Summary
该手稿这里提供一组简单的用于分析的在爪蟾荧光标记的配体的分泌和扩散的方法。这提供了一个上下文用于测试的其他蛋白质的修改配体分布的能力，并允许实验，可能会给洞察调节形态发生素梯度的机制。
Abstract
这个协议描述了一种方法来可视化分布在细胞的场配位体。表达外源蛋白，用自己的细胞在早期胚胎中大尺寸在一起的易用性，使 非洲爪蟾 的可视化GFP标记的配体的一个有用的模型。的合成mRNAs注射后能有效地转化为早期爪 蟾胚胎 ，和注射剂可以针对单个小区。当与谱系示踪剂组合如膜拴RFP，注入的细胞（和它的后代）所产生的过表达的蛋白质可以容易地遵循。这个协议描述了生产的方法的荧光从注入的mRNA标记的Wnt和Shh配体。该方法涉及英里CRO清扫外胚层植（动物帽）和配体扩散的多个样品中分析。通过使用共焦成像，可以获得关于配体分泌和扩散过的细胞的字段信息。共焦图象的统计分析提供关于配体梯度的形状的量化数据。这些方法可能是有用的研究人员谁想要测试的可能调节形态发生梯度的形状因素的影响。
Introduction
在早期胚胎发育，细胞被逐步致力于遵循分化的特定谱系：这意味着一组全能性（或多潜能）细胞变得逐渐限制到建立确定为产生一种细胞类型的祖细胞群体的。细胞 - 细胞信号传导是至关重要的谱系说明书的胚胎发育过程中的调节。这些信号的操作将被要求直接干细胞向特定的命运，以支持新的医疗方法。
相当一小部分的信号通路的发展过程中重申，包括路径响应TGF超家族（nodals和骨形成蛋白）1-2的FGFs 3，Wnts 4，和刺猬5。这些分泌的蛋白质结合存在于细胞膜，激活的信号转导，从而改变基因的表达和/或细胞行为受体。细胞标志的严格监管阿灵是细胞谱系的规范和正常发展的必要条件。而这些通路中的串扰是在确定细胞命运的重要，一个单一的配位体可以本身引起不同浓度不同的反应。形态发生素梯度被描述在100多年前作为一个理论来解释如何不同类型的细胞可以从细胞中6场获得。信令由一个小区组产生的分子可以扩散在一定范围内，减少在浓度与来自源更大的距离。暴露于信号的细胞将响应的局部浓度在其在电池领域位置，与细胞在不同的位置响应不同，以不同的水平的信号。用于形态发生素的存在的证据来自早期果蝇胚胎7和翼盘 8，以及脊椎动物肢9和神经管10的研究。
方法都需要在vestigate怎么形态发生素梯度成立，并确定在调节这些梯度其他重要分子。使用免疫组织化学来可视化内源性蛋白在体内的不同遗传背景的上下文优雅实验已经用于研究形态发生素梯度11-12然而，好的抗体和特定的突变体不总是可用的，所以我们在这里描述使用爪蟾荧光配体的过表达，是提供一种替代方案中，简单的方法来剖析外源基因产物如何影响跨越细胞的场配位体的分布的协议。 非洲爪蟾提供了一个很好的系统，其胚胎外部发展，使他们在最初阶段访问承接这些类型的实验。他们的大尺寸（直径1-1.5mm）简化了显微注射和手术操作和囊胚阶段的细胞很容易的图像，因为它们仍然是比较大的（约2081，M对面）。在爪蟾表达研究是简单的事：基因注入胚胎早期可以有针对性的特殊细胞，并有效地翻译。
使用PCS2 Wnt8a-HA 13，PCS2 Wnt11b-HA 14和绿色荧光蛋白生成的荧光标记Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP结构。的HA肽是重要的，包括，不仅提供额外的分子标记，而且还因为它被认为是作为一个隔离物分离的Wnt和eGFP的蛋白质允许两个基因产物的功能。用于Shh的可视化的构建体是以前用于产生转基因小鼠表达的Shh-EGFP融合蛋白15;这是好心由安迪·麦克马洪提供。重要的是，对于所有的构建体的GFP标签克隆的3'到信号序列，这样它被处理后保留。它也必须确保最终蛋白质包括所需的修饰序列，例如所述additioÑ脂质作为是亚克隆到被合成mRNA的脾淋巴细胞优化PCS2 +表达载体Shh和Wnt信号ligands.The的cDNA的情况下它包含一个SP6启动子和多聚腺苷酸化信号（http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors）。
这里介绍的工作提供了一个简单的协议，用于比较的分泌和荧光扩散标记的Wnt和Shh标记的配体。通过注入合成的mRNA的确定量，协议会绕开可变表达使用不同启动子的不同向量有关的任何问题。这些方法最近已应用到调查硫酸乙酰肝素endosulfatase Sulf1上的Shh-EGFP和Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP的分泌和扩散在爪蟾16-17的影响。
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Protocol
伦理声明：动物实验在一个英国内政部许可做环保部并进行了实验，符合ARRIVE批准约克大学的伦理委员会：指导原则（动物研究的体内试验报告）。 （https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines）。
1.战略，以便产生荧光标记的配体
下面是一个例子协议亚克隆Wnt8a-HA和eGFP的成PCS2，以便产生以帧为融合构建Wnta-HA-eGFP的：
- 建立和运行PCR反应的Wnt8a-HA和绿色荧光蛋白。使用在表2中说明在显示表1和实施例PCR反应及实施例的PCR条件显示的引物信息：模板DNA将取决于所述构建体被生产，在本实施例中，Wnt8a-HA作为模板DNA。
- 使用凝胶提取试剂盒清理PCR反应，在3执行最终洗脱0μl分子级的水。
- 检查在TAE制备的1％琼脂糖凝胶2微升的PCR产物。
- 消化Wnt8a-HA和eGFP的PCR产物和PCS2使用适当的限制性内切酶（见表1），如表2（实施例PCR产物消化）中所述设置的反应。
- 孵育反应3小时，在37℃和然后存储Wnt8a-HA和GFP PCR产物在冰上。
- 加的小牛碱性肠磷酸酶（CAIP）各1μl至PCS2消化并孵育6分钟，在37℃。
- 热灭活CAIP通过在65℃温育15分钟。
- 运行PCS2和PCR消化在TAE准备的1％超纯琼脂糖凝胶。
- 凝胶提取和使用凝胶提取试剂盒清理PCS2和PCR产物，在分子级的水30μL执行最终洗脱。
- 设置结扎如表2（实施例T4结扎）中所述孵育在12℃16小时。
2. mRNA合成：生成的Template
- 生产用下列质粒的限制性内切酶消化（所有在表达载体PCS2）模板：膜 - 蔚蓝（memCerulean），膜 - RFP（memRFP）的Shh-GFP，Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP的。
- 设置限制性消化，如表2中所述（实施例模板消化）。
- 轻轻混匀，并培育了反应2小时，37℃。
- 运行2.5微升消化的质粒在1％琼脂糖凝胶（TAE），检查该反应已经切割以完成。
- 清理使用凝胶提取试剂盒的概要，在50μl分子级水进行最终洗脱。
3. mRNA的合成： 体外转录
- 合成使用SP6 mRNA的转录工具包的功能基因。装配在1.5ml DNA酶/无RNA酶的离心管中的反应。
- 如表2（实施例mRNA合成）所述设置mRNA的转录反应。
- 混合反应轻轻用移液管，然后在37℃进行4小时。
- 检查在2％琼脂糖凝胶（TAE）1微升反应。
- 加入1μlDNA酶的反应，与P20轻轻混匀，37℃下进行15分钟的反应。
- 添加340微升分子级水，40微升乙酸铵和400μl的苯酚 - 氯仿的反应中。 VORTEX反应，持续30秒。
- 旋转mRNA的5分钟14000 XG，4℃。
- 从每个反应将它移动到一个新的1.5毫升吸管顶端（水溶液）层旋盖微量离心管中。
- 加等体积氯仿每个滗析反应。 VORTEX样品30秒。
- 旋转mRNA的5分钟14000 XG，4℃
- 吸液管从每个反应将它移动到一个新的1.5毫升螺旋盖微量离心管的顶部水层。
- 添加异丙醇等体积到每个反应并沉淀MRNA在-80℃下30分钟。
- 旋转每个反应进行15分钟，在14000×g离心，4℃，以沉淀的mRNA
- 除去上清液，注意不要扰乱沉淀的mRNA
- 加入200μl70％乙醇的每个反应中，混合反应，然后在14000×g离心，4℃旋转10分钟。
- 除去乙醇，注意不要扰乱的mRNA，干燥使用真空干燥器或Speed-Vac中沉淀在室温下。
- 重悬mRNA的10-20微升分子级的水。简单地旋转并保持样品在冰上。注意：将样品加热至80℃，持续1分钟能帮助它溶解。
- 运行加入1μl的mRNA上的2％琼脂糖凝胶（TAE）并分析在分光光度计1.2微升得到浓度的精确读数 。
关键的一步：需要合成基因的400毫微克/微升的浓度进行了以下实验。
关键的一步：如果260/280比率的2.00-2.20的范围内，或mRNA的总量的外超过12微克，进行氯化锂沉淀。 - 商店mRNA的1微升等分在-80℃。用等分，然后扔掉;不要再冻结的mRNA。
4.生成非洲爪蟾胚胎
- 素爪蟾雌性通过皮下注射用50单位人绒毛膜促性腺激素的;一个周实验前（HCG Chorulon）。
- 诱导爪蟾注射250单位的HCG，并在19℃培养他们在黑暗中，O / N 蟾女性夜间实验前。
- 解剖从安乐死雄青蛙，并存储在1xNAM睾丸在4℃。注：男青蛙被麻醉终端按照动物附表1安乐死（科学程序）1986年法令（https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia）。
- 按摩女非洲爪蟾诱发排卵，收集LAID鸡蛋在55毫米直径的圆形培养皿中。
- 通过压碎一个爪蟾睾丸的四分之一在1毫升去离子水产生精子悬浮液。
- 刷爪蟾卵母使用巴斯德移液器和灯泡破碎精子悬液关键步骤：执行施肥反应在下午4:30左右在实验的日子。
- 在21℃在NAM / 10培养胚胎（见表3溶液）在55毫米培养皿中涂有1％琼脂糖稀释在水（水）。
- 使用半胱氨酸/ HCl（表3）45分钟后脱果冻胚胎。注：在21℃下，将胚胎在90分钟后达到2细胞阶段，之后切割每20分钟。
5.质注射爪蟾胚胎
- 使用1×90毫米玻璃毛细管和NARISHIGE PC-10双级玻璃微量拉马，拉微量注射。调整设置凭经验来实现精尖（小于一微米diame之三）。
- 附加微量（针）的气体微量（例如，哈佛Appartaus PLI-100 PICO-注射器）来重复通过施加调节的压力的时间数字设定期间提供精确体积的液体。调节气动压力作为使用掩模版或校准幻灯片确定为传递的1.25至10纳升的容积。
- 外套55陪替氏培养皿用5毫升1％琼脂糖（水）。切下的琼脂糖的35-35平方毫米出来的菜，这将提供一个稳定的表面，以microinject胚胎。
- 转移胚胎到NAM / 3 +聚蔗糖（表3），并转移到注射菜。
- 注入的胚胎在动物半球一旦达到在实验所需的阶段。
- 为了分析在细胞表面上的GFP标记的配体的分布，在每个单元的两个细胞阶段，10NL注入胚胎双向横向。下图所示为Wnt8a-HA-EGFP例基因稀释。关键的一步：确保所有的mRNA浓度ST艺术在400毫微克/微升。
注意：要注入的mRNA的量需要根据经验通过测试浓度和发现以可视化的荧光配体所需的最低量来确定。使用抗HA抗体的Western印迹是一个重要的步骤，以确定该的mRNA被翻译到相似的水平，以允许两个不同的荧光标记配体的比较;我们在Fellgett 等人 2015年这样做的Wnt8a-HA-EGFP和Wnt11b-HA-EGFP。
注意：当评估注入mRNA的效果（例如一个编码的候选调节器），一个典型的控制是为了控制用于附加的任何影响注入的非活性的RNA，如LacZ基因，成同级胚胎成绩单中的胚胎。- 稀释memRFP表达1/4（1微升+3μL 卫生署2 O）分子级的水以降低浓度为100纳克/微升。
- 稀释Wnt8a-HA-EGFP表达1/4（1微升+3μL卫生署2 O）分子级的水以降低浓度为100纳克/微升。
- 混合memRFP的mRNA以1：1的比例与Wnt8a-HA-eGFP的表达。
- 1比用对照的mRNA的LacZ或调节剂如Sulf1：从5.5.1.3在1混合的mRNA。
- 双侧注射的胚胎在2-细胞期与10NL mRNA的每个细胞（总20nl的）。注意：这将导致250 PG M EM RFP，250皮克Wnt8a-HA-êGFP，500皮克Wnt11b-HA-ëGFP和2纳克的LacZ或Sulf1基因被注入到每一个细胞。
- 分析GFP的扩散标记配体，注入的mRNA编码配体的GFP连同谱系标记如memRFP在16-32细胞阶段，每个细胞1.25 NL。
- 分析任何潜在配体扩散的调制器的作用，共注入mRNA编码的调制器一起与配位体和谱系示踪剂。或者，注入相邻小区：一个的mRNA编码GFP标记立杆d以及a谱系示踪剂（memRFP）和其他的用的mRNA编码的调制器和一个不同的谱系示踪剂（memCerulean）。
- 为了分析在细胞表面上的GFP标记的配体的分布，在每个单元的两个细胞阶段，10NL注入胚胎双向横向。下图所示为Wnt8a-HA-EGFP例基因稀释。关键的一步：确保所有的mRNA浓度ST艺术在400毫微克/微升。
- 转移胚胎到12.5℃的培养箱中培养，直到第二天，新科普和费伯（NF）8级。
6.动物摘除章植
- 转移胚胎涂布用5ml的1％琼脂糖（水）的55毫米培养皿中。装满NAM / 2（表3）的菜。
- 以使用钨针圆形动物帽关键步骤：以大型股在这一阶段，因为这些会愈合更好，更容易的形象，保持控制上限，以确保没有收敛扩展的原因。
- 转移动物的外植体，以55毫米涂覆有1％琼脂糖（水）和培养的胚胎的培养皿在21℃4小时关键步骤：在4小时温育需要允许荧光蛋白的成熟。
- 通过坚持下来PVC insulatio两层生成救济幻灯片N值磁带到显微镜载玻片上。 10毫米的矩形出带切割14毫米留下室安装动物帽关键的一步：切矩形拼合前两层的磁带深入到幻灯片。
- 吸取2个独立的不结盟运动滴/ 2（表3）进入救援幻灯片，每滴约30微升。
- 用切断P20尖转移动物的外植体，救援幻灯片和定向，使顶侧朝上。注意：每个滑动可以容纳：10-15动物帽关键步骤：在这个阶段，动物上限应该部分愈合的，这意味着他们不太细腻，并且可以使用镊子被定向。
- 轻轻降低的玻璃盖玻片上浮雕滑动，并允许盖片干燥20分钟关键步骤：动物帽的大小是至关重要的。确保盖是足够大，当玻璃盖玻片被降低到救济滑动它压缩动物帽足以公关细胞的顶层oduce一个平面上的图像。如果动物帽子太小仍然然后降低PVC胶带一层。
- 密封件，指甲油的幻灯片关键的一步：不要使用太多的指甲油封住救援幻灯片，因为如果PVC胶带变得过于潮湿会兴起，破坏的幻灯片。
- 干救灾幻灯片在黑暗中20分钟，他们已经准备好形象，通常是动物帽将保持健康的一次密封幻灯片4-6小时。
7.成像
注意：成像进行使用倒置共聚焦显微镜。拉姆达模式被选择用于成像，因为这允许多个荧光团具有重叠的签名中使用，并去除扫描之间潜在样本移动的问题。
- 查找使用低倍物镜外植体，然后切换到63X / 1.4油客观上为更高分辨率的成像。
- 接通所需的激光器;对于本实施例的405激光被用来激发memCerulean，488激光被用来激发GFP和561激光使用405和五百六十一分之四百八十八分色镜，以激发memRFP。
- 使用拉姆达模式（在禅2011年，选择的lambda模式 - 32箱）。
- 选择405纳米，488nm处和561nm lasers.To允许更宽的视野，缩小图像（以0.6X）。
- 设置帧大小到所需的图像尺寸（1024×1024与220nm处的像素大小被用于该数据集）。
- 设置平均到通常4至8，以增加信噪比。
- （根据用于该数据集的561nm激光器1通风单元）优化我针孔。
- 优化我的激光功率关键步骤：平衡的405纳米，488nm处和561nm激光器，使得所有荧光团可以使用32检测器阵列，同时减少电压和增益的需要的量来检测。
- 收集光正从memCerulean，GFP和memRFP发出。对于这种工作灯，收集每一个〜10nm的从415-720nm，虽然较大的收集时间间隔也是可能的（例如，每隔约20纳米）。
8.图像分析
- 考察对的GFP标记的配体的细胞表面的表达调节剂的效果
注：以下步骤是如何分析在我们的实验室中进行了详细的指导。最终用户可能想通过写一个ImageJ的或斐济脚本删除一些手动步骤的简化程序。
关键步骤：重要的是，最终用户的样本中被以PERF在最后的实验中使用的多种荧光团的ORM有效光谱分离进行最后试验相同的条件下使用任何荧光团的光谱。
两种主要类型的分析本节进行：- 计算的Wnt-HA-eGFP的像素共地方化与细胞膜的总数。
- UNMIX绿色，红色和天蓝色的频道使用光谱由单一注射这些荧光团在ZEN软件的采样。这些图像保存为独立的文件，LSM在以下所有步骤的使用。
- 直接在图像编辑软件打开LSM文件。注：以下说明适用于斐济图像J.
- 保存LSM图像，图像序列文件，这将图像自动分割成独立的通道。
- 保存图像序列到相同的文件夹，将用于对数据进行分析的脚本的脚本分析软件（ 见补充代码文件实际脚本）。注：以下说明适用于Matlab的。
- 打开脚本分析软件并打开其中的脚本编写的目录。
- 进入下位置分析的文件名，软件将文件名，并进行分析。
注意：文件名会读ImageA0000和ImageA0001每个IMAGE。该脚本分析软件将使用的图像标记0001作为掩膜，并分析像素的图像0000的共定位与此面具的百分比。 - 就拿个共定位号码（注释为填充细胞膜），并将其复制到电子表格中。注：以下说明适用于Excel中。
- 绘制线图上的百分比共定位数为绝对或相对值。
- 解析 - 的Wnt-HA-eGFP的泪点的数量，大小和形状。
- 直接在图像编辑软件打开纯LSM文件。注：以下说明适用于斐济图像J.
- 拆分每个图像到其独立的通道（图像>彩色>拆分通道）。
- 阈值这两个Wnt信号-HA-EGFP和膜标记通道（图像>调整>自动阈值） 关键的一步：尝试一些阈值，看看哪一个产生的代表图像，而不过度曝光的通道。
- 膜标记通道转换为遮罩（流程>二进制>使面罩）。
- 反转这个面膜（编辑>反转）。
- Wnt信号-HA-eGFP的泪点转换为掩模如上。
- 从减配体GFP面膜（过程>图像计算器> Wnt信号屏蔽在机顶盒，在底盒膜面膜）膜标记面具。
- 使用分析颗粒的功能。从这里，选择所需要的参数和分析数据（分析>分析的粒子）。
- 颗粒，平均粒径和圆度数据的数目复制到电子表格中，然后绘制从这些数据图。注：在本分析中，只有颗粒之间0.1-10μm2的大小进行了分析，没有任何限制放置在颗粒圆。该指令是为Excel。
- 计算的Wnt-HA-eGFP的像素共地方化与细胞膜的总数。
- 浅析配体扩散的范围
- 打开所有的纯图像共聚焦IM老化软件，然后导出在一个TIF格式的文件，作为原始数据并作为RGB图像注：此指令是用于禅精简版2011关键步骤：包括在图像中的至少一项所述的比例尺，使距离可在分析过程中计算出来的。
- 打开的图像，以图像分析软件进行分析。注：以下说明的Photoshop 8.2.3）右键单击图像的背景，然后选择“图层与背景”，创建一个新的图层。
- 将膜标记渠道为0，所以只有配体GFP通道可见（图层>新建调整图层>通道混合器） 关键步骤：剪辑新调整图层的图像被分析，选择裁剪的新层这张图片可以作为点击通道混频器选项后复选框。
- 打开一个新的工作空间。设置分辨率为每英寸300像素，颜色模式为RGB颜色（文件>新建>剪贴板）。
- 复制所有的图像被分析成单个工作（点击图片，它的剪裁通道混频器通过按住控制然后按住控制和Alt键并拖动图片到工作区）。
- 定向的所有图像，使得扩散针对每个图像的最大长度可以沿水平轴来测量，用表达的Wnt-HA-eGFP的定向到左边的细胞。
- 保存的工作空间作为TIF，然后在图像分析软件打开此。注：以下说明适用于斐济图像J.
- 打开ROI管理器窗口（分析>工具>的投资回报率经理）。
- 绘制一个矩形的第一个图像，矩形的确切大小，可以指定（选择矩形工具，绘制矩形>编辑>选择>指定）。注意：650 x 100像素长×宽甲大小在该研究中使用。
- 放置的矩形上表达Wn中域的边缘T-HA-EGFP。放置在区域中的矩形的的Wnt-HA-eGFP的扩散的最大距离。 关键的一步：即使没有薄膜标记表达的Wnt-HA-ËGFP的地区应该是可见，由于背景荧光;如果没有的话请咨询原始图像。
- 移盒10μM到右侧。通过测量包含在图像中的一个中的标尺长度确定微米的数量（画线跟踪中的比例尺>分析>设置刻度）。注意：这提供了10μM的以像素为单位的值。
- 按投资回报率管理器窗口中的添加按钮框的投资回报率经理。
- 移动矩形到下一个图像通过单击后面的矩形工具移动矩形来衡量。重复步骤8.2.10-11。
- 一旦所有的板进行了测量，从投资回报率管理器菜单（ROI经理>更多>多重散点图>列表）中选择的multiplot。
注：该数据表示Wnt信号像素INTEnsity（Y），随着沿水平轴的距离（X，以像素为单位）。为Y的值是配体的GFP在点X的平均信号强度，并且平均是从所有在对于每个X值Y轴的像素的计算。因此，该高的盒，在更多的像素将被分析，以产生这种平均。一个小盒子（Y轴）会发出更大的噪音;一个高大的框将具有非常低的平均像素强度。 - 从多重散点图中的数据复制到一个电子表格，重新标签，相应。注：以下说明适用于Excel中。
- 从每个分析丢弃数据的第一10-20μm，因为这代表了从配体的GFP表达细胞的背景荧光，扭曲的曲线图。
- 打开科学的分析和制图软件，并创建一个新的笔记本。注：以下说明适用于SIGMAPLOT 13。
- 通过双击标记为数据列的所需数量的水平号码Òn个工作表，并标注它们微米的距离，Wnt8a-HA-EGFP和Wnt11b-HA-EGFP。
- 从电子表格中的数据复制到了科学的分析和图形软件中的相关列。
- 创建的分布图（图创建>分散>多重散射>选择x很多Y>选择X>选择Wnt8a-HA-EGFP和Wnt11b-HA-EGFP的Y值>完成的距离列）。
- 左键单击上的散点图一个Wnt8a-HA-EGFP点上执行Wnt8a-HA-EGFP曲线回归分析。所有的点应该突出。点击分析>回归向导。
- 选择曲线方程类（指数衰减）和公式名（单人，3个参数），然后按下一步。
- 选择该曲线应安装（如果数据先前强调的，这应该是自动完成），然后按旁边的X和Y值。
- 继续通过向导，直到数字输出选项小号页上，确保“创建报告”被选中，然后按下一步。注：该参数拟合曲线将在报告1显示出来*。
- 在图形选项页面中，确保“加方程式图形标题”被选中，然后按完成。注：该向导将创建报告1 *和图1 *标签在记事本的顶部。此外，该曲线将被添加到在（20年2月8日）所产生的曲线图。
- 重复步骤8.2.21-8.2.25，以适应曲线Wnt11b-HA-EGFP 关键的一步：尽量拟合方程多个类别和公式名称的数据。注意：用最合适的曲线应产生最高的R 2值与广场的最低残留总和。
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Representative Results
动物帽外植体共聚焦分析表达荧光标记的蛋白质提供了一个有效的系统来可视化不同的实验条件下配体的分布。在一个实例中，绿色荧光蛋白的分布标记的Shh所示（ 图1）。在2-细胞阶段， 爪蟾胚胎注入到两个小区中可以包含一个控制mRNA或mRNA的编码Sulf1，修饰细胞表面硫酸乙酰肝素和影响的Shh形态发生梯度16的酶。这些胚胎进行培养直到32细胞阶段和单细胞是共注射用的mRNA编码的Shh-GFP和memRFP（作为谱系示踪剂）。这造成细胞表达标有细胞膜栓RFP SHH-GFP的克隆。在囊胚期，动物帽外植体图1采取通过共聚焦显微镜分析。显示控制的条件下，Shh的-GFP被分泌和再外扩散祗园表达注入的mRNA。然而，在Sulf1的存在下，Shh的-GFP是更受限制在其分布和，此示例中，没有细胞生产它的克隆以外检测出来。 Sulf1对SHH-GFP分布的影响进行了分析更充分的16。
当在爪蟾胚胎表达，荧光标记的Wnt配体被分泌，积聚在细胞膜上，并扩散穿过电池领域。在图2中，我们描述的两个不同的数量化和定性性质fluorecently标记的Wnt配体的细胞中注入并表达该蛋白。 图2A-H示出了Wnt8a和Wnt11b-HA-eGFP的如何积聚在动物帽细胞膜例子。通过比较面板2B和2F很清楚，Wnt8a-HA-eGFP的积聚更有效地在细胞膜上比Wnt11b-HA-eGFP的。用一个COM量化信息已经被提取的共焦图象图像和脚本分析软件（补充代码文件）的bination。 图2I示出了Wnt8a-HA-eGFP的对细胞膜相比Wnt11b-HA-eGFP的相对累积。该数据是用计算机脚本来确定的Wnt-HA-eGFP的像素共同的地方化，在每个图像细胞膜的像素的总数获得的。在另一种方法中，Wnt信号-HA-eGFP的泪点的总数共定位与细胞膜使用图像分析软件（图2J）计数。关于大小及个别泪点的形状定性信息还可以提取从利用图像分析软件中的数据。除了 更少Wnt11b-HA-eGFP的泪点共本地化与细胞膜（图2J）这些泪点也具有比Wnt8a-HA-eGFP的泪点（图2K）一个较小的平均尺寸。此外，Wnt11b-HA-eGFP的泪点具有减小的圆形相比Wnt8a-HA-eGFP的泪点（图2L）。保监会ularity是多么紧密一个目的类似于正圆，用1表示正圆和0.1的细长的非圆形形状的度量。这种方法可以用于测试的Wnt配体一起扩散任何候选调节剂。要做到这一点，控制单元应使用控制mRNA编码为候选调节器的非活性形式或不相关蛋白质，如β-半乳糖苷酶 （lacZ）被注入;这提供了比根本就没有注射监管机构更有效的控制。在这些实施例中的数据是使用非参数测试曼-惠特尼ù18-19进行分析。统计分析程序来进行测试。
在图3中，我们研究Wnt信号配体扩散。单个卵裂球中在4-细胞阶段注入的，使得动物帽植代表细胞中只有一些细胞表达任Wnt8a-HA-eGFP的或Wnt11b-HA-eGFP的一个领域。通过包括细胞谱系示踪剂，我们可以识别expressing与非表达细胞并且这允许Wnt8a-HA-eGFP的和Wnt11b-HA-eGFP的配体扩散的范围远离源细胞进行分析（图3B 和3C）。由于动物帽外植体的曲率，能够使用该测定法被可靠测量的最大距离为160μm，这是不够的，测量配体扩散的绝对距离。然而，通过使用共聚焦分析，图像分析和科学分析的组合和制图软件的Wnt-HA-eGFP的形态发生梯度的整体形状可以分析（图3D）。这个数据可以用来研究是否在同一细胞中的标记配体过度表达的另一种蛋白质一起影响的Wnt分泌或扩散。在另一类型的实验（图3E-3J）的电势调节器在接收单元的影响可以通过超表达候选蛋白在邻近细胞前细胞的克隆测定按Wnt8a或Wnt11b-HA-EGFP。这使得要被检查上的Wnt-HA-eGFP的配体扩散的调节器的任何非细胞自主性的效果。符合图2，更 Wnt8a-HA-eGFP的可检测从细胞比Wnt11b-HA-eGFP的两个扩散实验扩散路程。
在本文描述的实验的类型已经被用于分析Sulf1对Shh和Wnt信号16,17的效果。
可以通过非洲爪蟾动物帽共聚焦分析检测图1.调制SHH-GFP分布。 （A）的卡通描绘实验测定，其中胚第一注射mRNA编码用于Sulf1或控制的mRNA中，相同的胚胎是在32细胞期mRNA的编码的Shh-GFP成单个细胞后注入。（BC）动物帽外植体小号均于级8和4小时后成像。图像示于细胞的Shh的-GFP + memRFP表达克隆的边缘。在控制胚胎（B），SHH-GFP分布远离信号生成细胞的memRFP标志着克隆。在胚胎表达Sulf1（C），SHH-GFP更限制了其分布，见16。 memRFP以品红显示和Shh-GFP的绿色。比例尺代表20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.定量和Wnt8a和Wnt11b-HA-eGFP的细胞膜上的泪点定性分析。 （AH）胚胎显微注射双向横向地编码mRNA memRFP（500pg的）到动物半球在两细胞阶段。此外胚胎注射MR NA编码（AD）Wnt8a-HA-EGFP（500 PG）或[EH] Wnt11b-HA-EGFP（为1ng）。将胚胎也注射的mRNA编码的LacZ于分析任何潜在的调节器的影响，当提供附加的mRNA /蛋白质的控制。在（C）和（G）中的白框分别标记在放大板（D）的区域和 （H）。利用图像和脚本分析软件，然后归一化（Ⅰ）的总量的Wnt-HA-eGFP的荧光共本地化与细胞膜算出。利用图像分析软件的定性信息萃取。 Wnt8a和Wnt11b-HA-eGFP的punctae为粒子数（J），粒径（K）和颗粒圆度（L），进行分析。曼 - 惠特尼U（** P <0.01），N =胚胎数。 memRFP示于品红，和Wnt8a / 11b的-HA-GFP以绿色显示，刻度条表示20μm的。ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3.测量荧光的扩散范围标记的Wnt配体。 （A）图描绘用于测量Wnt8a和Wnt11b-HA-EGFP分泌和扩散远离表达细胞的检测。 （BC）的mRNA编码（B）memCerulean（600 PG）的LacZ（浓度4ng）和Wnt8a-HA-EGFP（纳克）或（C）memCerulean（600 PG）的LacZ（浓度4ng）和Wnt11b-HA-EGFP（2纳克）注射到1卵裂球在四个细胞阶段的动物的半球。（D）的 Wnt8a-HA-eGFP的和Wnt11b-HA-eGFP的扩散的，通过一个控制背景测定的范围。（E）的图描绘试验中使用通过后台来衡量Wnt8a和Wnt11b-HA-EGFP扩散表达LacZ，请参阅方法DET苦恼。（FG）的mRNA编码memCerulean（600皮克）和（F 和H）Wnt8a-HA-eGFP的（2纳克）或（G和I）Wnt11b-HA-eGFP的混合物在四注入成一个卵裂球的动物半球细胞阶段。相邻的卵裂球注射用基因通过后台表达LacZ测量编码memRFP（600 PG）和LacZ的（4纳克），看关键的详细资料。（J）Wnt8a-HA-EGFP和Wnt11b-HA-EGFP扩散的范围。数据进行量化，并使用共聚焦分析，图像分析和科学分析和图形软件绘制。 memCerulean（蓝色（CD）和黄色（F和H）），Wnt信号-HA-EGFP（绿色），memRFP（品红色），比例尺代表20微米。 请点击此处下载该文件的放大版本。
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表1.引物用于亚克隆Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP和Shh-GFP成PCS2。
| 反应 | 组件 | |
| 例如CS2 +摘要 | 1.5 PCS2微克+ | |
| 2微升限制性内切酶1 | ||
| 2微升限制性内切酶2的 | ||
| 5微升限制性内切酶缓冲液（10X） | ||
| 补足至50μl的用分子级水 | ||
| 例如mRNA合成 | 2微升线性化模板 | |
| 2微升10X Megascript TRX组合 | ||
| 2微升50毫ATP | ||
| 2微升50毫CTP | ||
| 2微升50毫UTP | ||
| 2微升的5mM GTP | ||
| 2.5微升40mM的帽类似物（M7G（5'） | ||
| 2微升SP6酶混合物 | ||
| 3.5微升分子级水 | ||
| 例如PCR反应 | 0.5微升高保真DNA聚合酶（2000单位/ ml） | |
| 2纳克模板DNA | ||
| 2.5微升正向和反向引物（10μM） | ||
| 0.5微升的dNTP | ||
| 5微升的DNA多聚酶缓冲液（10X） | ||
| 补足至50μl的用分子级水 | ||
| 例如PCR条件 | 在98℃Intial变性2分钟 | |
| 15秒98℃ | ||
| 15秒65℃ | 30个循环 | |
| 40秒72℃ | ||
| 在72℃最终延长10分钟 | ||
| 例如PCR产物摘要 | 28微升的PCR产物的 | |
| 2微升限制电子商务nzyme 1 | ||
| 2微升限制性内切酶2的 | ||
| 5微升限制性内切酶缓冲液（10X） | ||
| 13微升分子级水 | ||
| 例T4连接 | 1微升切割CS2 + | |
| 3微升切割PCR产物1 | ||
| 3微升切割PCR产物2 | ||
| 1微升T4 DNA连接酶 | ||
| 1微升T4 DNA连接酶缓冲液（10X） | ||
| 1微升分子级水 | ||
| 示例模板消化 | 5微克质粒DNA | |
| 10微升限制酶缓冲液（10X） | ||
| 3微升NOT1（除SHH-GFP，Kpn1时） | ||
| 补足到100微升具有分子级水 |
表2实施例反应条件用于亚克隆和生产合成的mRNA Wnt8a-HA-eGFP的。
| 解 | 组件 |
| 半胱氨酸盐酸 | 0.1X NAM |
| 2.5％的L-半胱氨酸盐酸盐一水合物（pH7.8） | |
| NAM盐 | 110毫米氯化钠 |
| 2毫米氯化钾 | |
| 1毫米的Ca（NO3）2 | |
| 0.1毫摩尔EDTA | |
| NAM / 2 | 0.5X NAM盐 |
| 5毫米的HEPES pH7.4的 | |
| 0.25毫米碳酸氢盐 | |
| 25微克/毫升庆大霉素 | |
| NAM / 3 +菲 | 0.33X NAM盐 |
| 5毫米的HEPES pH7.4的 | |
| 0.25毫米碳酸氢盐 | |
| 25μg即可测/ ml庆大霉素 | |
| 5％聚蔗糖 | |
| NAM / 10 | 0.1X NAM盐 |
| 5毫米的HEPES pH7.4的 | |
| 25微克/毫升庆大霉素 |
异种的生产和显微注射过程中使用表3中的解决方案脓蟾胚胎。
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Discussion
此协议的一个重要部分是产生了通常处理的，分泌的，并能够引发所述接收单元在响应中，尽管具有连接荧光部分生物活性配体。关键是要建立的荧光标记的基因产物是生物学活性使用适当的测定法。为的Shh-GFP，以激活PTC1的表达的能力，确认16。 Wnt8a具有显着有效的能力以诱导次级轴时在单个卵裂球腹20-21表达，Wnt8a-HA-eGFP的显示出保留这种生物活性。 Wnt11b抑制活化处理外胚层外植体进行收敛延伸21-22和Wnt11b-HA-EGFP还保留其生物活性17。经标记的配体引发的反应等同于未标记的蛋白质的能力，表明，基于使用荧光配体将B实验的结论相关的正常蛋白质即在加入配位体和荧光蛋白之间的HA抗原决定基的提供一个分隔区，其允许的Wnt构造为主动和荧光。
这种类型的分析的主要限制是，它并不直接告知内源形态发生素梯度。例如，Shh的跨细胞的动物帽领域的扩散可能不反映的方式，通过在胚胎柱状神经上皮内源Shh的移动。然而，该协议的简单性允许实验中的外源性监管机构对配体的分布的影响进行测试。从这些方法的结果可以形成利用更苛刻的体内分析被测试的假设的基础上。例如，过表达Sulf1的限制使用本文描述的方法的Shh-GFP的分布的能力在调节Shh的形态发生毕业指出有潜力Sulf1ient。这是直接的测试，使用反义Sulf1的吗啉击倒和免疫细胞化学可视化的内源性的Shh在神经管16验证。类似的方法，我们已用于研究，可以调节配体扩散的具体机制。史密斯和同事证明，一个GFP标记节点（Xnr2）使用简单的扩散，而不是细胞扩展（cytonemes）或胞转（使用囊泡）以形成梯度23。
这些方法的进一步阐释是可能的，其中，阻止特定途径的其他蛋白质可以表达在靶向细胞进行调查的信号传导分子的响应是否需要作为中介从一个小区中继信号到另一个。例如，表达激活素的源和响应单元之间的显性负活化素受体表明，简单的配体扩散可能从源电子引发响应几个细胞直径距离体ven与非应答细胞中24之间 。这一结论得到了支持工作在斑马鱼，其中野生型细胞可以响应节点的一个来源，尽管被包围缺乏一个基本共受体结25非响应突变细胞。其他研究使用斑马鱼来研究荧光标记的配体28,29扩散。一些研究已经观察到，表位标记Wnt蛋白的C末端可以影响，因为高度保守的半胱氨酸有助于蛋白质构象的可能的信号传导活性，。我们以前的工作已经表明，包括一个间隔件（如HA标签）导致标记的Wnt配体是生物活性的17。这可能是因为间隔件提供所需的配体-受体相互作用的灵活性，例如在Wnt信号-FRZ结合30的拇指食指模型。
用于推进我们的研究的下一个步骤是包括一个相UAL读出的信号传导途径的激活。例如，表达GFP标记DVL 26在细胞配体的源极远处将允许横跨其Wnt11b具有信号的能力的范围内进行测量。可以用抗体染色来测量β-联蛋白在细胞27的核定位在距源的距离被显示Wnt8a信号活动的范围。这些类型的实验是可能使用本文中所描述的技术。通过采用各种不同的荧光蛋白或荧光团，将提供的信息的附加级，其中一个不仅测量配体的分布，但在信号转导途径的也输出，并以这种方式来确定一个形态发生的阈值范围。
非洲爪蟾是可视化GFP标记的配体和进一步的细节上的方法进行采购的胚胎，基因合成，显微注射和剖析一个有用的模型离子可用31。
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Acknowledgments
这个工作是由一个BBSRC授予环保部（BB / H010297 / 1），一个BBSRC助学金名额特区，以及MRC助学金为SWF。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | Free download http://fiji.sc/Fiji | ||
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55 mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | http://www.photoshop.com/products | |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer - M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | homemade | ||
| Zen lite software | Carl Zeiss | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
References
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