Introduction
Travmatik omurilik yaralanması (SKY) SC sensörimotor ve otonomik fonksiyonları etkileyen yıkıcı bir klinik durumdur. SCI kalan hastalar sıklıkla önemli ölçüde günlük aktivitelerini ve yaşam kalitesini etkiler 1 parapleji zayıflatıcı ile bırakılır. Deneysel SCI modelleri SCI patofizyoloji ve ilgili nöral tamir süreçlerini anlamak için bilimsel araştırmaların vazgeçilmez bir araç olmuştur. Bu modeller aynı zamanda fonksiyonel iyileşme amaçlayan çeşitli deneysel nöroprotektif müdahalelerin klinik öncesi etkinliğini test etmek için kullanılmıştır. Şu anda uygulamada SCI modellerinin çoğunluğu mekanik bozabilir ve SC zarar fiziksel künt kuvvet kullanımını istihdam. Bu yöntemler SC 2 kontüzyon, sıkıştırma, çıkık ve transekte bulunmaktadır. Bu önerilmiştir birincil mekanik hasara yaralı SC iskemi setleri formunda ikinci bir yaralanma sonrası 3,4. İkincil iskemi etyolojisi doku ödemi 5-7 kan damarlarının tıkanması bazen geniş doku dejenerasyonu, parankimal kanama ve kapsar. SC bütünlüğü daha da etkilenir sekonder yaralanmanın bir sonucu olarak, nöron ve glial hücreler ciddi fonksiyonu ve canlılığı bozulmaktadır ve iskemik penumbra, aşağıdaki inme büyüme benzer yaralanma, kronik evrede büyüme infarkt yol açar, apoptozi altına 8,9. Eksitotoksisite, serbest kök üretimi ve enflamasyon gibi çeşitli mekanizmalar SCI 10,11, aşağıdaki iskemik hücre ölümünden sorumlu olduğu bildirilmiştir. Buna ek olarak, SC iskemi sıklıkla hastalar 12,13 parapleji yol torako-abdominal aort anevrizma tamiri ameliyatları ciddi bir komplikasyonudur. Böyle yüksek klinik etkilerine rağmen yüksek tekrarlanabilirlik ile spinal kord iskemi çok az sayıda modelleri mevcut.
nt "> Fototromboz (PT) tekniği yüksek oranda çoğaltılabilir oldukça non-invazif. beyinde 14-20 fokal iskemi indüksiyonu için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, beyin 17 açıktaki alanına kesin bir fokal iskemi lezyon üretir -21. Bu Rose Bengal (RB) 16-20,22 ya eritrosin B gibi fotoaktif boyaların sistemli uygulanması ile elde edilir, uygun bir ışık kaynağı ile birlikte, kan damarlarının lokal ışınlama ve ardından 23. boyanın Foto-aktifleştirme serbest radikallerin üretilmesini neden olur pürüzsüz vasküler endotel bütünlüğünü bozabilir ve trombositler daha sonra geminin 24 tarafından sağlanan bölgede infarkt trombüs sonuçları. kan akışının tıkanıklık trombüs oluşturan, birikmesine neden olur. ötürü kontrolden kolaylığı yoğunluğu ve ışınlama süresi bu işlem oldukça düzgün ve çoğaltılabilir bir enfarktüs verir. Bundan başka, bu yöntem, bir infarktüsü uyarılması için kullanılabilecektiriskemi etkisi uzaysal (örneğin, vs beyaz cevher gri madde) aydınlatılmasını sağlayan çeşitli anatomik yerlerinde t.Bu çalışmanın amacı, farelerde SC iskemi kolay ve yüksek tekrarlanabilir bir model geliştirmektir. Biz farelerde SC iskemi PT modeli prosedürü tarif. Histoloji ve immün sonuçları PT etkili bir SC enfarktüs, nöron kaybı ve reaktif gliozis uyarabilir gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Fareler (C57BL / 6J, erkek) yaşlı 10-12 haftalık, bu çalışmada kullanılmıştır. Tüm işlemler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için NIH Kılavuzu'na uygun olarak yapılmış ve Missouri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Ön Cerrahi
- ve cerrahi otoklav gün önce tüm cerrahi aletler sterilize edin. (121 o C, 15 psi, 30/30 çevrimi) kurutma 30 dakika, ardından 30 dakika boyunca 15 psi 121 o C'de aletleri ve otoklav sarın. Daha sonra kullanmak kadar temiz ve steril bir ortamda aletleri yerleştirin.
- Taze Rose Bengal (RB) solüsyonu (steril tuzlu su içinde 20 mg / ml) ameliyat öncesi her hazırlayın. Daha sur kullanılan tamamen kaybolana kadar RB, girdap daha sonra 19 W. Wrap alüminyum folyo ile boru ve ışıktan korumak için çıkış gücü ile 50/60 Hz, 5 dakika süreyle sese tabi tutularak ve ardından tüp çözünmesi içingery.
- Steril tuzlu su içinde, ketamin / ksilazin bir karışım hazırlayın. Anestezik karışımın 1 ml'lik bir son hacim sağlamak ve steril tuzlu su içinde 550 ul; ve ketmaine 325 ul (100 mg / ml stok konsantrasyonu): ksilazin 125 ul (20 mg / ml stok konsantrasyonu) ekleyin.
- Homeothermic ısıtma yastığı ön ısıtmak.
- Lamba gücünü dengelemek için 30 dakika süreyle metal halide lamba (FN1 epi-floresan mikroskop ışık kaynağını) Pre-sıcak.
- 10X objektif ve dik FN1 epi-floresan mikroskop alan diyafram ayarlayarak bir retikülü kullanılarak 1 mm'lik bir çapa ışıklı bölgenin boyutunu ayarlayın.
2. Cerrahi Prosedür
- Ketamin (130 mg / kg B. ağ.) Ve xylazine bir dozu ile fare anestezi (10 mg / kg B. ağ.). 1.3 kokteyl dayanarak, fare B. ağırlıkça gramı başına 4 ul. ihtiyaç vardır. Alkollü bir bezle enjeksiyon siteyi sterilize ve içi ile anestezi yönetmek-peritoneal (IP) rota. Hayvan indüksiyon ve kurtarma gecikme olacağını bu kadar kan damarları veya kas içine anestezik enjekte özen gösterin.
- Kurumasını önlemek ve hipotermi önlemek için ısıtma pedi üzerinde hayvan yerleştirmek için fare hem gözlere suni gözyaşı merhemi sürün.
- Hayvanın Hazırlanması
- Ayak tutam yanıtı kullanarak uygun cerrahi seviye anestezi hayvan kontrol edin.
- Hayvan anestezi cerrahi düzeyine ulaştığında, bir elektrikli saç düzeltici kullanarak hayvanın orta hat çevresinde dorsal yüzeyi saç klibi. Betadin çözeltisi üç kez, ardından% 70 etanol ile cerrahi alan fýrçalayýn. Bir sonraki adıma kadar steril cerrahi örtü ile site örtün.
- İnce kemik cerrahi prosedür omurilik maruz
- Cerrahi platformu (Şekil 1A) üzerine homeothermic ısıtma yastığı üzerinde yüzükoyun pozisyonda fare yerleştirin. Düzgün fareyi sabitleyinBir burun kelepçe kullanarak duruş uzatılmış boyun bölgesini (Şekil 1A, B) korumak için.
- T12 için göğüs omurları T9 uzanan dorsal orta hat boyunca cerrahi makas kullanarak (yaklaşık 1 cm uzunluğunda) bir kesi yapmak. Cerrahi alan maruz cilt ayırınız.
- Bir neşter kullanılarak, dikkatli bir şekilde T9 dorsal dikenleri ortaya çıkarmak için kas temizlemek - T12 vertebra. Steril bir pamuklu çubukla hafif basınç uygulayarak her adımda kanamayı durdurmak. Ayrı T10 - Çevre kas T12 vertebra ve stabilize ve herhangi bir hareketi önlemek için omurga kelepçe kullanarak sabitleyin (Şekil 1A, B).
- Dikkatlice ve yavaşça ince, T10 veya T11 vertebra dorsal yüzeyini kemik parlatma matkap ile yüksek devirli kullanma SC (Şekil 1C) dorsal yüzeyinde posterior spinal ven ve diğer küçük gemiler görselleştirmek için.
- Nedeniyle inceltme işlemi sırasında oluşan ısı termal hasar görmesini önlemek için,artığın ayrılması için sürekli emme ile birlikte, normal tuzlu su, bir yumuşak ve sürekli bir akım uygulanır.
- Ana damar açıkça görünür oluncaya kadar bir neşter kullanılarak dikkatle kemik yüzeyini pürüzsüz. Bu süreçte omurilik zarar vermemeye özen gösterin.
- Kan damarı görüntülenmiştir sonra, bir insülin şırıngası kullanılarak retro-orbital sinüs yoldan 30 mg / kg (vücut ağırlığı) arasında bir dozda tatbik RB.
- RB enjeksiyonu takiben 3 dakika sonra bir lazer Doppler debimetre kullanılarak kan akışını ölçmek gerekirse (Şekil 2A, B). Bütün işlem sırasında asepsi koruyun.
PT 3. İndüksiyon
- Yüksekliğini ayarlayabileceğiniz bir Lab-Jack üzerinde XY pozisyonu ayarlanabilir sahnede hayvan yerleştirin. T11 omuriliğin açıkta kalan bölge FN1 epi-floresan mikroskop (Şekil 3A) 10x objektif altında doğrudan böylece fare konumunu ayarlayın.
- Li gücünü ayarlama% 12 GHT, kaynak ve inceltilmiş omurilik ortasında 0.75 mm bir çapa sahip bir bölge ışınlanmış T11: - 580 nm, yeşil ışık (dalga boyu 540 (Not: Bu bölge, posterior spinal damar ve kılcal damarları içeren) 2 dakika süreyle 10X objektif ile mikroskop filtre küp) tarafından elde etti. Başında ve ışınlama sonunda (Şekil 3B, C) görüntüleri almak ve bu noktada deney zamanı kaydedin.
- 2.4.8 gibi omurilik üzerinde aynı pozisyona lazer Doppler probu yerleştirilerek 10 dakika gerektiğinde tekrar kan akışını ölçmek (Şekil 2A, B).
- Herhangi bir kanama ve eğer ışınlama kontrolünden sonra hiçbiri bulundu hayvan sütür devam edin. Emilebilen sütür veya 4-0 boyut ipek sütür kullanılarak omurilik iki tarafında kasların birlikte yüzeysel fasya dikin. Maruz SC zarar vermemeye özen gösterin. 4-0 ipek sütür ile cilt dikin. Betadine ya da iyot uygulanırsütür sonrası cildin kenarlarına.
4. Post-cerrahi Bakımı
- Sütür sonra, kurtarma için ısıtma pedi üzerinde hayvan yerleştirin. Kurtarma sonra her iki arka-bacaklarda hareket gözlemleyerek nörolojik defisit belirtileri hayvanları kontrol ediniz. Bu sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvan bırakmayın.
- Evde kafes hayvanları aktarın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş hayvan iade etmeyin.
- Düzenli aralıklarla hayvanların kontrol edin. Ciddi nörolojik defisit durumunda, mesane boşaltılması, analjezik idaresi (- 0.1 mg / kg buprenorfin, 0.05) gibi uygun bakım sağlamak. Dehidrasyon için kontrol edin ve ağır durumda normal tuzlu su subkutan yönetmek. Genellikle, buprenorfın (0.1 mg / kg), cerrahi sitedeki ağrı gidermek için dikiş sonra tatbik edilecektir.
- Hayvanlar hemen değilsenizhayvanların kolayca yiyecek ulaşabilir, böylece ameliyat sonrası ötenazi, biz kafes katta yüksek su içeriği diyet koyacağız.
5. Transcardial Perfüzyonu, Nissl boyama ve immün
- Daha önce tarif edildiği gibi 17-20 transkardiyal hayvan serpmek.
- Protokol daha önce tarif edilen ve transkardiyal buz soğukluğunda% 4 paraformaldehid, PBS içinde (PFA), ardından fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4), serpmek hayvan anestezisi.
- Perfüzyon sonra, omurilik (SC) çıkarın ve 4 ° CO / N PBS içinde% 4 PFA bunu post-düzeltin. % 30 sakaroz ile PBS içine sabit SC aktarın ve 2 için saklayın - bu tüpün dibine batar kadar 3 gün.
- Bir kriyostat kullanarak 30 mikron kalınlığında bölümler halinde omurilik kesilmiş ve jelatin kaplı cam lam üzerine ya da 0.01 M PBS ile bir 48-çukurlu plaka içinde seri yerleştirin.
- Nissl boyama: Bir Nissl staini gerçekleştirmek PT kaynaklanan zararı incelemek içinspinal kord kesitlerinde ng daha önce tarif edildiği 17-20.
- Kısaca,% 0.25 cresyl menekşe ile her beşinci omurilik cam slaytlar dilim ve leke toplamak. Boyanan kesitler (Şekil 4) görüntülerini çekin.
- Immün: Daha önce bir yüzer bölüm yöntemi 17,18,20 kullanılarak açıklandığı gibi.
- , Tavşan anti-NeuN antikoru (1: 300), ve tavşan anti-: Kısaca, tavşan anti-glia fibriler asidik protein (GFAP) poliklonal antikor (300 1) ile 4 ° C 'de, O / N inkübe edilerek omurilik bölümleri leke Iba1 antikoru (1: 500) eşek anti tavşan Alexa 568-konjuge IgG (1: 400), ardından oda sıcaklığında 4 saat süre ile sekonder antikor. Floresan mikroskop (Şekil 5) ile görüntüleri çekin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmanın amacı, PT modeli kullanılarak farelerde omurilik iskemisi üretmekti. Spinal kord (T10 - T12) Yukarıdaki kemik arzu edilen bölgeye sonra inceltilmiş, Rose Bengal, retro-orbital sinüs yoldan enjekte edildi ve iskemi PT indüklenen Şekil 1A, B yer alan fare göstermektedir ısmarlama bir cerrahi. Ameliyat sırasında platformu. Fare burun kelepçe ile yerinde düzenlenen ve iki ayarlanabilir omurgalı omuriliği stabilize kelepçeleri Şekil 1C T10 omurilik üzerinde incelmiş penceresini görüntülemek -. T12. Ana damar ve dalları açıkça görülebilir. Iskemi indüksiyonunu teyit etmek için, kan akışında değişimler önce ve PT sonrasında bir lazer doppler akış ölçer kullanılarak ölçülmüştür (Şekil 2A, B). Analizi için, kan akışının% azalma fototromboz önce bazal kan akışı kullanılarak hesaplandı. W karşılaştırıldığında kan akımı ışık aydınlatması hemen sonra% 20 ~ düştüönce aydınlatma bazal seviyeye i. Şekil 3B, C başı ve PT sonunda spinal kord kan damarlarının floresan görüntüleri gösterir. Lazer Doppler akış ölçümleri ile uyumludur iskemi indüksiyonu, öne kan damarları (Şekil 3C) 'de 2 dakika ile indüklenen kan pıhtısı için aydınlatma. PT ve Nissl boyama yapıldı sonra PT kaynaklanan zararı incelemek için, fareler 3 gün kurban edildi. Nissl boyama sonrasında alınan görüntüleri PT sonrası omurilik dokusu hasarına ve hücre ölümüne gösteren çevresindeki bölge sınırları çizilmiş olabilir infark bölgesini (Şekil 4). Immün Neun, GFAP ve Iba1 için yapıldı. GFAP ifadesi (ayrıca kutulu bölgenin görmek, Şekil 5B) iskemik çekirdek sınırında artış ise Neun + nöronlar, iskemik çekirdek (Şekil 5A) gri cevherde kaybedildi. Iba1 + mikroglia bir globoid mor sergiledimorfolojisi artan Iba1 ekspresyonu (Şekil 5C) ile birlikte (yani., daha kısa ve daha az süreçleri ile bir büyütülmüş hücre gövdesi, kutulu bölge bakınız). Nedeniyle yüzer kısmı boyama iskemik çekirdek bölgesinde, bir doku kaybı olmasına rağmen, tüm peri-infarkt bölgesinde GFAP ve Iba1 ekspresyonunda bir artış açıkça görülmektedir. Bu sonuçlar SC iskemi sonrasında penumbra nöronal ölüm ve reaktif gliozis gösterir. Öte yandan, önemli fonksiyonel açıkları arka-bacaklarda felç (Film bakınız) belirten PT sonra, yani özürlü arka ekstremite hareketi bir gün, yaralı farelerde gözlendi.
Omurilik Şekil 1. PT-iskemi modeli. (A) omurilik PT için ameliyat platformu Fotoğrafları. Ankastre: vertebra kelepçeler büyütülmüş.(B) fare burun kelepçe ile ve sahnede iki ısmarlama vertebra kelepçeler tarafından gerçekleştirildi. Kemik T10 de inceltilmiş olduğunu fark -. T12 bölgeye ve iki metal kelepçeler omur omurilik stabilize etmek için kullanıldı (C) yakınlaştırma-görüntü için T10-11 omurilik üzerinde inceltilerek-kemik ile bölgeyi gösteren PT indüksiyon. Ana kan damarları ve dalları dikkat edin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Omurilik kan akımı ölçümü. (A) prob yerleştirmek için bir lazer Doppler akış ölçer ve stereotaksik cihaz kullanarak omurilik yüzey kan akımı ölçüm kurulumu. (B)PT öncesi ve sonrası omurilik kan akımı ölçüldü. Bu deneyde, PT% 12 güç çıkışı ile 2 dakika süreyle bir ışık kaynağı ile aydınlatılarak indüklenmiştir. Işınlanmış yüzeyinin çapı 0.75 mm idi ve omurilik ortasında oldu. Kan akımı PT önce stabilize sinyali elde etmek 5 dakikaya kadar ve PT takip eden 10 dakikaya kadar kaydedildi. Her fare verileri öncesinde ışık aydınlatması için değerine normalize edildi. Grafik 3 farelerden alınan verilerin ortalama değerini göstermektedir. ok PT başlangıcını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir Şekil 3. omurilik iskemisi PT-kaynaklı (A). Fotoğraffare omurilik indüksiyon PT mikroskop üzerine yerleştirilir. Farenin konumu boyutlu XY kayma sahne ve Lab-Jack kullanarak üç ayarlanabilir. 10X objektif Işık omurilik yüzeyine odaklanmıştır. (BC) enjeksiyonu takip (C) aydınlatma (B) öncesi ve sonrasında omurilik kan damarlarının Floresan görüntüleri Bengal yükseldi. Işınlama (C) 2 dakika (oklara bakınız) sonra kan pıhtısı dikkat edin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Omurilik Şekil 4. Nissl-Boyaması. Normal (bölümleri içermektedir rostral-to-kaudal omurilik enine kesitler bir dizi Nissl-Boyaması görüntüleri1 ve 6) ile PT-kaynaklı üssü (bölümler 2-5). farenin 3 gün PT sonra kurban edilmiştir. Her omurilik bölüm 30 mikron kalınlığındadır. İki bölümden arasındaki aralık 750 mm. 3. Resimde kesikli çizgi infarkt bölgesini özetliyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Neun, GFAP ve Iba1 Şekil 5. immün. Neun (A) 'nın Floresan görsel GFAP, normal (üst panel), (B) ve Iba1 (C) boyanması ve (alt panel), omurilik bölümleri PT-yaralandı. yaralı fare 3 gün PT sonra kurban edildi. kesikli çizgiler normal dokulardan gelen enfarktüs bölgeleri ayırmak. kutulu bölgeler 50 ölçek çubuğu ile GFAP ve Iba1 ifade yüksek çözünürlüklü görüntüler göstermekum. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film . Omurilikteki PT davranışsal açıkları uyarılan. Film normal ve bir kafes içinde bir PT-yaralı fare hareketini gösterir. Arka-bacaklarda (parapleji) felç belirten inured omurilik ile fare her iki arka-bacaklarda sürükleyerek dikkat edin. Film yaralı fare PT 24 saat sonra çekildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, biz SC iskemi bir Fototrombotik modelini tarif. Nedeniyle gelişmelere genetik mühendisliğinde mümkün SC iskemik patofizyolojisinde rol oynayan spesifik genlerin etkilerini incelemek için yapmıştır piyasada mevcut transgenik farelerin bir dalgalanma olmuştur. Bu çalışmanın amacı, omurilik iskemisi tekrarlanabilir bir fare modeli geliştirmek olmuştur. Burada farelerde SCI ikna etmek için bir kortikal PT modeli uyarladı. Cerrahisi T11 torakal vertebra seviyesinde farelerin dorsal posterior spinal ven ve kılcal ardından maruz bırakıldı. Rb, bir ticari olarak temin edilebilir foto boya, arzu edilen vasküler dağılımını elde etmek için, retro-orbital sinüs yoldan enjekte edildi. maruz kan damarı sonra trombüs ve daha sonra bir infarkt üzerine oluşumunu uyarmak için yeşil ışık tarafından ışınlandı. Histolojik ve immün yöntemlerden Bizim sonuçlarımız PT omurilik ve Reacti bir enfarktüs kaynaklı olduğunu gösterdiperi-infarkt bölgesinde gliozis ve. Arka bacak felç gibi nörolojik defisit de gözlenmiştir. Bu veriler PT omurilik yaralanması sonrasında patofizyolojisi ve hücre ölümü mekanizmaları çalışmak için uygun bir model olduğunu düşündürmektedir. protokol dahilinde kritik safha SC dorsal yüzeyi üzerinde kan damarı görselleştirilmesi için omur ince yüzeyine yüksek devirli kullanılmasıdır. Bu adım dikkatle matkap spinal boşluğuna girip SC zarar neden olabilir aşırı basınç uygulaması olarak yapılmalıdır. Öte yandan, düzensiz incelme uygunsuz yanmasına neden olabilir ve düzensiz infarkt üretebilir. Bu sorunu çözmek için, sondaj, her kısa aşamasından sonra mikroskop altında kemik yüzeyinin sık muayene kemik kalınlığını değerlendirmek ve daha fazla matkap kullanımını değerlendirmek için tavsiye edilir. steril tuzlu su kullanımı ortaya yüzeyinin daha iyi görüntülenmesi için de enkaz boşaltılmasında tavsiye edilir. Eksilerini bakımıtüm cerrahi prosedür sırasında tant asepsi, hayvanın uygun ameliyat sonrası bakım hayvan beka artırmak ve deneylerin başarı oranını artırabilir.
PT Bizim mevcut modeli olabilir (örneğin cıva lambası, metal halide lamba veya 488 nm dalga boyunun lazer gibi) bir ışık kaynağı olan bir epi-floresan mikroskop ile donatılmış herhangi bir laboratuvar olarak herhangi bir pahalı araçların alımını gerektirmez Bu yordamı gerçekleştirmek. Buna ek olarak, bu teknik karmaşık ve olan aort kombine tıkanıklığı, sol subklavian ve iç meme arteri 25 ve modifiye aort kros klemp yöntemiyle 26 gibi diğer SC iskemi modelleri ile karşılaştırıldığında diyafram boyutunu ayarlayarak enfarktüs boyutu üzerinde kontrol sağlar Son derece invaziv. Bizim modelde görselleştirme için vertebra ince dorsal yüzeyine yüksek hızlı matkap SCI ikna etmek pek laboratuvarlar tarafından bir Laminektomi alternatif seçim yöntemi olarak seçildi.Laminektomi nedeniyle vertebral kan damarlarının transection aşırı kanama neden olabilir ve bu görüntüleme için alanı belirsiz olabilir omurların kesilmesini gerektirir. Bazı protokoller bu sıkıştırma neden olabilir laminektomi sırasında aşırı kanama temizlemek için pamuklu kullanılmasını tavsiye olsa hangi SC ek yaralanmasına neden olabilir. Daha fazla omurilik maruz yüzey kan ve kan bileşenleri ile doğrudan temas yanı sıra deney gereksiz değişkenlik ekleyebilirsiniz kesilmiş kemiklerin keskin kenarları gelebilir. Mevcut PT modeli kullanarak, farklı boyut ve derinlik ile enfarktüsü ışık kaynağına maruz yüzey maruz kalma ve alan süresi yoğunluğunun basit manipulasyonlar sonucunda oluşturulabilir. Bu çalışma, SC T11 merkezi bölgeye iskemi oluşturulan, ancak, bu yöntem aynı zamanda rostral-to-kaudal boyunca farklı konumlarda infarkt yanı sıra omurilik, MIG yanal yönü üretebilirht parapleji iskemi bölgeye özgü etkisini anlamak yarar. Aydınlatma omuriliğin yüzeyindeki olmasına rağmen, diğer yandan, ışık doku içinde belli bir derinliğe kadar nüfuz edebilir ve yaralanma gri konuda indüklenebilir. Rose Bengal tüm dolaşım sisteminde dağıtılır gibi hayvan türleri aynıdır, yaş ve ağırlık benzer, eğer biz tutarlı lezyon PT tarafından uyarılan kortikal iskemi gibi oluşturulur bekliyoruz.
PT-kaynaklı iskemi diğer önemli avantajı hayvanların çok düşük mortalite olduğunu. Düşük mortalite uzun süreli sağkalım çalışmaları sağkalım ve motor fonksiyon kurtarma iskemik yaralanma zamansal etkisini çözülüyor yararlı olabilir yapılabilir anlamına gelir. Bu model aynı zamanda, genellikle yaralanma 14,19,27-29 kronik fazında geç ortaya hücresel onarım mekanizmalarını anlamak için yardımcı olabilir. Bu model aynı zamanda olabilir b önemli motor fonksiyon açıkları üretiyore fonksiyonel iyileşme üzerinde nöroprotektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılan. Buna ek olarak, bu model aynı zamanda aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon, nöronal ve astrositik Ca 2 + sinyalizasyon ve iki foton mikroskopi kullanılarak canlı farelerde aşırı yükleme olarak SKY sonrası patolojik değişikliklerin çalışmayı sağlayacaktır.
Diğer tüm SCI modellerinde olduğu gibi, PT mahsursuz değildir. Bu tekniğin dezavantajları, kortikal PT görülenlere benzerdir. Eksiklikleri birkaç birçok nöro-koruyucu ilaç hedefi olan bir anatomik açık penumbra, eksikliği ve reperfüzyon yokluğunu içerir. İyi reperfüzyon iskemi artmış reaktif oksijen türlerinin üretimi, inflamatuar hücre infiltrasyonu ve sitokin üretimi artışına 30-32 gibi değişiklikler ile karakterize edildiği bilinmektedir. PT reperfüzyon eksikliği SC reperfüzyon hasarı ile ilişkili değişiklikler bu modeli kullanarak incelemek için zor kalacak demektir.Ancak, PT kaynaklı iskemi kullanmanın avantajları dezavantajları daha ağır ve bu teknik bir gerçekleştirmek kolay ve farelerde SCI üretme yüksek tekrarlanabilir modeli ile araştırmacılar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [Grant no tarafından desteklenmiştir. R01NS069726] ve Yardımlaşma Grant Amerikan Kalp Derneği Grant [Hibe no. 13GRNT17020004] SD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
| C57BL/6J | Jackson lab | 664 | 22 - 25 g |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
| Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
| Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
| Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
| Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
| Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
| Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
| Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
| Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
| Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4 x 4 in plate to adjust the height of the animal |
| X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Young, W. Secondary injury mechanisms in acute spinal cord injury. J Emerg Med. 11, Suppl 1. 13-22 (1993).
- Crowe, M. J., Bresnahan, J. C., Shuman, S. L., Masters, J. N., Beattie, M. S. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat Med. 3 (1), 73-76 (1997).
- Soubeyrand, M., et al. Effect of norepinephrine on spinal cord blood flow and parenchymal hemorrhage size in acute-phase experimental spinal cord injury. Eur Spine J. 23 (3), 658-665 (2014).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (2012).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis). Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Liu, X. Z., et al. Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J Neurosci. 17 (14), 5395-5406 (1997).
- Liu, L., et al. An experimental study of cell apoptosis and correlative gene expression after tractive spinal cord injury in rats. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 42 (23), 1434-1437 (2004).
- Hirose, K., et al. Activated protein C reduces the ischemia/reperfusion-induced spinal cord injury in rats by inhibiting neutrophil activation. Ann Surg. 232 (2), 272-280 (2000).
- Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
- Guerit, J. M., Dion, R. A. State-of-the-art of neuromonitoring for prevention of immediate and delayed paraplegia in thoracic and thoracoabdominal aorta surgery). Ann Thorac Surg. 74 (5), S1867-S1869 (2002).
- Schepens, M. A., Heijmen, R. H., Ranschaert, W., Sonker, U., Morshuis, W. J. Thoracoabdominal aortic aneurysm repair: results of conventional open surgery. Eur J Vasc Endovasc Surg. 37 (6), 640-645 (2009).
- Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp Transl Stroke Med. 1, 8 (2009).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 1. Time course of hemodynamic consequences. J Cereb Blood Flow Metab. 6 (2), 184-194 (1986).
- Zhang, W., et al. Neuronal protective role of PBEF in a mouse model of cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (12), 1962-1971 (2010).
- Li, H., Zhang, N., Sun, G., Ding, S. Inhibition of the group I mGluRs reduces acute brain damage and improves long-term histological outcomes after photothrombosis-induced ischaemia. ASN Neuro. 5 (3), 195-207 (2013).
- Li, H., et al. Histological, cellular and behavioral assessments of stroke outcomes after photothrombosis-induced ischemia in adult mice. BMC Neurosci. 15, 58 (2014).
- Wang, T., Cui, W., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2 (1), 33-42 (2010).
- Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J Neurosci Methods. 117 (1), 43-49 (2002).
- Boquillon, M., Boquillon, J. P., Bralet, J. Photochemically induced, graded cerebral infarction in the mouse by laser irradiation evolution of brain edema. J Pharmacol Toxicol Methods. 27 (1), 1-6 (1992).
- Kim, G. W., Lewen, A., Copin, J., Watson, B. D., Chan, P. H. The cytosolic antioxidant, copper/zinc superoxide dismutase, attenuates blood-brain barrier disruption and oxidative cellular injury after photothrombotic cortical ischemia in mice. Neuroscience. 105 (4), 1007-1018 (2001).
- Schmidt, A., et al. Photochemically induced ischemic stroke in rats. Exp Transl Stroke Med. 4 (1), 13 (2012).
- Lang-Lazdunski, L., et al. Spinal cord ischemia. Development of a model in the mouse. Stroke. 31 (1), 208-213 (2000).
- Wang, Z., et al. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J Neurosci Methods. 189 (2), 246-251 (2010).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. J Vis Exp. (76), (2013).
- Lu, H., et al. Induction and imaging of photothrombotic stroke in conscious and freely moving rats. J Biomed Opt. 19 (9), 96013 (2014).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Front Neuroenergetics. 6 (1), (2014).
- Bell, M. T., et al. Toll-like receptor 4-dependent microglial activation mediates spinal cord ischemia-reperfusion injury. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S152-S156 (2013).
- Smith, P. D., et al. The evolution of chemokine release supports a bimodal mechanism of spinal cord ischemia and reperfusion injury. Circulation. 126 (11 Suppl 1), S110-S117 (2012).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50 (4), 264-274 (2012).
