Endosomolytic अभिकर्मक dfTAT साथ ऊष्मायन द्वारा जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, पेप्टाइड या सेल अभेद्य छोटे अणुओं की डिलिवरी
Summary
We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.
Abstract
Macromolecular वितरण रणनीतियों आम तौर पर सेलुलर प्रवेश का एक मार्ग के रूप में endocytic मार्ग का उपयोग। हालांकि, endosomal फंसाने गंभीर रूप से कोशिकाओं के साइटोसोलिक अंतरिक्ष घुसना अणुओं के साथ जो दक्षता की सीमा। हाल ही में, हम अभिकर्मक dfTAT, fluorophore tetramethylrhodamine के साथ लेबल पेप्टाइड जैसे की एक डाइसल्फाइड बॉन्ड डिमर की पहचान के द्वारा इस समस्या को धोखा दिया है। हम जीवित कोशिकाओं प्रवेश और एक विशेष रूप से उच्च दक्षता के साथ कोशिकाओं के साइटोसोलिक अंतरिक्ष तक पहुँच जाता है, जो प्रोटोटाइप सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड (सीपीपी) बुनना, dfTAT की एक fluorescently लेबल डिमर उत्पन्न किया है। DfTAT के साइटोसोलिक वितरण प्राथमिक कोशिकाओं सहित कई सेल लाइनों में हासिल की है। इसके अलावा, वितरण काफ़ी सेल व्यवहार्यता, प्रसार या जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं करता। dfTAT छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, एंटीबॉडी, जैविक रूप से सक्रिय एंजाइम और एक प्रतिलेखन कारक वितरित कर सकते हैं। इस रिपोर्ट में, हम dfTA में शामिल प्रोटोकॉल का वर्णनटी संश्लेषण और सेलुलर वितरण। पांडुलिपि extracellularly प्रशासित प्रोटीन की मात्रा अलग से कोशिकाओं के साइटोसोलिक अंतरिक्ष के लिए दिया प्रोटीन की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए कैसे करें। अंत में, इस नई तकनीक और वितरण को मान्य में शामिल कदम की वर्तमान सीमाओं चर्चा कर रहे हैं। वर्णित प्रोटोकॉल सेल आधारित assays के लिए के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के पूर्व vivo हेरफेर और reprogramming के लिए अत्यंत उपयोगी होना चाहिए।
Introduction
जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, पेप्टाइड या सेल अभेद्य छोटे अणुओं की डिलीवरी कई जैविक या जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों (सेलुलर इमेजिंग, कार्यात्मक assays, सेलुलर reprogramming, आदि।) 1-4 में अक्सर वांछनीय है। कई वितरण दृष्टिकोण पहले ही microinjection, इलेक्ट्रोपोरेशन, या वाहक एजेंटों के उपयोग सहित सूचित किया गया है (उदाहरण के लिए।, इस तरह जैसे के रूप में सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स, लिपिड) 5-7। प्रत्येक तकनीक को आम तौर पर कुछ अनुप्रयोगों के लिए नहीं, बल्कि दूसरों के लिए इन तरीकों पर्याप्त बना सकता है कि विशिष्ट पेशेवरों और बुरा है। आम मुद्दों कुछ कोशिकाओं में नहीं बल्कि एक पूरी आबादी में और / या कमी 8,9 वितरित किया जाता है कितना माल का नियंत्रण है, विषाक्तता या हानिकारक शारीरिक प्रभाव 10,11, अस्थायी नियंत्रण की कमी है, प्रसव के गरीब वितरण क्षमता (शामिल उदा।, microinjection) 12, और जटिल रासायनिक विकार या निर्माण योजनाओं 11।
<p clas एस = "jove_content"> हाल ही में, हम इन सीमाओं में गतिरोध उत्पन्न कि एक उपन्यास वितरण रणनीति विकसित किया है। इस रणनीति के dfTAT नाम के एक पेप्टाइड (डिमर फ्लोरोसेंट बुनना) 13 पर निर्भर करता है। dfTAT अच्छी तरह से पता सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड (सीपीपी) बुनना से ली गई है। dfTAT fluorophore tetramethylrhodamine के साथ लेबल बुनना के दो डाइसल्फाइड बंधुआ प्रतियां शामिल हैं। उनकी समानताओं के बावजूद, बुनना और dfTAT गतिविधि में काफी भिन्न होते हैं। जैसे आम तौर पर endocytosis द्वारा कोशिकाओं में भली भाँति है। यह सीपीपी हालांकि ज्यादातर (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच यह आमतौर पर जब कोशिकाओं के अंदर पेप्टाइड का एक कबरा वितरण के लिए नेतृत्व) endosomes अंदर फंस रहता है। जैसे की तरह, dfTAT कुशलता से कोशिकाओं द्वारा endocytosed है। हालांकि, dfTAT endosomes अंदर फंस नहीं रहती है। इसके बजाय, यह बहुत ही कुशल है कि एक तरह से endosomal रिसाव मध्यस्थता करता है। dfTAT की endosomolytic गतिविधि तो एक साधारण ऊष्मायन परख द्वारा अणुओं देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इस प्रकार के रूप ntent "> वितरण की प्रक्रिया की वर्तमान समझ है। dfTAT macropinocytosis लाती है। नतीजतन, dfTAT साथ incubated कोशिकाओं द्रव चरण से मीडिया में मौजूद घुलनशील प्रोटीन, पेप्टाइड, या छोटे अणुओं (ब्याज की अणु, MOI) तक ले endocytosis (चित्रा 1 देखें)। dfTAT और MOI के बीच सहभागिता एक साथ endocytic मार्ग के भीतर दोनों संस्थाओं के यातायात के रूप में लंबे समय के रूप में आवश्यक नहीं हैं। dfTAT endocytic अंगों के लुमेन के भीतर एक निश्चित सीमा तक पहुँच के रूप में, यह अपने endosomal रिसाव गतिविधि (आणविक विवरण व्यक्त dfTAT है, क्योंकि यह दृष्टिकोण इसके अलावा। इसलिए MOI के साथ कोई विकार या निर्माण योजनाओं के लिए आवश्यक हैं के रूप में बहुत सुविधाजनक है।।) पूरी तरह होती जा करने के लिए टपका हुआ अंगों के लुमेन की सामग्री के बने हुए हैं, और इसलिए MOI, तो कोशिकाओं में जारी की है इंट्रासेल्युलर वितरण हासिल की है एक बार सीधे एक MOI को संशोधित नहीं है, यह भी MOIs समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए। इसके अलावा, की एकाग्रताdfTAT वितरण मीडिया में Moi की है कि स्वतंत्र है इस्तेमाल किया। उदाहरण के लिए, dfTAT एकाग्रता endosomal रिसाव में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य क्षमता गारंटी करने के लिए अलग-अलग प्रयोगों के बीच स्थिर रखा जा सकता है। इसके विपरीत, मीडिया में Moi की एकाग्रता धीरे-धीरे MOI साइटोसॉल में दिया के वांछित स्तर को प्राप्त करने के लिए बदला जा सकता है।dfTAT के साथ हासिल की उच्च endosomal रिसाव दक्षता तारीख करने के लिए परीक्षण कोशिकाओं के कई उल्लेखनीय अहानिकर है। Endocytic अंगों की कोशिकाओं के महत्वपूर्ण घटक हैं और एक dfTAT द्वारा मध्यस्थता नाटकीय रिसाव हानिकारक सेलुलर प्रतिक्रियाओं के साथ किया जाना होता है कि उम्मीद होती है, क्योंकि यह एक आश्चर्य की बात है। फिर भी, इलाज कोशिकाओं अनुपचारित कोशिकाओं के रूप में एक ही दर पर पैदा करना और उनकी transcriptome में कोई महत्वपूर्ण बदलाव प्रदर्शित नहीं करते। इसके अलावा, वितरण कोशिकाओं को खोने के बिना प्रसव प्रक्रिया से सहन या ठीक कर सकते हैं या तो यह दर्शाता है कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वितरण क्षमता के साथ ही मिनटों के भीतर दोहराया जा सकता हैendocytosis या endosomal रिसाव के लिए अपनी क्षमता। सूक्ष्म सेलुलर प्रतिक्रियाओं dfTAT वितरण और इन प्रतिक्रियाओं का पता लगाया जा रह हो सकता है की आणविक विवरण के दौरान जगह ले सकता है। फिर भी, उच्च दक्षता, प्रोटोकॉल की सुविधा है, और विषाक्तता की कमी के संयोजन से, इस वितरण दृष्टिकोण कई सेल आधारित अनुप्रयोगों में तुरंत उपयोगी साबित करना चाहिए। इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल अनुसंधान समुदाय के लिए इस प्रौद्योगिकी सुलभ बनाने के उद्देश्य से कर रहे हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के बाद से पीढ़ी मिला हुआ नहीं होना चाहिए dfTAT प्रसव के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं (> 90% confluency) वितरण क्षमता को प्रभावित कर सकता है। कोशिकाओं को भी स्वस्थ होना चाहिए: संस्कृति में मृत कोशिकाओं dfTAT (अपमानित न?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).
Materials
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
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