Introduction
Traumatisk rygmarvsskade (SCI) er en ødelæggende klinisk tilstand påvirker sensomotoriske og autonome funktioner i SC. Patienter overlevende SCI er ofte tilbage med invaliderende paraplegi der væsentligt påvirker deres daglige aktiviteter og livskvalitet 1. Eksperimentel SCI-modeller har været et uundværligt redskab i den videnskabelige undersøgelse for at forstå patofysiologien af SCI og associerede neurale reparation processer. Disse modeller er også blevet anvendt til at teste den prækliniske effekt af forskellige eksperimentelle neurobeskyttende interventioner, der tager sigte på funktionelle opsving. I øjeblikket flertal af SCI i praksis, ansætte brugen af fysisk stump kraft til mekanisk at afbryde og skade SC. Disse metoder omfatter kontusion, kompression, dislokation og transection af SC 2. Det er blevet foreslået, at efter den primære mekaniske spot en sekundær skade i form af iskæmi sætter ind i den skadede SC 3,4. Ætiologien af sekundære iskæmi omfatter omfattende væv degeneration, parenchymal blødning og undertiden ved obstruktion af blodkar ved vævsødem 5-7. Som følge af den sekundære skade integriteten af SC er yderligere påvirket, er neuroner og gliaceller alvorlig nedsat funktion og levedygtighed og undergår apoptose, der fører til infarkt vækst i den kroniske fase af skade, der er analog med væksten af iskæmisk Penumbra efter slagtilfælde 8,9. Adskillige mekanismer som excitotoksicitet, fri radikal produktion, og inflammation er blevet rapporteret at være ansvarlig for den iskæmisk celledød efter SCI 10,11. Desuden SC iskæmi er en alvorlig komplikation af thoraco-abdominalt aortaaneurisme reparation operationer som ofte fører til paraplegi hos patienterne 12,13. På trods af så høj klinisk effekt meget få modeller af rygmarvsiskæmi med høj reproducerbarhed er i øjeblikket tilgængelige.
nt "> Photothrombosis (PT) er en almindeligt anvendt metode til induktion af fokal iskæmi i hjernen 14-20. Teknikken er forholdsvis non-invasiv, meget reproducerbar og danner en præcis fokal iskæmisk læsion i det udsatte område af hjernen 17 -21. Dette opnås ved systemisk indgivelse af fotoaktive farvestoffer som Rose Bengal (RB) 16-20,22 eller erythrosin B 23 efterfulgt af lokaliseret bestråling af blodkar med ordentlig lyskilde. Fotoaktivering af farvestoffet forårsager dannelse af frie radikaler, som forstyrre integriteten af den glatte vaskulære endotel, og forårsage blodpladerne at akkumulere, som efterfølgende danner en trombe. The obstruktion af blodstrømmen ved trombe resulterer i et infarkt i regionen leveret af beholderen 24. På grund af lethed af styring på intensiteten og varigheden af bestråling denne fremgangsmåde giver en meget ensartet og reproducerbar infarkt. Endvidere kan denne metode anvendes til at inducere en infarct på forskellige anatomiske steder muliggør rumlige (f.eks grå stof vs. hvid substans) forståelse af virkningen af iskæmi.Formålet med den aktuelle undersøgelse er at udvikle en let og meget reproducerbar model af SC iskæmi i mus. Vi beskrev fremgangsmåden i en PT model af SC iskæmi i mus. Resultater fra histologi og immunfarvning viste, at PT effektivt kan inducere SC infarkt, neurontab og reaktiv gliose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Mus (C57BL / 6J, han) alderen 10-12 uger gamle, blev anvendt i denne undersøgelse. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af University of Missouri Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. Pre-kirurgi
- Dagen før operationen autoklave og sterilisere alle de kirurgiske instrumenter. Pak de instrumenter og autoklave ved 121 ° C ved 15 psi i 30 minutter efterfulgt af 30 min af tørring (121 ° C, 15 psi, 30/30 cyklus). Placer instrumenterne i et rent og sterilt miljø indtil videre anvendelse.
- Forberede frisk Rose Bengal (RB) opløsning (20 mg / ml i sterilt saltvand) hver gang før operationen. For helt at opløse RB, vortex røret derefter fulgt af lydbehandling i 5 min ved 50/60 Hz med udgangseffekt på 19 W. Wrap røret i alufolie og beskytte den mod lys indtil videre anvendes under surgery.
- Klargør en blanding af ketamin / xylazin i sterilt saltvand. Tilføj 125 pi xylazin (lager koncentration: 20 mg / ml) og 325 pi ketmaine (lager koncentration: 100 mg / ml) og 550 ul sterilt saltvand til at foretage et endeligt volumen på 1 ml anæstesiblanding.
- Pre-varme homeotermisk varmepude.
- Pre-varme metalhalogenlampe (lyskilde til FN1 epi-fluorescensmikroskop) i 30 minutter for at stabilisere lampeeffekt.
- Justere størrelsen af det belyste område til en diameter på 1 mm ved hjælp 10X objektiv og et trådkors ved at justere feltblændet i oprejst FN1 epi-fluorescensmikroskop.
2. Kirurgisk Procedure
- Anesthetize mus med en dosis af ketamin (130 mg / kg B. vægt-.) Og xylazin (10 mg / kg B. vægt-.). Baseret på den cocktail i 1,3, 4 pi pr g mus B. vægt. er nødvendige. Sterilisere injektionsstedet med en spritserviet og administrere bedøvelsesmidler gennem intra-peritoneal (IP) vej. Pas på ikke at injicere bedøvelsesmidler i blodkar eller muskler som dette ville forsinke induktion og nyttiggørelse af dyret.
- Giv kunstigt tåre salve til begge øjne med musen for at forhindre udtørring og placere dyret på varmepude til at forhindre hypotermi.
- Tilberedning af animalske
- Check dyret for korrekt kirurgisk niveau anæstesi ved hjælp tå knivspids respons.
- Når dyret har nået kirurgisk niveau for bedøvelse, klip håret på den dorsale overflade omkring midterlinjen af dyr ved anvendelse af en elektrisk trimmer hår. Skrubbe operationsstedet med 70% ethanol efterfulgt af betadinopløsning tre gange. Dæk site med en steril kirurgisk afdækningsstykke til næste trin.
- Kirurgisk indgreb for at tynde knoglen for at blotlægge rygmarven
- Placer musen i bugleje over homeotermisk varmepude på den kirurgiske platform (figur 1A). Korrekt fastgøre musenarbejdsstillinger under anvendelse af en snude klemme til at opretholde en langstrakt hals region (figur 1A, B).
- Lave et snit (ca. 1 cm lang) under anvendelse af kirurgiske sakse langs den dorsale midt linie strækker sig fra den thorakale ryghvirvler T9 til T12. Skub huden til at afsløre kirurgiske område.
- Ved hjælp af en skalpel, forsigtigt rydde musklen til at afsløre de dorsale spines på T9 - T12 ryghvirvler. Stoppe blødninger i hvert trin ved at tilføre et let pres med sterilt vatpind. Separat T10 - T12 ryghvirvler fra det omgivende muskel og sikres ved hjælp af en vertebral klemme til at stabilisere og forhindre enhver bevægelse (figur 1A, B).
- Ved hjælp af en høj hastighed boremaskine knogle polering boret med, omhyggeligt og forsigtigt tynd dorsale overflade af T10 eller T11 ryghvirvel at visualisere den bageste spinal vene og andre små fartøjer på den dorsale overflade SC (figur 1C).
- At forhindre termisk beskadigelse på grund af varme, der genereres under udtynding procedure,anvende en blid og konstant strøm af normalt saltvand sammen med konstant sugning for at fjerne debris.
- Ved hjælp af en skalpel omhyggeligt glatte knogleoverfladen indtil hovedbeholderen er klart synlig. Pas på ikke at beskadige rygmarven under denne proces.
- Når blodkarret visualiseres, administrere RB i en dosis på 30 mg / kg (legemsvægt) gennem retro-orbital sinus rute ved hjælp af en insulinsprøjte.
- Måle blodgennemstrømning under anvendelse af en laser Doppler flowmeter efter 3 min efter injektion RB om nødvendigt (figur 2A, B). Opretholde aseptik under hele proceduren.
3. Induktion af PT
- Placer dyret på en XY position justerbar fase over en Lab-Jack, der kan justere højden. Justere placeringen af musen, så den udsatte region T11 rygmarv er direkte under 10x formål med FN1 epi-fluorescensmikroskop (figur 3A).
- Indstil magt light kilde ved 12% og bestråle T11 region med en diameter på 0,75 mm i midten af fortyndede rygmarv (Bemærk: denne region omfatter den bageste spinal vene og andre kapillærer) med et grønt lys (bølgelængde 540-580 nm, hvilket er opnås ved filteret terningen i mikroskopet) gennem 10X objektiv i 2 min. Tage billeder ved begyndelsen og slutningen af bestråling (figur 3B, C) og registrere tidspunktet for forsøget på dette tidspunkt.
- Måle blodgennemstrømning igen i 10 minutter, hvis nødvendigt ved at anbringe laser Doppler probe til samme position over rygmarven som i 2.4.8 (figur 2A, B).
- Efter bestråling check for enhver blødning og hvis ingen fundet videre til suturering dyret. Sutur de overfladiske fascia sammen med musklerne på begge sider af rygmarven igennem en absorberbar sutur eller 4-0 size silkesutur. Pas på ikke at beskadige den udsatte SC. Sutur huden med 4-0 silkesutur. Påfør Betadine eller jodtil kanterne af huden efter suturering.
4. Post-kirurgi pleje
- Efter syning, placere dyret på varmepuden for inddrivelsen. Efter inddrivelsen kontrollere dyrene for tegn på neurologiske underskud ved at observere bevægelsen af både hind-lemmer. Lad ikke dyret uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
- Overfør dyrene til hjemmet bur. Må ikke returnere det dyr, der har gennemgået operation for at selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
- Tjek dyrene med jævne mellemrum. I tilfælde af alvorlige neurologiske underskud, give ordentlig pleje ligesom evakuering af blære, administration af analgetika (buprenorphin, 0,05-0,1 mg / kg). Check for dehydrering og administrere normalt saltvand subkutant i alvorlige tilfælde. Sædvanligvis vil buprenorphin (0,1 mg / kg) indgives efter suturering til at lindre smerter i operationsstedet.
- Hvis dyrene ikke er umiddelbartaflivet efter operationen, vil vi sætte højt vandindhold kost på burets gulv, så dyrene kan nå maden nemt.
5. Transcardial Perfusion, Nissl farvning og Immunfarvning
- Transkardialt perfundere dyr som beskrevet tidligere 17-20.
- Bedøver dyret som beskrevet tidligere i protokollen og transkardialt perfuse med phosphatbuffer saltvand (PBS, pH 7,4), efterfulgt af iskold 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS.
- Efter perfusion fjernes rygmarven (SC) og post-ordne det i 4% PFA i PBS ved 4 ° CO / N. Overfør det faste SC i PBS med 30% saccharose og holde det til 2 - 3 dage, indtil det synker til bunden af røret.
- Under anvendelse af en kryostat sender rygmarven i 30 um tykke snit og placere dem serielt på en gelatineovertrukne objektglas eller i en 48-brønds plade med 0,01 M PBS.
- Nissl farvning: At inspicere skade forårsaget af PT udføre en Nissl staining på rygmarv sektioner som tidligere beskrevet 17-20.
- Kort fortalt indsamle hver femte rygmarven skive på objektglas og farvning med 0,25% cresylviolet. Tage billeder af de farvede snit (figur 4).
- Immunfarvning: Som tidligere beskrevet ved hjælp af en flydende sektion metode 17,18,20.
- Kort fortalt, bejdse rygmarven sektioner ved inkubation O / N ved 4 ° C med kanin-anti-glia-fibrillært surt protein (GFAP) polyklonalt antistof (1: 300), kanin-anti-NeuN antistof (1: 300), og kanin-anti- Iba1 antistof (1: 500), efterfulgt af æsel-anti-kanin Alexa 568-konjugeret IgG (1: 400) sekundære antistoffer i 4 timer ved stuetemperatur. Tage billeder med et fluorescerende mikroskop (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne undersøgelse var at producere rygmarvsiskæmi i mus ved anvendelse af en PT-model. Efter det ønskede område af knoglen over rygmarven (T10 - T12) blev fortyndet, blev Rose Bengal indsprøjtes gennem retro-orbital sinus rute, og iskæmi blev induceret ved PT figur 1A, B viser musen placeret i en specialfremstillet kirurgisk. platform under kirurgi. Musen blev holdt på plads af en snude klemme og to justerbare hvirveldyr klemmer at stabilisere rygmarven Figur 1C viser en fortyndet vindue over rygmarv fra T10 -. T12. Den vigtigste blodkar og dets filialer kan tydeligt visualiseres. For at bekræfte induktionen af iskæmi, blev ændringer i blodgennemstrømningen målt ved anvendelse af en laser Doppler flowmeter før og efter PT (figur 2A, B). Til analyse blev faldet i% af blodgennemstrømningen beregnet under anvendelse af baseline blodgennemstrømning før photothrombosis. Blodgennemstrømning faldet til ~ 20% umiddelbart efter lys belysning sammenlignet wed det basale niveau forud for belysning. 3B, C viser fluorescerende billeder af spinal fartøjer navlestrengsblod i begyndelsen og slutningen af PT. Belysning i 2 min induceret blodprop i blodkar (figur 3C), hvilket tyder på induktionen af iskæmi, i overensstemmelse med målingerne af laser Doppler flowmeter. At inspicere de skadelige virkninger af PT blev musene aflivet 3 dage efter PT og Nissl farvning blev udført. Billeder taget efter Nissl farvning viste infarkt regionen, der kan være klart afgrænset fra den omkringliggende region, hvilket indikerer rygmarven vævsskade og celledød efter PT (figur 4). Immunfarvning blev udført for NeuN, GFAP og Iba1. NeuN + neuroner blev tabt i den grå substans i den iskæmiske kerne (figur 5A), mens GFAP ekspression blev øget i grænseområdet for iskæmisk kerne (figur 5B, se også indrammede område). De Iba1 + mikroglia udstillet en Globoid morphology (dvs.., en forstørret celle krop med kortere og færre processer, se indrammet område) sammen med øget Iba1 udtryk (figur 5C). Selv om der var et væv underskud i iskæmiske kerneområde på grund af flydende sektion farvning, kan tydeligt iagttages en stigning i GFAP og Iba1 udtryk på hele peri-infarkt region. Disse resultater indikerer neuronal død og reaktiv gliose i Penumbra efter SC iskæmi. På den anden side blev der betydelige funktionelle mangler observeret i de sårede mus, dvs. deaktiveret hind-bevægeapparatet en dag efter PT, hvilket indikerer lammelse af hind-ben (se filmen).
Figur 1. PT-induceret iskæmi modellen i rygmarven. (A) Fotografier af kirurgi platform for rygmarven PT. Indsat: forstørret vertebrale klemmer.(B) Musen blev holdt af en snude klemme og af to specialfremstillede vertebrale klemmer på scenen. Bemærk, at knoglen blev tyndet ved T10 -. T12-regionen og to metal vertebrale klemmer blev anvendt til at stabilisere rygmarven (C) En zoom-in billede, der viser området med tyndet-bone over rygmarven ved T10-11 for induktion af PT. Bemærk de vigtigste blodkar og dens filialer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Spinal navlestrengsblod flowmåling. (A) Opsætningen af rygmarven overflade blodgennemstrømning måling med en laser Doppler flowmeter og stereotaktisk apparat til at placere sonden. (B)Rygmarv blodgennemstrømning før og efter PT blev målt. I dette forsøg blev PT induceret ved belysning med en lyskilde for 2 minutter med en 12% effekt. Diameteren af den bestrålede overflade var 0,75 mm, og var i midten af rygmarven. Blodgennemstrømning blev registreret i op til 5 min til opnåelse af et stabiliseret signal før PT og op til 10 min efter PT. Data fra hver mus blev normaliseret til værdien før lys belysning. Grafen viser den midlede værdi af data fra 3 mus. Pilen angiver starten på PT. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. PT-induceret rygmarvsiskæmi. (A) Fotografi af enmus placeret på mikroskopet til induktion PT i rygmarven. Placeringen af musen kan justeres i tre dimensionelt bruge XY glidende scenen og en Lab-Jack. Lys fra 10X mål blev fokuseret på overfladen af rygmarven. (BC) Fluorescerende billeder af blodkarrene i rygmarven før (B) og efter (C) illumination efter injektion af Rose Bengal. Læg mærke til blodprop efter 2 min af bestråling (C) (se pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Nissl farvning af rygmarven. Nissl farvende billeder af en række rostralt-til-caudal rygmarven tværsnit, der omfatter normale (sektioner1 og 6), og PT-induceret epicentret (§§ 2 - 5,). Musene blev aflivet 3 dage efter PT. Hver rygmarv sektion er 30 um tyk. Intervallet mellem to sektioner er 750 um. Den stiplede linie i 3. billede skitserer infarkt regionen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. immunfarvning af NeuN, GFAP og Iba1. Fluorescerende billeder af NeuN (A), GFAP (B) og Iba1 (C) farvning fra normale (øverste paneler) og PT-skadet (nedre paneler) rygmarv sektioner. Den sårede mus blev aflivet 3 dage efter PT. De punkterede linier adskille regioner infarkt fra normalt væv. De indrammede områder viser billeder i høj opløsning af GFAP og Iba1 udtryk med en skala bar af 50um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie . PT i rygmarven inducerede adfærdsmæssige underskud. Filmen viser bevægelsen af en normal og en PT-såret mus i et bur. Bemærk den trække begge hind-led af musen med hrdet rygmarv, hvilket indikerer lammelse af bagben-lemmer (paraplegi). Filmen blev taget 24 timer efter PT i den skadede mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse beskrev vi en photothrombotic model af SC iskæmi. På grund af fremskridt i gensplejsning har der været en kraftig stigning i kommercielt tilgængelig transgene mus, som har gjort det muligt at undersøge virkningen af specifikke gener involveret i iskæmiske patofysiologi i SC. Formålet med undersøgelsen var at udvikle en reproducerbar musemodel for rygmarvsiskæmi. Her tilpasses vi en cortical PT model til at inducere SCI i mus. Efter operationen den bageste spinal venen og kapillærer på den dorsale aspekt af mus på niveau med T11 brysthvirvel blev udsat. Så RB, et kommercielt tilgængeligt fotoaktiv farvestof blev injiceret gennem retro-orbital sinus rute for at nå den ønskede vaskulære distribution. Det eksponerede blodkar blev derpå bestrålet med et grønt lys til at inducere dannelse af trombe og senere et infarkt. Vores resultater fra histologiske og immunfarvning metoder viste, at PT inducerede en infarkt i rygmarven og reactive gliose i peri-infarkt regionen. Neurologiske underskud som bagbensparalyse blev også observeret. Disse data antyder, at PT er en egnet model til undersøgelse patofysiologi og mekanismer for celledød efter SCI. Den kritiske trin i protokollen er anvendelsen af en høj hastighed boremaskine til tynde overfladen af hvirvlen til visualisering af blodkarret på den dorsale overflade af SC. Dette trin skal nøje udføres som anvendelse af overtryk kan forårsage boret at indtaste spinal hulrum og beskadige SC. På den anden side kan ujævn udtynding resultere i forkert belysning og kan frembringe uregelmæssige infarkter. For at løse dette problem, anbefales hyppig inspektion af overfladen af knoglen under mikroskop efter hvert kort trin med boring at vurdere tykkelsen af knoglen og for yderligere at vurdere anvendelsen af boret. Det anbefales at bruge sterilt saltvand overfor udvaskning affaldet samt til det bedre visualisering af den eksponerede overflade. Fastholdelse constant aseptik i hele kirurgisk procedure, ordentlig post-kirurgisk pleje af dyret kan forbedre dyrs overlevelsesevne og øge succesraten af forsøgene.
Vores nuværende model for PT kræver ikke køb af eventuelle dyre instrumenter, som alle laboratorier, der er udstyret med en epi-fluorescensmikroskop med en lyskilde (f.eks kviksølvlampe, metalhalogen eller laser på 488 nm bølgelængde) kan udføre denne procedure. Desuden er denne teknik giver kontrol over størrelsen af infarktet ved at justere størrelsen af åbningen i forhold til andre SC iskæmimodeller som kombineret okklusion af aorta, venstre subclavia og indre brystarterie 25 og modificeret aorta- cross fastspænding metode 26, som er komplicerede og er yderst invasive. I vores model en højhastigheds boremaskine til tynd den dorsale overflade af hvirvlen til visualisering blev valgt som et alternativ til laminektomi, foretrukne metode af mange laboratorier til at inducere SCI.Laminektomi involverer skæring af hvirvlerne, der kan forårsage overdreven blødning på grund af overskæring af de vertebrale blodkar, og dette kan tilsløre feltet til billeddannelse. Selvom nogle protokoller rådgive brug af vatpinde til at rydde ud i voldsom blødning under laminektomi det kan resultere i kompression, som kan forårsage yderligere skade på SC. Yderligere den blottede overflade af rygmarven kan komme i direkte kontakt med blod og dets komponenter samt skarpe kanter af de afskårne knogler, som kan tilføje unødvendige variabilitet til eksperimentet. Med den aktuelle PT model kan infarkt med forskellig størrelse og dybde genereres ved simpel manipulation af intensiteten af lyskilden, varighed af eksponering og areal af den eksponerede overflade. Selv om den nuværende undersøgelse genererede iskæmi på den centrale region af T11 i SC, kan denne metode også generere infarkter på forskellige steder langs rostral-to-caudal samt sideretningen af rygmarven, hvilket MIGht gavne forståelsen af regionen-specifikke effekt af iskæmi på paraplegi. På den anden side, selv om belysningen er på overfladen af rygmarven, kan lyset trænge igennem til vis dybde i vævet, og skaden kan også induceres i den grå substans. Som Rose bengal er fordelt i hele cirkulationssystemet, hvis de dyrearter er de samme, og alderen og vægten er ens, forventer vi konsekvent læsion vil blive genereret som i kortikal iskæmi induceret af PT.
Den anden store fordel ved PT-induceret iskæmi er meget lav dødelighed hos dyrene. Lav dødelighed betyder langsigtede overlevelse undersøgelser kan gennemføres, som kunne være nyttige i at udrede den tidsmæssige virkning af iskæmisk skade på overlevelse og motorisk funktion opsving. Denne model kan også hjælpe med at forstå de cellulære reparation mekanismer, der normalt opstår sent i kronisk fase af skade 14,19,27-29. Denne model producerer også betydelige motoriske underskud, som kan be anvendes til at vurdere effektiviteten af neuroprotektive midler på funktionel restitution. Desuden vil denne model også tillade undersøgelsen af patologiske ændringer efter SCI såsom axonal degeneration og regeneration, neuronal og astrocytisk Ca2 + signalering og overbelastning med levende mus under anvendelse to-foton mikroskopi.
Ligesom alle andre SCI-modeller, PT er ikke blottet for ulemper. Ulemperne ved denne teknik svarer til dem, der ses i kortikal PT. Kun få af de mangler omfatter manglen på en anatomisk klar iskæmisk Penumbra, som er målet for mange neurobeskyttende lægemidler, og fraværet af reperfusion. Det er velkendt, at reperfusion efter iskæmi er karakteriseret ved ændringer som forøget produktion af reaktive oxygenarter, infiltration af inflammatoriske celler og forøget cytokinproduktion 30-32. Mangel på reperfusion i PT betyder ændringer i forbindelse med reperfusionsskade i SC forbliver vanskeligt at studere ved hjælp af denne model.Men fordelene ved at anvende PT inducerede iskæmi opvejer ulemperne og denne teknik giver forskere med en let at udføre og meget reproducerbar model af generering SCI i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [Grant nej. R01NS069726], og American Heart Association Grant i Aid Grant [Grant nej. 13GRNT17020004] til SD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
| C57BL/6J | Jackson lab | 664 | 22 - 25 g |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
| Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
| Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
| Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
| Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
| Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
| Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
| Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
| Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
| Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4 x 4 in plate to adjust the height of the animal |
| X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Young, W. Secondary injury mechanisms in acute spinal cord injury. J Emerg Med. 11, Suppl 1. 13-22 (1993).
- Crowe, M. J., Bresnahan, J. C., Shuman, S. L., Masters, J. N., Beattie, M. S. Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat Med. 3 (1), 73-76 (1997).
- Soubeyrand, M., et al. Effect of norepinephrine on spinal cord blood flow and parenchymal hemorrhage size in acute-phase experimental spinal cord injury. Eur Spine J. 23 (3), 658-665 (2014).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (2012).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis). Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Liu, X. Z., et al. Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J Neurosci. 17 (14), 5395-5406 (1997).
- Liu, L., et al. An experimental study of cell apoptosis and correlative gene expression after tractive spinal cord injury in rats. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 42 (23), 1434-1437 (2004).
- Hirose, K., et al. Activated protein C reduces the ischemia/reperfusion-induced spinal cord injury in rats by inhibiting neutrophil activation. Ann Surg. 232 (2), 272-280 (2000).
- Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
- Guerit, J. M., Dion, R. A. State-of-the-art of neuromonitoring for prevention of immediate and delayed paraplegia in thoracic and thoracoabdominal aorta surgery). Ann Thorac Surg. 74 (5), S1867-S1869 (2002).
- Schepens, M. A., Heijmen, R. H., Ranschaert, W., Sonker, U., Morshuis, W. J. Thoracoabdominal aortic aneurysm repair: results of conventional open surgery. Eur J Vasc Endovasc Surg. 37 (6), 640-645 (2009).
- Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp Transl Stroke Med. 1, 8 (2009).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 1. Time course of hemodynamic consequences. J Cereb Blood Flow Metab. 6 (2), 184-194 (1986).
- Zhang, W., et al. Neuronal protective role of PBEF in a mouse model of cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (12), 1962-1971 (2010).
- Li, H., Zhang, N., Sun, G., Ding, S. Inhibition of the group I mGluRs reduces acute brain damage and improves long-term histological outcomes after photothrombosis-induced ischaemia. ASN Neuro. 5 (3), 195-207 (2013).
- Li, H., et al. Histological, cellular and behavioral assessments of stroke outcomes after photothrombosis-induced ischemia in adult mice. BMC Neurosci. 15, 58 (2014).
- Wang, T., Cui, W., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2 (1), 33-42 (2010).
- Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J Neurosci Methods. 117 (1), 43-49 (2002).
- Boquillon, M., Boquillon, J. P., Bralet, J. Photochemically induced, graded cerebral infarction in the mouse by laser irradiation evolution of brain edema. J Pharmacol Toxicol Methods. 27 (1), 1-6 (1992).
- Kim, G. W., Lewen, A., Copin, J., Watson, B. D., Chan, P. H. The cytosolic antioxidant, copper/zinc superoxide dismutase, attenuates blood-brain barrier disruption and oxidative cellular injury after photothrombotic cortical ischemia in mice. Neuroscience. 105 (4), 1007-1018 (2001).
- Schmidt, A., et al. Photochemically induced ischemic stroke in rats. Exp Transl Stroke Med. 4 (1), 13 (2012).
- Lang-Lazdunski, L., et al. Spinal cord ischemia. Development of a model in the mouse. Stroke. 31 (1), 208-213 (2000).
- Wang, Z., et al. Development of a simplified spinal cord ischemia model in mice. J Neurosci Methods. 189 (2), 246-251 (2010).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. J Vis Exp. (76), (2013).
- Lu, H., et al. Induction and imaging of photothrombotic stroke in conscious and freely moving rats. J Biomed Opt. 19 (9), 96013 (2014).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Front Neuroenergetics. 6 (1), (2014).
- Bell, M. T., et al. Toll-like receptor 4-dependent microglial activation mediates spinal cord ischemia-reperfusion injury. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S152-S156 (2013).
- Smith, P. D., et al. The evolution of chemokine release supports a bimodal mechanism of spinal cord ischemia and reperfusion injury. Circulation. 126 (11 Suppl 1), S110-S117 (2012).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50 (4), 264-274 (2012).
