Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

באמצעות ניתוח של Confocal Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53162
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 5
1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

Summary

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטה לדמיין ligands מופץ על פני שדה של תאים. קלות לבטא חלבונים אקסוגניים, יחד עם הגודל הגדול של תאיהם בעוברים מוקדמים, לעשות Xenopus laevis מודל שימושי המאפשר הדמיה ligands מתויג GFP. mRNAs סינטטי מתורגמים ביעילות לאחר הזרקה לעוברי צפרדעי שלב מוקדם, ויכולים להיות ממוקדת זריקות לתא בודד. בשילוב עם נותב שושלת כגון RFP קרום קשור, התא המוזרק (וצאצאיו) שמייצרים את חלבון ביטוי יתר יכולים בקלות להיות אחריו. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור מתויגת fluorescently ligands Wnt ושש מmRNA המוזרק. השיטות כרוכות במילנתיחת CRO של explants ectodermal (כובעי בעלי חיים) והניתוח של דיפוזיה יגנד בדוגמאות רבות. באמצעות ההדמיה confocal, ניתן לקבל מידע על הפרשה ליגנד ודיפוזיה מעל שדה של תאים. ניתוחים סטטיסטיים של תמונות confocal לספק נתונים כמותיים על הצורה הדרגתיים ליגנד. שיטות אלה עשויות להיות שימושיות לחוקרים שרוצים לבדוק את ההשפעות של גורמים שעשויים להסדיר את הצורה הדרגתיים מורפוגן.

Introduction

במהלך התפתחות עוברית מוקדמת, תאים בהדרגה מחויבים לעקוב אחר שושלות ספציפיות של בידול: זה אומר קבוצה של totipotent (או pluripotent) התאים הפכו מוגבל בהדרגה להקמת אוכלוסיות של תאי אב נחושים לגרום לסוג תא אחד. איתות תאי תאים היא מרכזית להסדרת מפרט שושלת במהלך התפתחות עוברית. מניפולציה של אותות אלה תידרש לכוון תאי גזע לגורל מסוים כדי לתמוך טיפולים רפואיים חדשניים.

מספר קטן יחסית של מסלולי איתות הם חזרו במהלך פיתוח, כולל מסלולים להגיב לsuperfamily TGF (nodals וBMPs) 1-2, 3 FGFs, 4 Wnts, וקיפודים 5. חלבונים מופרשים אלה נקשרים הקולטנים הנוכחיים על קרום התא כדי להפעיל הולכים אותות ובכך לשנות את ביטוי הגנים ו / או התנהגות תא. הרגולציה ההדוקה של תא סימןalling חיוני למפרט שושלת תא והתפתחות תקינה. בעוד הצטלבות בין מסלולים אלה היא חשובה בקביעת גורל תא, יגנד אחד יכול עצמו לעורר תגובה שונה בריכוזים שונים. הדרגתיים מורפוגן תוארו לפני למעלה מ -100 שנים כתאוריה המסבירה כיצד סוגים שונים של תאים יכולים לנבוע מתחום התאים 6. איתות מולקולות המיוצרות על ידי קבוצה אחת של תאים עשויה לפזר על פני טווח מסוים, ירידה בריכוז במרחק גדול יותר מהמקור. תאים שנחשפו לאות יגיבו לריכוז המקומי במעמדם בתחום תאים, עם תאים בעמדות שונות מגיבים באופן שונה לרמות של האות שונות. ראיות לקיומו של morphogens מגיעה ממחקרים של העובר המוקדם תסיסנית 7 והדיסק האגף 8, כמו גם את איבר חוליות 9 וצינור עצבי 10.

שיטות יש צורך בvestigate איך מורפוגן הדרגתיים הוקמו ולזהות מולקולות אחרות חשובות בויסות הדרגתיים אלה. ניסויים אלגנטיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה לדמיין חלבונים אנדוגניים in vivo בהקשר של רקע גנטי שונה שימשו לחקור הדרגתיים מורפוגן 11-12. עם זאת, נוגדנים טובים ומוטציות ספציפיות לא תמיד זמינים, כך אנו מתארים כאן פרוטוקול באמצעות ביטוי יתר של ligands הניאון ב Xenopus, כדי לספק אלטרנטיבה, שיטה פשוטה לנתח כיצד מוצרי גן אקסוגני יכולים להשפיע הפצה של ligands על פני שדה של תאים. Xenopus laevis מספק מערכת מצוינת לבצע סוגים אלה של ניסויים כעוברים שלהם לפתח חיצוני ולכן הם נגישים בשלבים המוקדמים. גודלם הגדול (1-1.5mm קוטר) מפשט microinjection ומניפולציה כירורגית ועל ידי blastula שלבי התאים קלים לתמונה כפי שהם עדיין גדולים יחסית (כ -2081; מ 'רוחב). מחקרי ביטוי יתר בצפרדעים הם פשוט לעשות: mRNA מוזרק לתוך העובר המוקדם יכול להיות ממוקד לתאים מסוימים ומתורגם ביעילות.

מבני Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP מתויגים fluorescently היו שנוצרו באמצעות pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 וeGFP. פפטיד HA חשוב לכלול, לא רק כדי לספק תג מולקולרי נוסף, אלא גם משום שהוא חשב לפעול כspacer הפרדת חלבוני Wnt וeGFP מאפשרים שני מוצרי הגן לתפקד. המבנה המשמש להדמיה של שש שימש בעבר כדי ליצור עכבר מהונדס מבטא חלבון היתוך ששש-eGFP 15; זה סופק באדיבות על ידי אנדי מקמהון. חשוב לציין, תג ה- GFP לכל המבנים הוא משובט 3 'לאות הרצף כזה שנשמר לאחר העיבוד. כמו כן הוא חיוני על מנת להבטיח כי החלבון הסופי כולל רצפים הנדרשים לשינויים, כגון addition של שומנים כמו במקרה שלשישה וWnt ligands.The cDNAs היו subcloned לתוך וקטור pCS2 + ביטוי אשר מותאם במיוחד עבור prodution של mRNA הסינתטי; זה כולל אמרגן SP6 ואות polyadenylation (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

העבודה המתוארת כאן מספקת פרוטוקול פשוט להשוואת ההפרשה ודיפוזיה של fluorescently מתויג Wnt ושישה מתויגים ligands. על ידי הזרקת כמויות מוגדרות של mRNA הסינתטי, הפרוטוקול עוקף כל בעיות הקשורות לביטוי משתנה מוקטורים שונים באמצעות יזמים שונים. לאחרונה שיטות אלה יושמו כדי לחקור את ההשפעות של endosulfatase סולפט heparan Sulf1 שבשש-eGFP וWnt8a / הפרשת Wnt11b-HA-eGFP ודיפוזיה בXenopus 16-17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: ניסויים בבעלי חיים נעשו תחת רישיון משרד בריטניה בית לחבר הפרלמנט האירופי והניסויים שבוצעו אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת יורק בעמידה ביגיע (בעלי החיים המחקר: הדיווח של ניסויי in vivo) הנחיות. (Https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. אסטרטגיה ליצירת מתויגת fluorescently ligands

להלן דוגמא לפרוטוקול subcloning Wnt8a-HA וeGFP לpCS2, על מנת לייצר במסגרת היתוך לבנות Wnta-HA-eGFP:

  1. PCR תגובות להקים ולהפעיל לWnt8a-HA וeGFP. השתמש במידע פריימר מוצג בטבלת 1 ותנאי תגובת דוגמא PCR והדוגמא PCR מוצגים בטבלה 2. הערה: תבנית ה- DNA ישתנה בהתאם למבנה שיופקו, בדוגמא זו, Wnt8a-HA משמש כתבנית ה- DNA.
  2. לנקות PCR תגובות באמצעות ערכת חילוץ ג'ל, לבצע elution הסופי ב 30μl מים כיתה מולקולריים.
  3. בדוק 2 μl של מוצר ה- PCR על 1% agarose ג'ל הערוך טה.
  4. תקציר מוצרי eGFP PCR Wnt8a-HA וpCS2 באמצעות אנזימי ההגבלה המתאימים (ראו טבלה 1), שהוקמו תגובות כפי שמתוארים בטבלה 2 (מוצר לדוגמא PCR לעכל).
  5. דגירה תגובות במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לאחסן מוצרי Wnt8a-HA וGFP PCR על קרח.
  6. להוסיף 1μl של phosphatase עגל אלקליין מעיים (CAIP) לpCS2 לעכל ודגירה של 6 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  7. חום להשבית CAIP ידי דוגרים במשך 15 דקות על 65 מעלות צלזיוס.
  8. הפעלת pCS2 וPCR מעכלים על ג'ל agarose ultrapure 1% מוכנים בטה.
  9. תמצית ג'ל ולנקות את מוצרי pCS2 וPCR באמצעות ערכת חילוץ ג'ל, לבצע elution הסופי ב30μl של מים כיתה מולקולריים.
  10. הגדר את קשירה כפי שמתואר בטבלה 2 (קשירת T4 דוגמא) ולדגור על 12 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.

2. mRNA סינתזה: יצירת Template

  1. לייצר תבניות באמצעות עיכול אנזים הגבלה של פלסמידים הבאים (כל בpCS2 וקטור הביטוי): הקרום-Cerulean, קרום-RFP (memCerulean) (memRFP), ששש-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP.
    1. הגבלה להגדיר מעכלת כפי שמתואר בטבלה 2 (תבנית דוגמא לעכל).
    2. מערבבים בעדינות ודגירת התגובות לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. הפעל 2.5 μl של פלסמיד מתעכל על 1% agarose ג'ל (טה) כדי לבדוק שהתגובה קיצצה להשלמה.
  3. לנקות את מעכל באמצעות ערכת חילוץ ג'ל, לבצע elution הסופי ב -50 μl מים כיתה מולקולריים.

3. mRNA סינתזה: בתמלול חוץ גופית

  1. לסנתז mRNA הפונקציונלי באמצעות ערכת שעתוק SP6 mRNA. להרכיב את התגובות בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge החופשי DNAse / RNAse.
  2. הגדר את תגובות שעתוק mRNA כפי שמתואר בטבלה 2 (סינתזת דוגמא mRNA).
  3. מערבביםתגובות בעדינות עם טפטפת ואז לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
  4. בדוק 1 μl של התגובה על 2% agarose ג'ל (טה).
  5. הוסף 1 μl של DNAse לתגובה, מערבב בעדינות עם P20 ודגירת התגובה לדקות 15 נוספות על 37 מעלות צלזיוס.
  6. להוסיף 340 μl מים כיתה מולקולריים, 40 μl של אמוניום אצטט ו -400 μl של פנול, כלורופורם לתגובה. מערבולת התגובות במשך 30 שניות.
  7. ספין mRNA ל5 דקות, 14,000 XG, 4 מעלות צלזיוס.
  8. פיפטה העליונה השכבה (מימית) מכל תגובה שתזיז אותו ל1.5 מיליליטר טרי לדפוק צינור microcentrifuge הכובע.
  9. הוסף נפח שווה של כלורופורם לכל אחד מהתגובות יצק. מערבולת הדגימות למשך 30 שניות.
  10. ספין mRNA ל5 דקות, 14,000 XG, 4 מעלות צלזיוס
  11. פיפטה את השכבה מימית העליונה מכל תגובה שתזיז אותו לצינור microcentrifuge טרי 1.5 מיליליטר כובע בורג.
  12. להוסיף נפח שווה של isopropanol לכל אחד מהתגובות ולזרז את מרNA ב -80 ° C למשך 30 דקות.
  13. ספין כל אחת מהתגובות במשך 15 דקות ב 14,000 XG, 4 ° C עד גלולה mRNA
  14. הסר את הטיפול לוקח supernatant לא להפריע mRNA pelleted
  15. הוסף 200 μl של 70% אתנול לכל אחד מהתגובות, התגובות לערבב ולאחר מכן לסובב במשך 10 דקות ב 14,000 XG, 4 מעלות צלזיוס.
  16. הסר את הטיפול לוקח אתנול שלא להפריע את ה- mRNA, לייבש את גלולה בטמפרטורת חדר באמצעות ייבוש ואקום או מהירות-VAC.
  17. להשעות מחדש mRNA ב10-20 μl מים כיתה מולקולריים. ספין בקצרה ולשמור על דגימות קרח. הערה: חימום המדגם 80 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 יכול לעזור לו להתמוסס.
  18. הפעל 1μl של mRNA על 2% agarose ג'ל (טה) ולנתח 1.2 μl על ספקטרופוטומטר כדי לקבל קריאת נתונים מדויקות של ריכוז.
    שלב קריטי: ריכוז של 400 ng / μl של mRNA הסינתטי נדרש לבצע את הניסויים הבאים.
    שלב קריטי: אם היחס 260/280 הואמחוץ לטווח של 2.00-2.20, או הסכום הכולל של mRNA עולה על 12 מיקרוגרם, לבצע משקעים כלוריד ליתיום.
  19. חנות ה- mRNA בaliquots μl 1 ב -80 מעלות צלזיוס. השתמש aliquots ואז לזרוק; לא מחדש הקפאת mRNA.

4. יצירת Xenopus laevis עוברים

  1. ראש Xenopus laevis נקבות על ידי הזרקה תת עורית עם 50 יחידות של הורמון גונדוטרופין כוריוני האנושי (HCG; Chorulon) בשבוע שלפני הניסוי.
  2. לגרום Xenopus laevis נקבות בלילה שלפני הניסוי על ידי הזרקת 250 יחידות של HCG ודוגר אותם בחושך, O / N ב 19 מעלות צלזיוס.
  3. לנתח את אשכים מצפרדע euthanised זכר והחנות ב1xNAM על 4 מעלות צלזיוס. הערה: צפרדע זכר היא euthanised ידי הרדמה מסוף בהתאם ללוח זמנים של 1 בעלי חיים (הליכים מדעיים) חוק 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. נקבת עיסוי Xenopus laevis לגרום לביוץ, לאסוף להביצי id בצלחת פטרי עגול 55 מ"מ קוטר.
  5. לייצר השעיה זרע על ידי ריסוק ¼ של אשך laevis Xenopus ב 1 מיליליטר של מים deionised.
  6. מברשת Xenopus ביציות עם זרע ההשעיה מרוסקת באמצעות הנורה פיפטה ופיפטה פסטר שלב קריטי:. בצע תגובות הפריה בכ 16:30 ביום של הניסוי.
  7. עוברי תרבות ב 21 מעלות צלזיוס ב נאמו / 10 (ראו טבלה 3 לפתרונות) בצלחות פטרי 55 מ"מ מצופים agarose 1% מדוללים במים (מים).
  8. עוברי דה-ג'לי לאחר 45 דקות באמצעות ציסטאין / HCL (לוח 3). הערה: בגיל 21 מעלות צלזיוס, עוברים יגיעו שלב 2 תאים לאחר 90 דק 'ולדבוק בכל 20 דקות אחרי זה.

5. microinjecting צפרדעים עוברים

  1. שימוש בנימי X 1 90mm זכוכית וחולץ micropipette הזכוכית כפול בשלב Narishige PC-10, למשוך micropipettes לזריקות. התאם את הגדרות אמפירית כדי להשיג קצה קנס (diame מיקרון פחות מאחדter).
  2. צרף micropipette (מחט) לmicroinjector גז (למשל, באוניברסיטת הרווארד Appartaus PLI-100 PICO-המזרק) כדי לספק כמויות מדויקות של נוזל שוב ושוב על ידי הפעלת לחץ מוסדר לתקופה שנקבעה באופן דיגיטלי של זמן. התאם את הלחץ פנאומטי לספק נפח של 1.25-10 nanolitres כפי שנקבע באמצעות שקופיות reticle או כיול.
  3. מעיל צלחת פטרי 55 מ"מ עם 5 מיליליטר של 1% agarose (מים). חותך מרובע 35-35 מ"מ של agarose מתוך הצלחת, זה יספק משטח יציב לmicroinject עוברים.
  4. העברה עובר לNAM / 3 + Ficoll (לוח 3) ולעבור לצלחת הזרקה.
  5. הזרק עוברים בחצי כדור בעלי החיים ברגע שהם מגיעים לשלב הנדרש לניסוי.
    1. כדי לנתח את ההפצה של ligands GFP מתויג על פני התא, להזריק את העוברים דו-רוחבי בשני שלבי תא, 10nl לכל תא. דילולים הדוגמא mRNA שמוצגים להלן לWnt8a-HA-eGFP. שלב קריטי: ודא שכל mRNA ריכוזי stאמנות ב 400 ng / μl.
      הערה: כמות ה- mRNA להיות מוזרקת צריכה להיקבע באופן אמפירי על ידי בדיקת ריכוזים ולמצוא את הסכום המינימאלי הדרוש כדי להמחיש את יגנד הניאון. מערבי סופג באמצעות נוגדן אנטי HA הוא צעד חיוני כדי לקבוע שmRNAs מתורגמים לרמות דומות על מנת לאפשר ההשוואה של שני הליגנדים מתויגים fluorescently שונים; יש לנו עשינו את זה לWnt8a-HA-eGFP וWnt11b-HA-eGFP בFellgett et al., 2015.
      הערה: כאשר בוחן את ההשפעה של mRNA מוזרק (קידוד כגון אחד לרגולטור מועמד), שליטה טיפוסית היא להזריק RNA שאינו פעיל, כגון LacZ, לעוברי אחים כדי לשלוט על כל השפעות של נוסף תמלילים בעובר.
      1. לדלל memRFP mRNA 1 ב 4 (1μl + 3μl DH 2 O) עם מים כיתה מולקולריים כדי להפחית את הריכוז עד 100 ng / μl.
      2. לדלל Wnt8a-HA-eGFP mRNA 1 ב 4 (1μl + 3μl dH2 O) עם מים כיתה מולקולריים כדי להפחית את הריכוז עד 100 ng / μl.
      3. מערבבים memRFP mRNA ביחס של 1: 1 עם Wnt8a-HA-eGFP mRNA.
      4. מערבבים mRNA מ5.5.1.3 ביחס של 1: 1 עם או השליטה mRNA LacZ או מאפנן כגון Sulf1.
      5. הזרק עוברים בילטרלי בשלב 2 תא עם 10nl של mRNA לכל תא (כוללת של 20nl). הערה: התוצאה 250 pg של RFP מ ', 250 עמ' של ה- GFP דואר Wnt8a-HA-, 500 עמ 'של Wnt11b-HA- GFP דואר ו -2 ng של LacZ או Sulf1 mRNA שהוזרק לתוך כל תא.
    2. כדי לנתח את הדיפוזיה של ה- GFP מתויגת ligands, להזריק mRNA קידוד ליגנד-GFP יחד עם סמן שושלת כגון memRFP בשלב 16-32 התא, 1.25 NL לכל תא.
    3. כדי לנתח את ההשפעות של כל מאפנן פוטנציאל של דיפוזיה יגנד, שיתוף להזריק mRNA קידוד למאפנן יחד עם נותב ליגנד ושושלת. לחלופין, להזריק תאים שכנים: אחד עם mRNAs קידוד לligan GFP מתויגד ונותב שושלת (memRFP) והשני עם mRNAs קידוד למאפנן ונותב שונה שושלת (memCerulean).
  6. העברה עובר לחממת 12.5 מעלות צלזיוס ותרבות עד ליום הבא, שלב Nieuwkoop ופאבר (NF) 8.

6. Explants קאפ בעלי החיים מוציאים

  1. העברה עובר לצלחות פטרי 55 מ"מ מצופות עם 5 מיליליטר של 1% agarose (מים). מלא את הצלחת עם NAM / 2 (לוח 3).
  2. קח כובעי בעלי חיים מעגליים באמצעות מחטי טונגסטן שלב קריטי:. קח כובעים גדולים בשלב זה כמו אלה לרפא טובים יותר וקלים יותר לתמונה, לשמור כובעי שליטה כדי להבטיח שאין הרחבה מתכנס מתרחשת.
  3. העבר את explants בעלי החיים עד 55 מ"מ צלחות פטרי מצופים agarose 1% (מים) ועוברי התרבות ב 21 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות שלב קריטי:. הדגירה 4 שעות נדרש כדי לאפשר חלבוני ניאון להתבגר.
  4. צור שקופיות הקלה על ידי דבק במורד שתי שכבות של insulatio PVCקלטת n על גבי שקופיות מיקרוסקופ. חותך 14 מ"מ ב -10 מ"מ מלבן מתוך הקלטת לעזוב קאמרי להרכבת כובעי חיה שלב קריטי:. שטחו שני השכבות של סרט ביסודיות לשקופית לפני חיתוך המלבן.
  5. פיפטה 2 טיפות נפרדות של NAM / 2 (לוח 3) לשקופית ההקלה, כ -30 μl לכל טיפה.
  6. העבר את explants בעלי החיים לשקופיות ההקלה באמצעות קצה P20 מנותק ולהתמצא כך שצד הפסגה פונה כלפי מעלה. הערה: כל שקופית יכולה להחזיק 10-15 כובעי חיה שלב קריטי:. בשלב זה כובעי בעלי החיים צריכים נרפאו באופן חלקי, זה אומר שהם פחות עדינים ויכולים להיות מכוון באמצעות מלקחיים.
  7. בעדינות להוריד להחליק את מכסה זכוכית לשקופית ההקלה ולאפשר להחליק את המכסה להתייבש במשך 20 דקות שלב קריטי: הגודל של כובע בעלי החיים הוא קריטי;. להבטיח את הכובע הוא גדול מספיק שכאשר coverslip הזכוכית הוא הוריד לשקופית ההקלה הוא דוחס את שכבת הפסגה של תאי כובע חיה מספיק ליחסי ציבורoduce משטח שטוח לתמונה. אם כובעי החיה קטנים מדי עדיין לאחר מכן להפחית את סרט PVC לשכבה אחת.
  8. חותם את השקופית באמצעות מסמר לכה שלב קריטי:. אל תשתמש יותר מדי לכה מסמר לאטום את שקופיות ההקלה, כי אם סרט PVC הופך מדי לח זה יעלה למעלה ולהרוס את השקופית.
  9. שקופיות הקלה יבשים במשך 20 דקות בחושך והם מוכנים לתמונה, בדרך כלל כובעי בעלי חיים יישארו בריאים במשך 4-6 שעות אטומות פעם אחת בשקופית.

7. הדמיה

שים לב: ההדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך. מצב Lambda נבחר להדמיה כמו זה אפשר fluorophores מרובה עם חופף חתימות לשימוש, והסיר את הבעיה של תנועת מדגם פוטנציאלית בין סריקות.

  1. מצא את explants באמצעות מטרה בהגדלה נמוכה ולאחר מכן לעבור ל63x / 1.4 מטרת נפט להדמיה ברזולוציה גבוהה יותר.
  2. לעבור על לייזרים הנדרשים; למשל זה 405לייזר שימש לרגש memCerulean, לייזר 488 שימש לרגש GFP והליזר 561 לרגש memRFP באמצעות 405 והמראות dichroic 488/561.
  3. מצב מבדה השימוש (בשנת 2011 מצב מבדה זן, בחר - 32 פחים).
  4. בחר 405nm, 488nm ו561nm lasers.To להתיר שדה רחב יותר של תצוגה, להקטין את תצוגת התמונה (ל0.6x).
  5. הגדר את גודל המסגרת לגודל התמונה הרצוי (1024 x 1024 עם גדלי פיקסל של 220nm שימש למערך נתונים זה).
  6. הגדר ממוצע לבדרך כלל 4 עד 8 להגדיל את יחס האות לרעש.
  7. ייעל (היחידה האוורירית 1 בהתאם לליזר 561nm שימש למערך נתונים זה) חריר.
  8. ייעל את סמכויות לייזר שלב קריטי:. אזן לייזרי 405nm, 488nm ו561nm כך שכל fluorophores ניתן לאתר באמצעות המערך של 32 גלאים תוך מזעור כמות המתח ורווח הנדרש.
  9. לאסוף את בן האור הנפלט מmemCerulean, GFP וmemRFP. לאור העבודה זו נאספה כל ~10nm מ415-720nm, למרות שמרווחי אוסף גדולים גם אפשריים (למשל., כל ~ 20 ננומטר).

ניתוח 8. תמונה

  1. חוקר את ההשפעות של מאפננים על הביטוי פני התא של ligands מתויג GFP
    הערה: השלבים הבאים הם מדריך מפורט של איך הניתוח בוצע במעבדה שלנו. משתמש הקצה יכול רוצה לייעל את התהליך על ידי כתיבת תסריט ImageJ או פיג 'י להסיר חלק מהפעולות באופן הידני.
    שלב קריטי: חשוב דגימות משתמש קצה הספקטרום של כל fluorophores משמשת באותם תנאים שהניסוי הסופי מתבצע על מנת Perf ORM unmixing רפאים היעיל של fluorophores המרובים המשמש בניסוי הסופי.
    שני סוגים עיקריים של ניתוח מבוצעים בסעיף זה:
    1. חישוב המספר הכולל של Wnt-HA-eGFP שיתוף localising פיקסלים עם קרום התא.
      1. Unmix הירוק,ערוצים אדומים ותכלת באמצעות ספקטרום נדגמו מזריקות יחידה של fluorophores אלה בתוכנת ZEN. לשמור תמונות אלה כמסמכי LSM נפרדים לשימוש בכל השלבים הבאים.
      2. LSM לפתוח קבצים ישירות בתוכנה לעריכת תמונות. הערה: ההוראות הבאות לתמונת ג 'פיג'י
      3. שמור את תמונות LSM כמו מסמכי רצף תמונה, זה יהיה באופן אוטומטי לפצל את התמונות לתוך הערוצים נפרדים.
      4. שמור את התמונה ברצף לאותה התיקייה כמו סקריפטים לתוכנת ניתוח התסריט שישמש כדי לנתח את הנתונים (ראו קבצי קוד נוספים לתסריט בפועל). הערה: ההוראות הבאות לMatlab.
      5. פתח את תוכנת ניתוח תסריט ולפתוח את הספרייה שבה התסריטים נכתבים.
      6. הזן את שם הקובץ תחת ניתוח מיקום, התוכנה תיקח את שם הקובץ ולבצע את הניתוח.
        הערה: שמות הקבצים יהיו לקרוא ImageA0000 וImageA0001 עבור כל הר"יGE. תוכנת ניתוח תסריט להשתמש בתמונה מסומנת 0001 כמסכה ולנתח את אחוז הפיקסלים בתמונה 0000 שישתף למקם עם מסכה זו.
      7. קח את מספר שיתוף לוקליזציה אחוז (מבואר כתא קרום המאוכלס) ולהעתיק את זה לגיליון אלקטרוני. הערה: ההוראות הבאות עבור Excel.
      8. עלילה מספר שיתוף לוקליזציה אחוז בתרשים בר או כערך מוחלט או היחסים.
    2. ניתוח המספר, הגודל וצורה של puncta Wnt-HA-eGFP.
      1. LSM הצרוף לפתוח קבצים ישירות בתוכנה לעריכת תמונות. הערה: ההוראות הבאות לתמונת ג 'פיג'י
      2. פיצול כל תמונה לתוך הערוצים נפרדים שלה (> צבע ערוצי תמונה> פיצול).
      3. סף שני Wnt-HA-eGFP וערוצי סמן קרום שלב קריטי (תמונה> התאם> Auto-סף):. נסה מספר הספים כדי לראות איזה מן מייצר תמונה מייצגת, ללא overexposingהערוץ.
      4. המרת ערוץ סמן הקרום למסכה (תהליך> ינארי> הפוך מסכה).
      5. הפוך את המסכה הזאת (Edit> היפוך).
      6. המרת puncta Wnt-HA-eGFP למסכה כאמור לעיל.
      7. הפחת את מסכת סמן קרום ממסכת יגנד-GFP (התהליך> מחשבון תמונה> מסכת Wnt בתיבה עליונה, מסכת קרום בתיבה למטה).
      8. השתמש בפונקציה לנתח חלקיקים. מכאן, בחר את הפרמטרים הנדרשים ולנתח את הנתונים (חלקיקי Analyse> Analyse).
      9. העתק את מספר החלקיקים, חלקיקים בגודל ממוצע ונתונים מעגליים לתוך גיליון אלקטרוני ולאחר מכן לתכנן גרפים מנתונים אלה. הערה: בניתוח זה, רק חלקיקים בין 0.1-10μm 2 גודל נותח, לא הוטלו מגבלות על המעגליות חלקיקים. הוראה זו היא עבור Excel.
  2. ניתוח מגוון של דיפוזיה יגנד
    1. פתח את כל התמונות צרוף בim confocalהזדקנות תוכנה ולאחר מכן לייצא את הקבצים בפורמט TIF, כנתונים גולמיים וכתמונת RGB הערה:.. הוראה זו היא לייט זן 2011 שלב קריטי: כוללת בר בקנה מידה על לפחות אחד מהתמונות כל כך מרחק שיכול להיות מחושב במהלך הניתוח.
    2. פתח את התמונות כדי להיות מנותחות בתוכנת ניתוח תמונה. הערה: ההוראות הבאות לפוטושופ 8.2.3) לחצו לחיצה ימנית על הרקע של התמונה ובחר 'שכבה מהרקע ", כדי ליצור שכבה חדשה..
    3. הגדר את ערוצי סמן קרום 0, כך שרק ערוץ יגנד-GFP גלוי (Layer> שכבת התאמה חדשה> מיקסר ערוץ) שלב קריטי:. קליפ שכבת ההתאמה החדשה לתמונה להיות מנותחות, האפשרות לקליפ השכבה החדשה לתמונה זו זמינה כתיבת סימון לאחר לחיצה על אפשרות מערבל ערוץ.
    4. פתח סביבת עבודה חדשה. הגדר את הרזולוציה ל -300 פיקסלים לאינץ 'ומצב הצבע לצבע RGB (קובץ>חדש> לוח).
    5. העתק את כל התמונות שנתחו לסביבת העבודה אחת (לחץ על התמונה וזה נחתך מערבל ערוץ על ידי החזקת שליטה אז תחזיק בשליטה וAlt ולגרור את התמונה לתוך סביבת העבודה).
    6. להתמצא את כל התמונות כדי שהאורך המרבי של דיפוזיה לכל תמונה ניתן למדוד לאורך הציר האופקי, עם התאים לבטא Wnt-HA-eGFP חוקיים לשמאל.
    7. שמור את מרחב העבודה כTIF ולאחר מכן פתח את זה בתוכנת ניתוח תמונה. הערה: ההוראות הבאות לתמונת ג 'פיג'י
    8. פתח את חלון מנהל ROI (לנתח> כלים> מנהל ROI).
    9. לצייר מלבן על התמונה הראשונה, ניתן לציין את גודל המלבן המדויק (כלי מלבן בחירה ולצייר כל מלבן> ערוך> בחירה> ציין). הערה: גודל של 650 x 100 פיקסלים רוחב x האורך שימש במחקר זה.
    10. מקם את המלבן על הקצה מאוד של תחום המבטא WNT-HA-eGFP. מניחים את המלבן על האזור עם המרחק המקסימאלי של דיפוזיה Wnt-HA-eGFP. שלב קריטי: גם ללא סמן קרום האזורים להביע GFP דואר Wnt-HA- צריך להיות גלויים בשל הקרינה רקע; אם לא אז להתייעץ תמונות גולמיות.
    11. Shift התיבה 10 מיקרומטר לימין. לקבוע את מספר מיקרומטר על ידי מדידת אורכו של סרגל קנה המידה כלול באחת התמונות (צייר קו התחקות סרגל קנה המידה בקנה מידה> להגדיר Analyse>). הערה: זה מספק ערך עבור 10 אום בפיקסלים.
    12. הוסף את התיבה למנהל את ההחזר על ההשקעה על ידי לחיצה על כפתור הוספה בחלון מנהל החזר על השקעה.
    13. מלבן לעבור לתמונה הבאה שנמדד על-ידי לחיצה על גב כלי המלבן כדי להזיז את המלבן. חזור על שלבים 8.2.10-11.
    14. ברגע שכל הלוחות נמדדו, multiplot בחר מתפריט מנהל ROI (החזר על השקעה מנהל> עוד> Multiplot> רשימה).
      הערה: הנתונים מייצגים inte פיקסל Wntnsity (Y) עם מרחק הגדלת לאורך הציר האופקי (X, שנמדד בפיקסלים). הערך עבור Y הוא עוצמת האות הממוצעת של יגנד-GFP בנקודת X והממוצע מחושב מכל הפיקסלים בציר Y עבור כל ערך X. כתוצאה מכך גבוה התיבה, יותר פיקסלים ינותחו כדי לייצר ממוצע זה. קופסא קטנה (בציר Y) תהיה רועשת יותר; תיבה גבוהה תהיה עוצמת פיקסל ממוצעת נמוכה מאוד.
    15. להעתיק את הנתונים מתיבת multiplot לתוך גיליון אלקטרוני ומחדש תווית בהתאם. הערה: ההוראות הבאות עבור Excel.
    16. מחק את 10-20μm הראשון של נתונים מכל ניתוח כמו זה מייצג הקרינה רקע מהתאים לבטא יגנד-GFP ומעוות את הגרפים.
    17. פתח את ניתוח וגרפי תוכנה מדעית וליצור מחברת חדשה. הערה: ההוראות הבאות לSigmaPlot 13.
    18. תווית המספר הנדרש של עמודות לנתונים על ידי לחיצה כפולה על המספרים אופקיים on גיליון העבודה ותיוגם מרחק במיקרומטר, Wnt8a-HA-eGFP וWnt11b-HA-eGFP.
    19. להעתיק נתונים מהגיליון האלקטרוני לעמודים הרלוונטיים בניתוח וגרפי התוכנה המדעית.
    20. צור גרף פיזור (צור גרף> פיזור> פיזור מרובה> רב Y X בחר> בחר את עמודת המרחק לX> Wnt8a-HA-eGFP בחר וWnt11b-HA-eGFP לערכי Y> סיום).
    21. ביצוע ניתוח רגרסיה על עקומת Wnt8a-HA-eGFP על ידי לחיצה השמאלית על נקודת Wnt8a-HA-eGFP על גרף הפיזור. כל הנקודות צריכים להדגיש. לחץ על ניתוח> אשף רגרסיה.
    22. בחר הקטגוריה המשוואה העקומה (דעיכה מעריכית) ושם המשוואה (הבית, 3 פרמטר) ולאחר מכן לחץ על הבא.
    23. בחר את ערכי X ו- Y שהעקומה צריכה להיות מצוידת (אם הנתונים היה מסומן בעבר, זה צריך להיעשות באופן אוטומטי) ולאחר מכן לחץ על הבא.
    24. המשך דרך האשף עד אפשרות הפלט המספריהדף של, להבטיח 'צור דוח' מסומנת ולאחר מכן לחץ על הבא. הערה: הפרמטרים לעקומה המצויד יוצגו בדוח 1 *.
    25. בדף אפשרויות גרף להבטיח 'להוסיף משוואת גרף הכותרת' מסומנת ולאחר מכן לחץ על סיום. הערה: האשף יצר 1 דוח * וגרף 1 * כרטיסיות בחלק העליון של ספר לב. בנוסף העקומה תהיה נוספה לגרף מיוצר ב( 8.2.20).
    26. חזור על שלבים 8.2.21-8.2.25 להתאים עקומה לWnt11b-HA-eGFP שלב קריטי:. לנסות קטגוריות הולמת מרובות משוואה ושמות משוואה לנתונים. הערה: העקומה עם הכושר הטוב ביותר צריכה לייצר ערך R 2 הגבוה ביותר עם ​​הסכום הנמוך ביותר שיורית של ריבועים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח confocal של explants כובע בעלי החיים לבטא חלבונים מתויגים fluorescently מספק מערכת יעילה המאפשר הדמיה הפצת יגנד תחת תנאי ניסוי שונים. בדוגמא אחת, ההפצה של ה- GFP מתויגת שישה מוצגים (איור 1). בשלב 2-התא, עוברי צפרדעים מוזרקים לשני התאים עם או עם mRNA שליטה או עם mRNA הקידוד לSulf1, אנזים שמשנה סולפט heparan פני תא ומשפיע על השיפוע מורפוגן ששש 16. עוברים אלה בתרבית עד שלב 32 תא ותא בודד הוא עם mRNAs קידוד לשש-GFP וmemRFP (כנותב שושלת) מוזרק שיתוף. זה יוצר שיבוט של תאים לבטא שש-GFP שמסומן בRFP קשור קרום תא. בשלב blastula, explants כובע בעלי החיים נלקחים לניתוח על ידי מיקרוסקופ confocal. איור 1 מראה שבתנאי בקרה, ששש-GFP מופרש ומפזר מחוץ מחדשגיון להביע mRNAs המוזרק. עם זאת, בנוכחות Sulf1, ששש-GFP הוא מוגבל יותר בהפצה שלה ו, במדגם זה, לא זוהה מחוץ לשיבוט של תאים לייצר אותו. ההשפעות של Sulf1 על הפצה ששש-GFP כבר ניתחו באופן מלא יותר 16.

כאשר באו לידי ביטוי בעוברי צפרדעים, מתויג fluorescently ligands Wnt מופרש, מצטבר על קרום התא, ולפזר על פני השדה של תאים. באיור 2, אנחנו לאפיין את תכונות quantitaive ואיכותיות של שני שונים fluorecently מתויג ligands Wnt בתאים המוזרקים ומבטא את החלבונים. איור 2 א-H מציג דוגמאות של איך Wnt8a וWnt11b-HA-eGFP לצבור על הממברנה של תאי כובע בעלי החיים . על ידי השוואת 2B פנלים ו2F ברור שWnt8a-HA-eGFP מצטבר בצורה יעילה יותר על קרום התא מאשר Wnt11b-HA-eGFP. מידע כמותי כבר חולץ מתמונות confocal באמצעות combination של תמונה ותוכנת ניתוח תסריט (קובץ קוד משלים). איור ט 2 מראה את הצטברותם היחסית של Wnt8a-HA-eGFP על קרום התא בהשוואה לWnt11b-HA-eGFP. הנתונים הושגו באמצעות תסריט מחשב הקובע את המספר הכולל של Wnt-HA-eGFP שיתוף localising פיקסלים עם פיקסלים קרום תא בכל תמונה. בגישה אחרת, המספר הכולל של puncta Wnt-HA-eGFP כי שיתוף למקם עם קרום התא נספרים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (איור י 2). מידע איכותי על הגודל והצורה של puncta הבודד יכול להיות גם שחולץ מן הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. בנוסף לפחות Wnt11b-HA-eGFP puncta שיתוף localising עם קרום התא (איור י 2) puncta אלה יש גם גודל ממוצע קטן יותר puncta Wnt8a-HA-eGFP (איור 2K). יתר על כן, יש לי puncta Wnt11b-HA-eGFP מעגלי מופחת בהשוואה לpuncta Wnt8a-HA-eGFP (איור 2L). Circularity הוא מדד של כמה הדוק אובייקט דומה עיגול מושלם, עם 1 מייצג עיגול מושלם ו-0.1 צורה שאינה מעגלית מוארכת. גישה זו יכולה לשמש כדי לבדוק כל מועמד רגולטור של דיפוזיה יגנד Wnt. כדי לעשות זאת, צריך להיות מוזרקים תאי שליטה עם mRNA שליטת קידוד לצורה פעילה של רגולטור המועמד או חלבון לא רלוונטי, כגון בטא-galactosidase (lacZ); זה מספק שליטה תקפה יותר פשוט לא הזרקת הרגולטור. הנתונים בדוגמאות אלה נותחו באמצעות המבחן הלא פרמטרית Mann-Whitney U 18-19. תכנית ניתוח סטטיסטית שימשה לביצוע הבדיקה.

באיור 3, אנו חוקרים דיפוזיה יגנד Wnt. Blastomere אחת הוזרק בשלב 4 התאים כך שexplants כובע בעלי החיים מייצג בתחום של תאים שבו רק חלק מהתאים להביע או Wnt8a-HA-eGFP או Wnt11b-HA-eGFP. על ידי הכללה נותב שושלת תא, אנחנו יכולים לזהות expressing לעומת להביע תאים שאינם וזה מאפשר מגוון של Wnt8a-HA-eGFP ודיפוזיה יגנד Wnt11b-HA-eGFP מתאי המקור להיות מנותח (איור 3 ו3C). בשל העקמומיות של explants כובע בעלי החיים, המרחק המרבי שניתן למדוד באופן מהימן באמצעות assay זה היה 160μm, שלא היה מספיק כדי למדוד את המרחק המוחלט של דיפוזיה יגנד. עם זאת, על ידי שימוש בשילוב של ניתוח confocal, ניתוח תמונה וניתוח מדעי וגרפי תוכנה את הצורה הכללית של השיפוע מורפוגן Wnt-HA-eGFP יכולה להיות מנותחת (איור 3D). מידע זה יכול לשמש כדי לחקור האם overexpressing חלבון אחר יחד עם ligands מתויג באותו התאים יכול להשפיע על הפרשה או דיפוזיה Wnt. בסוג אחר של ניסוי (איור 3E-י 3) ההשפעות של רגולטור פוטנציאלי בקבלת תאים ניתן למדוד על ידי overexpressing חלבון המועמד בשיבוטים של תאים סמוכים לתאים לשעברלחיצת Wnt8a או Wnt11b-HA-eGFP. זה מאפשר לכל השפעות חד-תאים אוטונומיים של הרגולטור על דיפוזיה יגנד Wnt-HA-eGFP להיבדק. עולה בקנה אחד עם איור 2, יכול להיות מזוהה יותר Wnt8a-HA-eGFP לשדר מתאים מאשר Wnt11b-HA-eGFP בשני ניסויי דיפוזיה.

הסוגים של ניסויים שתוארו במאמר זה נעשו שימוש כדי לנתח את ההשפעה של Sulf1 שבשישה וWnt איתות 16,17.

איור 1
אפנון איור 1. הפצה ששש-GFP יכול להיות מזוהה על ידי ניתוח confocal של כובעי בעלי חיים צפרדעים. (א) קריקטורה המתארת ​​assay הניסיוני שבו עוברים מוזרקים ראשון עם mRNA הקידוד לSulf1 או mRNA שליטה, אותו הם עובר לאחר מכן הזריקו בשלב 32-התא עם mRNA קידוד לשישה-GFP לתא יחיד. (BC) explant כובע בעלי החייםים נלקחו בשלב 8 וצלם לאחר 4 שעות. תמונות מוצגות בקצה שיבוט להביע שש-GFP + memRFP של תאים. בעוברי שליטה (ב '), ששש-GFP מופץ מהשיבוט memRFP המסומן של תאי אות ייצור. בעוברים להביע Sulf1 (C), ששש-GFP מוגבל יותר בהפצה שלה, רואה 16. memRFP מוצג בהמגנט וששש-GFP בירוק. ברים סולם מייצגים 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. כמותי וניתוח איכותי של puncta Wnt8a וWnt11b-HA-eGFP על קרום התא. (AH) עוברים היו microinjected דו-רוחבי עם mRNA קידוד memRFP (500 עמ ') לאונת בעלי החיים בשלב שני תא. בנוסף עוברים הוזרקו מר קידוד NA (AD) Wnt8a-HA-eGFP (500 עמ ') או [EH] Wnt11b-HA-eGFP (1ng). העוברים גם הוזרקו קידוד mRNA לLacZ לספק שליטה על mRNA / חלבון נוסף בעת ניתוח ההשפעות של כל רגולטור פוטנציאלי. קופסות הלבנות ב( ג) ו- (ז) לסמן את האזורים מוגדלים בלוחות (ד) ו- (H) בהתאמה. הסכום הכולל הקרינה Wnt-HA-eGFP שיתוף localising עם קרום התא חושב באמצעות תמונה ותוכנת ניתוח תסריט ולאחר מכן מנורמל (I). מידע איכותי הופק באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. Wnt8a וWnt11b-HA-eGFP punctae נותחו למספר חלקיקים (J), גודל חלקיקים (K) ומעגלי חלקיקים (L). מאן-וויטני U (** P <0.01), N = מספר העוברים. memRFP מוצג במגנט, וWnt8a / 11b-HA-GFP מוצג בירוק, ברים בקנה מידה לייצג 20μm."Target =" _ ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. מדידת הטווח של דיפוזיה של fluorescently מתויג ligands Wnt. (א) תרשים המתאר את assay משמש למדידת הפרשה ודיפוזיה Wnt8a וWnt11b-HA-eGFP מתאים לבטא. קידוד mRNA (ב) (BC) memCerulean (600 עמ '), LacZ (4ng) וWnt8a-HA-eGFP (2ng) או memCerulean (600 עמ') (ג), LacZ (4ng) וWnt11b-HA-eGFP (2 ng תרשים) הוזרק לאונת החיה של blastomere אחד בשלב ארבעה תאים. (ד) מגוון של דיפוזיה של Wnt8a-HA-eGFP וWnt11b-HA-eGFP נמדד באמצעות רקע שליטה. (E) המתאר את assay משמש כדי למדוד דיפוזיה Wnt8a וWnt11b-HA-eGFP דרך רקע להביע LacZ, ראה שיטה לDet מציק. (FG) mRNA קידוד memCerulean (600 עמ ') ו- (F ו- H) Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) או (G ואני) Wnt11b-HA-eGFP הוזרק לאונת החיה של blastomere אחד בארבעת תא במה. Blastomere סמוך הוזרק mRNA קידוד memRFP (600 עמ ') וLacZ (4 ng) רואה מפתח לפרטים. (J) מגוון של Wnt8a-HA-eGFP ודיפוזיה Wnt11b-HA-eGFP נמדד באמצעות LacZ רקע להביע. הנתונים היה לכמת וזממו באמצעות ניתוח confocal, ניתוח תמונה וניתוח מדעי ותוכנת גרפים. memCerulean (הכחול (CD) וצהוב (F ו- H)), Wnt-HA-eGFP (ירוק), memRFP (מג'נטה), ברים בקנה מידה מייצגים 20 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי להוריד גרסה גדולה יותר של קובץ זה.

קבצים / ftp_upload / 53,162 / 53162table1.jpg "/>

Primers 1. השולחן משמש לsubclone Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP ושש-GFP לpCS2.

תְגוּבָה רכיבים
דוגמא CS2 + תקציר 1.5 מיקרוגרם של pCS2 +
2 μl של אנזים הגבלת 1
2 μl של הגבלת אנזים 2
5 μl של חיץ אנזים הגבלה (10X)
עשה עד 50 μl עם מים כיתה מולקולריים
סינתזת הדוגמא mRNA 2 μl תבנית linearised
2 μl 10x לערבב TRX Megascript
2 μl 50mm ATP
CTP 50mm 2 μl
UTP 50mm 2 μl
2 μl 5 מ"מ GTP
2.5 μl 40mm שווי האנלוגי (m7G (5 ')
תערובת אנזים SP6 2 μl
מים כיתה מולקולרית 3.5 μl
תגובת הדוגמא PCR 0.5 μl DNA פולימרז נאמנות גבוהה (2,000 יחידות / מיליליטר)
תבנית ה- DNA 2 ng
2.5 μl של קדימה ופריימרים הפוכים (10μM)
0.5μl של dNTPs
5 μl של חיץ ploymerase DNA (10X)
עשה עד 50 μl עם מים כיתה מולקולריים
תנאי הדוגמא PCR denaturation 2 דקות Intial על 98 מעלות צלזיוס
15 שניות 98 מעלות צלזיוס
15 שניות 65 מעלות צלזיוס 30 מחזורים
40 שניות 72 מעלות צלזיוס
סופיות הרחבה 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס
דוגמא מוצר לעכל PCR 28 μl של מוצר ה- PCR
2 μl של דואר הגבלהnzyme 1
2 μl של הגבלת אנזים 2
5 μl של חיץ אנזים הגבלה (10X)
מים כיתה מולקולרית 13 μl
קשירת הדוגמא T4 μl 1 Cut CS2 +
3 μl מוצר Cut PCR 1
3 μl Cut PCR מוצר 2
1 μl של האנזים T4 DNA
μl חיץ 1 האנזים T4 DNA (10X)
מים כיתה מולקולרית μl 1
תבנית דוגמא לעכל 5 UG פלסמיד דנ"א
10 חיץ אנזים הגבלת μl (10X)
3 μl Not1 (למעט שש-GFP, Kpn1 משמש)
עשה עד כיתה עם מים מולקולריים 100 μl

תנאי טבלה 2. דוגמא תגובה המשמשים לsubcloning והפקת mRNA הסינתטי לWnt8a-HA-eGFP.

<td>
פִּתָרוֹן רכיבים
ציסטאין-HCL 0.1X NAM
2.5% מונוהידראט L-ציסטאין הידרוכלוריד (pH7.8)
מלחי NAM 110 מ"מ NaCl
2 מ"מ KCl
1 מ"מ CA (NO3) 2
0.1 mM EDTA
NAM / 2 מלחי 0.5x NAM
5 מ"מ HEPES pH7.4
0.25 מ"מ ביקרבונט
25 UG / מיליליטר gentamycin
NAM / 3 + Ficoll מלחי 0.33X NAM
5 מ"מ HEPES pH7.4
0.25 מ"מ ביקרבונט
2 5ug / מיליליטר gentamycin
5% Ficoll
NAM / 10 מלחי 0.1X NAM
5 מ"מ HEPES pH7.4
25 UG / מיליליטר gentamycin

פתרונות 3. שולחן לשימוש בייצור וmicroinjection של קסנומוגלה laevis עובר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חלק חיוני של פרוטוקול זה הוא יצירת ligands הפעיל ביולוגי שבדרך כלל מעובד, מופרש, ומסוגל לעורר תגובה בתא המקבל, למרות שיש מחצית ניאון המצורפת. זה קריטי כדי לקבוע כי מוצר הגן fluorescently- מתויג הוא פעיל ביולוגי באמצעות assay מתאים. לשש-GFP, היכולת להפעיל את הביטוי של ptc1 אושרה 16. יש Wnt8a יכולת להפליא חזקה כדי לגרום לציר משניים כאשר הביע ב20-21 blastomere הגחון אחת, וWnt8a-HA-eGFP הוצג לשמור על פעילות ביולוגית זו. Wnt11b מעכב explants ectodermal Activin טופל מעוברת הרחבה מתכנס 21-22, וWnt11b-HA-eGFP גם שומר הפעילות הביולוגית שלה 17. היכולת של ligands מתויג לעורר תגובות שווה ערך לחלבונים לא מתויגים מצביעה על כך שהמסקנות המבוססות על ניסויים באמצעות ligands הניאון יהיה בדואר רלוונטי לחלבון הנורמלי. התוספת של epitope HA בין יגנד וחלבון פלואורסצנטי הניתנת אזור spacer המאפשר Wnt בונה להיות גם פעיל וניאון.

המגבלה העיקרית של סוג זה של ניתוח היא שזה לא ישירות להודיע ​​על מילויים מורפוגן אנדוגני. לדוגמא, דיפוזיה של שישה על פני השדה של תאים בכובע חיה עלולה שלא לשקף את דרך מהלכים ששש אנדוגני באמצעות האפיתל העצבי עמודים בעובר. עם זאת, את הפשטות של פרוטוקול זה מאפשרת ניסויים שבם ההשפעה של רגולטורים אקסוגניים על חלוקת ligands ניתן לבדוק. התוצאות מגישות אלה יכולים להוות בסיס השערות להיבדק באמצעות תובעני יותר in vivo ניתוחים. לדוגמא, היכולת של Sulf1 הביע-מעל להגביל את ההפצה של שש-GFP באמצעות השיטות שתוארו במאמר זה הצביעה על הפוטנציאל לSulf1 בויסות גראד מורפוגן שששient. זה נבדק באופן ישיר ובאמצעות תוקף antisense morpholino לדפוק למטה של Sulf1 וimmunocytochemistry לדמיין ששש אנדוגני בצינור העצבי 16. שיטה דומה לשלנו נעשתה שימוש כדי לחקור מנגנונים ספציפיים שיכול להסדיר דיפוזיה יגנד. סמית 'ועמיתים הראו שקטרי GFP מתויג (Xnr2) משמשים דיפוזיה פשוטה, ולא תא הרחבות (cytonemes) או transcytosis (באמצעות שלפוחית) כדי ליצור שיפוע 23.

פיתוחים נוספים של שיטות אלה הם אפשריים שבו חלבונים אחרים החוסמים מסלולים מסוימים יכולים לבוא לידי ביטוי בתאים ממוקדים לחקור האם תגובה למולקולת האיתות נדרשת כמתווך כדי להעביר אותות מתא אחד למשנהו. לדוגמא, המבטא קולט Activin שלילי דומיננטי בין המקור של Activin והתאים להגיב הראה כי דיפוזיה יגנד פשוטה יכולה לעורר כמה קטרי תא תגובה מדואר המקורven עם תאים שאינם מגיבים שבבין 24. מסקנה זו נתמכה על ידי עבודה בדג הזברה שבו תאים מסוג בר יכולים להגיב למקור של קטרי, למרות שמוקף בתאים שעברו מוטציה שאינה מגיבים חסרי שיתוף קולט חיוני עבור 25 קטרי. מחקרים אחרים המשמשים דג הזברה לחקור דיפוזיה של ligands מתויג fluorescently 28,29. מחקרים מסוימים הבחינו שepitope תיוג C-הסופית של חלבוני Wnt יכול להשפיע על פעילות איתות, אולי בגלל cysteines השמור ביותר שתורמים לקונפורמציה חלבון. העבודה הקודמת שלנו הראתה שכולל spacer (כגון תג HA) תוצאות בligands Wnt מתויג כי הם פעילים ביולוגיים 17. זה ככל הנראה משום שspacer מספק גמישות הדרושה לאינטראקציה רצפטור ליגנד, כגון במודל אגודל לאצבע של Wnt-frz מחייב 30.

הצעד הבא לקידום המחקרים שלנו הוא לכלול מולקריאת נתוני רע"מ להפעלה של מסלול האיתות. לדוגמא, להביע DVL 26 בתאים רחוקים ממקור יגנד יאפשר הטווח על פני שWnt11b יש יכולת לאותת מתויג GFP להימדד. מגוון של פעילות איתות Wnt8a ניתן לראות באמצעות מכתים נוגדן למדוד לוקליזציה גרעינית של B-קטנין בתאים 27 במרחק מהמקור. ניסויים אלו סוגים אפשריים באמצעות הטכניקות מתוארות במאמר זה. על ידי שימוש במגוון רחב של חלבוני ניאון שונים או fluorophores, רמה נוספת של מידע תסופק בו לא רק מודדת את חלוקת יגנד אבל הפלט גם של מסלולי האיתות, ובדרך זו קביעת טווח הסף מורפוגן .

laevis Xenopus הוא מודל שימושי המאפשר הדמיה ligands מתויג GFP ופרטים נוספים על השיטות לעוברי רכישה, סינתזת mRNA, microinjection ולנתחהיון זמין 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי BBSRC להעניק לחבר הפרלמנט האירופי (BB / H010297 / 1), מלגת לימודי BBSRC מכסה לSAR, ומלגת לימודי MRC ל SWF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Melford MB 1200
Ammonium acetate Ambion From Megascript SP6 Kit AM 1330
Bicarbonate VWR International RC-091
Calcium nitrate Sigma C13961
Cap analog (m7G(5')) Applied Biosystems AM 8050
Chloroform Sigma C 2432
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880
dNTPs Invitrogen 18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma O3690
Ethanol VWR International 20821.33
Ficoll 400 Sigma F 4375
Fiji image J software Free download http://fiji.sc/Fiji
Gentamycin Melford G 0124
Glacial acetic acid Fisher Scientific A/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5  Scientific Laboratory Supplies 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle puller Narishige Narishige PC -10
Glass pull needles Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG) Intervet
Isopropanol Fisher Scientific P/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl) Sigma L-7026
LSM710 and Zen software (2008-2010) Carl Zeiss
Matlab software Mathworks http://uk.mathworks.com/
Molecular grade water  Fisher Scientific BP 2819-10
Nail varnish  Boots Bar code 3600530 373048
Spectrophotometer Lab.tech International ND-1000 / ND8000
Petri dish (55 mm) VWR International 391-0865
Phenol-chloroform Sigma P3803
Photoshop software Adobe http://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers  Biolabs M0530S  Buffer - M0531S
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P/4280/53
PVC insulation tape Onecall SH5006MPK
Gel extraction kit  Qiagen S28704
Restriction enzymes buffers Roche SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAse Promega ME10A
Steel back single edge blades Personna 66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific 27810.364
SP6 transcription kit Ambion AM1330
Glass slides Thermo Fisher SHE 2505
Tris base Invitrogen 15504-020
Tungsten needles homemade
Zen lite software Carl Zeiss Free download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  2. Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
  3. Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
  4. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
  5. Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
  6. Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
  7. Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
  8. Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
  9. Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
  10. Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
  11. Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
  12. Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
  13. Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
  14. Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
  15. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
  16. Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
  17. Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
  18. Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).
  19. Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
  20. Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
  21. Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
  22. Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
  23. Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
  24. McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
  25. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
  26. Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
  27. Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  28. Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
  29. Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
  30. Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
  31. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 106 קיפוד כנפיים GFP RFP ביולוגיה התפתחותית דפוסים ligands המופרש איתות תא
באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A.,… More

Fellgett, S. W., Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Cross, S., O'Toole, P., Pownall, M. E. Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients. J. Vis. Exp. (106), e53162, doi:10.3791/53162 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter