-modeller, er PT ikke blottet for ulempene. Ulempene med denne teknikken er lik de sett i kortikale PT. Få av de manglene omfatter mangel på en anatomisk klar iskemisk penumbra, som er målet for mange neurobeskyttende midler, og fraværet av reperfusjon. Det er velkjent at reperfusjon etter ischemi er kjennetegnet ved endringer som økt produksjon av reaktive oksygenforbindelser, infiltrasjon av inflammatoriske celler og øket cytokinproduksjon 30-32. Mangel på reperfusjon i PT betyr endringene knyttet reperfusjonskade i SC vil være vanskelig å studere ved hjelp av denne modellen.Imidlertid, fordelene ved å bruke PT iskemi oppveie ulempene, og denne teknikk gir forskerne med en enkel å utføre og meget reproduserbar modell for generering av SCI i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [Grant no. R01NS069726] og American Heart Association Grant i Aid Grant [Grant no. 13GRNT17020004] til SD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
| C57BL/6J | Jackson lab | 664 | 22 - 25 g |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
| Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
| Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
| Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
| Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
| Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
| Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
| Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
| Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
| Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4 x 4 in plate to adjust the height of the animal |
| X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Young, W. Secondary injury mechanisms in acute spinal cord injury. J Emerg Med. 11, Suppl 1. 13-22 (1993).
- Crowe, M. J., Bresnahan, J. C., Shuman, S. L., Masters, J. N., Beattie, M. S. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat Med. 3 (1), 73-76 (1997).
- Soubeyrand, M., et al. Effect of norepinephrine on spinal cord blood flow and parenchymal hemorrhage size in acute-phase experimental spinal cord injury. Eur Spine J. 23 (3), 658-665 (2014).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (2012).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis). Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Liu, X. Z., et al. Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J Neurosci. 17 (14), 5395-5406 (1997).
- Liu, L., et al. An experimental study of cell apoptosis and correlative gene expression after tractive spinal cord injury in rats. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 42 (23), 1434-1437 (2004).
- Hirose, K., et al. Activated protein C reduces the ischemia/reperfusion-induced spinal cord injury in rats by inhibiting neutrophil activation. Ann Surg. 232 (2), 272-280 (2000).
- Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
- Guerit, J. M., Dion, R. A. State-of-the-art of neuromonitoring for prevention of immediate and delayed paraplegia in thoracic and thoracoabdominal aorta surgery). Ann Thorac Surg. 74 (5), S1867-S1869 (2002).
- Schepens, M. A., Heijmen, R. H., Ranschaert, W., Sonker, U., Morshuis, W. J. Thoracoabdominal aortic aneurysm repair: results of conventional open surgery. Eur J Vasc Endovasc Surg. 37 (6), 640-645 (2009).
- Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp Transl Stroke Med. 1, 8 (2009).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 1. Time course of hemodynamic consequences. J Cereb Blood Flow Metab. 6 (2), 184-194 (1986).
- Zhang, W., et al. Neuronal protective role of PBEF in a mouse model of cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (12), 1962-1971 (2010).
- Li, H., Zhang, N., Sun, G., Ding, S. Inhibition of the group I mGluRs reduces acute brain damage and improves long-term histological outcomes after photothrombosis-induced ischaemia. ASN Neuro. 5 (3), 195-207 (2013).
- Li, H., et al. Histological, cellular and behavioral assessments of stroke outcomes after photothrombosis-induced ischemia in adult mice. BMC Neurosci. 15, 58 (2014).
- Wang, T., Cui, W., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2 (1), 33-42 (2010).
- Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J Neurosci Methods. 117 (1), 43-49 (2002).
- Boquillon, M., Boquillon, J. P., Bralet, J. Photochemically induced, graded cerebral infarction in the mouse by laser irradiation evolution of brain edema. J Pharmacol Toxicol Methods. 27 (1), 1-6 (1992).
- Kim, G. W., Lewen, A., Copin, J., Watson, B. D., Chan, P. H. The cytosolic antioxidant, copper/zinc superoxide dismutase, attenuates blood-brain barrier disruption and oxidative cellular injury after photothrombotic cortical ischemia in mice. Neuroscience. 105 (4), 1007-1018 (2001).
- Schmidt, A., et al. Photochemically induced ischemic stroke in rats. Exp Transl Stroke Med. 4 (1), 13 (2012).
- Lang-Lazdunski, L., et al. Spinal cord ischemia. Development of a model in the mouse. Stroke. 31 (1), 208-213 (2000).
- Wang, Z., et al. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J Neurosci Methods. 189 (2), 246-251 (2010).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. J Vis Exp. (76), (2013).
- Lu, H., et al. Induction and imaging of photothrombotic stroke in conscious and freely moving rats. J Biomed Opt. 19 (9), 96013 (2014).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Front Neuroenergetics. 6 (1), (2014).
- Bell, M. T., et al. Toll-like receptor 4-dependent microglial activation mediates spinal cord ischemia-reperfusion injury. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S152-S156 (2013).
- Smith, P. D., et al. The evolution of chemokine release supports a bimodal mechanism of spinal cord ischemia and reperfusion injury. Circulation. 126 (11 Suppl 1), S110-S117 (2012).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50 (4), 264-274 (2012).
