Abstract
אסטרטגיות משלוח macromolecular בדרך כלל לנצל את מסלול endocytic כתוואי כניסה סלולרית. עם זאת, מלכוד endosomal מגביל מאוד את היעילות שבה מולקולות גדולות לחדור את מרחב cytosolic של תאים. לאחרונה, יש לנו לעקוף בעיה זו על ידי זיהוי מגיב dfTAT, קשר דיסולפיד דימר של תאת פפטיד שכותרתו עם tetramethylrhodamine fluorophore. יש לנו נוצר דימר כותרתו fluorescently של תאת הטיפוסית פפטיד חודר תאים (CPP), dfTAT, שחודר לתאים חיים, ומגיע לחלל cytosolic של תאים עם יעילות גבוהה במיוחד. משלוח cytosolic של dfTAT מושגת בשורות תאים מרובות, כוללים תאים ראשוניים. יתר על כן, משלוח אינו ניכר להשפיע על כדאיויות תא, התפשטות או ביטוי גנים. dfTAT יכול לספק מולקולות, פפטידים, נוגדנים, אנזימים פעילים ביולוגי קטנים וגורם שעתוק. בדו"ח זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים מעורבים בdfTAסינתזת T ומשלוח סלולארי. כתב היד מתארת כיצד לשלוט בכמות החלבון שנמסר למרחב cytosolic של תאים על ידי שינוי כמות החלבון מנוהלת extracellularly. לבסוף, המגבלות הנוכחיות של הטכנולוגיה החדשה הזו והשלבים כרוכים באימות משלוח הם דנו. הפרוטוקולים תיארו צריכים להיות מאוד שימושיים עבור מבחני מבוססי תאים, כמו גם למניפולצית vivo לשעבר ותכנות מחדש של תאים.
Introduction
המשלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות תא חדיר לתאים חיים הוא לעתים קרובות רצוי ביישומים רבים ביולוגיים או ביוטכנולוגי (הדמיה סלולרית, מבחני פונקציונליים, תכנות מחדש של תאים, וכו '.) 1-4. גישות משלוח רבות כבר דווחו, כולל microinjection, electroporation, או שימוש בסוכנים מובילים (לדוגמא., פפטידים חודרים תאים כגון TAT, שומנים) 5-7. כל טכניקה יש בדרך כלל יתרונות וחסרונות ספציפיים שעשויה להפוך את הגישות אלה מתאימים ליישומים מסוימים אך לא לאחרים. בעיות נפוצות כרוכות יעילות ירודה משלוח ו / או חוסר שליטה של כמה חומר מועבר 8,9, רעילות או השפעה פיזיולוגית מזיקה 10,11, חוסר שליטה זמנית, משלוח בכמה תאים, אך לא בכל אוכלוסייה (למשל., תוכניות microinjection) 12, ונטייה כימית מורכבת או ניסוח 11.
= "Jove_content" של> לאחרונה, פיתחנו אסטרטגית משלוח רומן שעוקפת את המגבלות הללו. אסטרטגיה זו מסתמכת על פפטיד בשם dfTAT (דימר TAT ניאון) 13. dfTAT נגזר מפפטיד חודר התאים היטב יודעים (CPP) TAT. dfTAT מכיל שני עותקי דיסולפיד ערובה של תאת שכותרתו עם tetramethylrhodamine fluorophore. למרות דמיונם, תאת וdfTAT שונה באופן משמעותי בפעילות. תאת מופנמת בדרך כלל לתאים על ידי אנדוציטוזה. זה CPP נשאר עם זאת בעיקר לכוד בתוך endosomes (זה בדרך כלל יוביל להפצת punctate של פפטיד בתוך תאים כאשר נבדקו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי). כמו TAT, dfTAT הוא endocytosed ביעילות על ידי תאים. עם זאת, dfTAT לא להישאר לכוד בתוך endosomes. במקום זאת, הוא מתווך דליפת endosomal באופן שהוא יעיל מאוד. פעילות endosomolytic של dfTAT אז ניתן לנצל כדי לספק מקרומולקולות על ידי assay דגירה פשוט.
ntent "> ההבנה הנוכחית של תהליך המשלוח היא כדלקמן. dfTAT גורם macropinocytosis. כתוצאה מכך, התאים הודגרו עם dfTAT לקחת את החלבונים מסיסים, פפטידים, או מולקולות קטנות (מולקולות של עניין, משרד הפנים) נוכחים בתקשורת על ידי נוזל-שלב אנדוציטוזה (ראה איור 1). אינטראקציות בין dfTAT ומשרד הפנים אינן נחוצות עוד שני ישויות התנועה יחד במסלול endocytic. כdfTAT מגיע לסף מסוים בתוך לומן של האברונים endocytic, הוא מבטא פעילות דליפת endosomal (פרטים המולקולריים להישאר להיות מאופיין במלואו). התוכן של לומן של האברונים דולפים, ולכן משרד הפנים, הוא שוחרר לאחר מכן לתאים. גישה זו היא אפוא מאוד נוחה כמו שאף תוכניות נטיה או ניסוח עם משרד הפנים נדרשות. יתר על כן, כי dfTAT הוא לא שינוי ישיר של משרד הפנים, הוא צריך גם לא להפריע לתפקוד MOIs פעם משלוח תאיים מושגת. בנוסף, הריכוזdfTAT משמש משלוח הוא עצמאי מזה של משרד הפנים בתקשורת. לדוגמא, ריכוז dfTAT יכול להישמר מתמיד בין ניסויים שונים כדי להבטיח יעילות לשחזור בדליפת endosomal. לעומת זאת, ריכוז של משרד הפנים בתקשורת ניתן לשנות בהדרגה כדי להשיג רמות רצויות של משרד הפנים נמסרו בcytosol.יעילות דליפת endosomal הגבוהה שהושגה עם dfTAT להפליא מזיקה לרב של התאים שנבדקו עד כה. זו הפתעה כי האברונים endocytic הם מרכיב חשוב של התאים וניתן היה לצפות כי הדליפה הדרמטית בתיווך dfTAT תהיה מלווה תגובות הסלולר מזיקות. עם זאת, תאים שטופלו להתרבות באותו קצב כמו תאים שלא טופלו ולא להציג כל שינוי משמעותי בtranscriptome. יתר על כן, משלוח ניתן לחזור תוך דקות עם יעילות משלוח לשחזור, מצביע על כך שתאים יכולים גם לסבול או להתאושש מתהליך הלידה מבלי לאבדהיכולת שלהם לאנדוציטוזה או דליפת endosomal. תגובות הסלולר עדינות עלולות להתרחש במהלך לידת dfTAT והפרטים המולקולריים של מה התגובות הללו עשויות להיות להישאר כדי להיחקר. ובכל זאת, על ידי שילוב של יעילות גבוהה, נוחות של פרוטוקולים, וחוסר הרעילות, גישת משלוח זה צריכה להוכיח מייד שימושית ביישומים מבוססי תאים רבים. הפרוטוקולים שהוצגו במסמך זה נועדו הפיכת טכנולוגיה זו נגישה לקהילת המחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SPPS: CK TATG סינתזה (TMR) (fTAT)
הערה: dfTAT מיוצר בשני שלבים: סינתזה של fTAT מונומר בסינתזה פפטיד השלב מוצקה ואחרי דיסולפיד אג"ח dimerization כדי ליצור dfTAT.
- להתנפח 500 מ"ג של שרף MBHA אמיד החלקה בdimethylformamide (DMF) בכלי SPPS 50 מיליליטר סטנדרטי עבור שעה 1.
- בצע deprotection FMOC ידי דוגרים שרף FMOC המוגן בפתרון piperidine 20% (20% בpiperidine DMF, 10 מיליליטר (0.30 mmol). לבצע צעדי deprotection פעמיים (באמצעות 1 x 5 דקות ו 1 x 15 דקות) בצעד כביסה DMF (שלב הכביסה כולל שטיפת השרף מספר פעמים בהיקף כולל של כ 150 מיליליטר של DMF והסרת הממס על ידי סינון ואקום) בין תגובות.
- לסנתז CK RKKRRQRRRG (TMR) (fTAT) על שרף MBHA אמיד החלקה. השתמש הבא FMOC מוגן חומצות אמינו: FMOC יס-אה (MTT) (רק בN-סופית), FMOC-ליס (בוק) אה, FMOC-גלאי-OH, FMOC-Arg (PBF) אה, Fmoc- GLN (TRT) אה, וFMOC-Cys (TRT) אה. לבצע את התגובה באמצעות N 2 (20 PSI) כדי להתסיס את התגובה. לבצע את כל התגובות בRT.
- לבצע כל תגובת צימוד חומצת אמינו במשך 4 שעות. לכל צימוד, להשתמש FMOC מוגן חומצת אמינו (1.2 mmol), N, N, N ', N' -Tetramethyl- O- (1 H -benzotriazol-1-י.ל) hexafluorophosphate uronium (HBTU) (0.44 גר ', 1.1 mmol ), וdiisopropylethylamine (DIEA) (0.51 מיליליטר, 3.0 mmol) מומס בDMF. בעקבות צימוד 4 שעות, לשטוף את השרף עם DMF ולבצע את צעד deprotection FMOC כמתואר בשלב 1.2.
- חזור על פעולה עד השרשרת ליניארית פפטיד של fTAT (שרשרת הפפטיד ליניארית: CKRKKRRQRRRG לא TMR) הייתה מסונתזת.
- לאחר מכן לשטוף ביסודיות באמצעות שרף DMF הראשון והבא שעם dichloromethane (DCM). יש לשטוף את השרף מספר פעמים בהיקף כולל של כ 150 מיליליטר של DMF או DCM ולהסיר את הממס על ידי סינון ואקום.
- Use MALDI-TOF כדי לאשר שיש פפטיד שהושג משקל המולקולרי הנכון.
- הפוך תערובת מטריצה על ידי הוספת 1 מ"ג של מטריצה לפתרון המורכב של 50 μl של 0.01% TFA בפתרון מים ו -50 μl של אצטוניטריל.
- כדי לאשר המוני שרשרת הפפטיד ליניארי, להשתמש חומצת α-Cyano-4-hydroxycinnamic. הפעל HPLC אנליטי של פפטיד הגולמי ולאסוף 50 μl מהחלק העליון של השיא הטהור.
- כדי להכין את המדגם לצלחת על צלחת MALDI: הוסף 8 μl של פפטיד 2 μl של פתרון המטריצה ומניחים על צלחת MALDI לייבוש באוויר או על צלחת חום 37 מעלות צלזיוס.
הערה: ארגינין ידוע להיות חומצת אמינו קשה זוג בSPPS. צימוד מוצלח הוקם על ידי ביצוע בדיקת קייזר 14 (מבחן לדוגמא, ninhydrin). בדיקה זו מאפשרת זיהוי של אמינים חופשיים שעלולות להישאר נחק על השרף. במקרה צבע כחול מזוהה (מעיד על הנוכחות של אמינים חופשיים) של צימוד,teps חוזרים.
- לCK (-NH-TMR) TATG (fTAT), לדבוק קבוצת הגנת MTT בקבוצת -amino של יס על CK TATG (-NH-MTT) עם פתרון המורכב של 1% חומצת trifluoroacetic (TFA) וtriisopropylsilane 2% (TIS) בDCM.
- כהסרה של קבוצת הגנת MTT תביא את המראה של צבע צהוב, דגירה השרף עם 20 מיליליטר של הפתרון מעל 5 דקות, לחזור על זה עד שלא צבע צהוב הוא ציין. לשטוף את השרף עם DCM וDMF שביניהם. בנוסף מאז TIS היא נבלות שהיו ללקט MTT, פעם אחת לא צבע צהוב מופיע בפתרון בנוכחות MTT.
- להוסיף פתרון נוסף עם 1% TFA בDCM (לא TIS) לשרף להבטיח לא יותר MTT הוא שהוסר ונשאר הפתרון ברור.
- ממיסים את שלושת מרכיבים: Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU, וDIEA (4, 3.9 ו -10 שקילות ביחס לסכום של שרף (במ"ג)) בDMF ולהוסיף את התערובתלשרף ולבצע O התגובה / N באמצעות N היבש 2 לספק תסיסה.
- בעקבות FMOC-deprotection ונטיית חומצת אמינו, לשטוף את השרף עם DCM ולאפשר לו להתייבש. למחשוף של הפפטיד מהשרף שלם, להוסיף תמיסה המכילה 92.5% TFA, 2.5% H 2 O, 2.5%, טופ אימג ', וethanedithiol 2.5% (EDT) (נפח כולל = 4 מיליליטר) לpeptidyl-השרף עבור 3 שעות על RT כדי להשיג deprotection הגלובלי ומחשוף מהשרף.
- לזרז את מוצרי פפטיד הגולמי באמצעות אתר אתיל נטול מים קר (Et 2 O) על ידי ניקוז הפתרון מצעד 1.6 ל -40 מיליליטר של Et 2 O, הספין הזה למטה על 4 מעלות צלזיוס ו4,000 XG למשך 20 - 25 דקות. חזור על שלב זה כדי לאפשר שטיפת המשקע עם נטול מים קרים Et 2 O.
- Resuspend משקעים במים (5 מיליליטר או עד המשקע הוא נמס לגמרי) וLyophilize. אז resuspend המוצרים שהושגו ב0.1% TFA / אצטוניטריל המימי.
<li> ביצוע ניתוח HPLC עם טור C18 אנליטיות (5 מיקרומטר, 4 x 150 מ"מ) לנתח כל פפטיד. השתמש בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה, וזיהוי ב214 ננומטר ו -550 ננומטר. - בצע HPLC למחצה preparative על עמודת 10 x 250 מ"מ C18 לטיהור פפטיד. השתמש בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה, וזיהוי ב214 ננומטר ו -550 ננומטר. לכל הריצות, להשתמש הדרגתיים ליניארי של 0.1% TFA (ממס) המימי ואצטוניטריל 90%, 9.9% מים, ושל 0.1% TFA (ב ממס).
- לאשר את הזהות הנכונה של פפטידים על ידי MALDI-TOF פי הפרוטוקול של היצרן: fTAT, מסה צפויה: 2,041.17, מסה נצפתה: 2,040.66. דיק,-K9, צפוי המוני: 1,412.97, נצפה המוני: 1,415.59. השתמש במטריצת חומצת α- cyano-4-hydroxycinnamic לMALDI-TOF.
2. תגובת חמצון: dfTAT דור
- לאוורר נאגר מלוח פוספט pH (PBS) 7.4 עבור שעה 1 (לפחות 5 מיליליטר לתגובה בהמשך).
- ממיסים fTAT (0.3 מ"ג, 1.5 x 10 -4 mmol) בAERated PBS pH 7.4 (5 מיליליטר). ודא שה- pH הוא בין 7.0-7.5 לאחר התוספת של הפפטיד. אם לא להוסיף נתרן הידרוקסידי (1 M, במרווחים קטנים 1 - 5 μl) להביא את ה- pH חזרה עד 7.4.
- הערה: החמצן המומס בPBS פועל לחמצן קבוצות תיאול על fTAT וליצור קשר דיסולפיד.
- Nutate O התגובה / N כדי לאפשר לו להגיב עד להשלמה (תשואה של 100% על סמך ניתוח HPLC). לטהר את המוצר באמצעות HPLC ההפוך-שלב ולנתח על ידי ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF) כמו בשלב 1.9. מסה צפויה: 4,080.34, נצפתה המונית: 4,084.21.
- (X10 0.71 -4 mmol) Lyophilize הטהור dfTAT וגלול במי 200 μl (ריכוז מיקרומטר = 356.3 dfTAT הטהור).
3. מדידת ריכוז dfTAT
- Resuspend aliquot של dfTAT (μl בדרך כלל 1 בהתאם לכמות של פפטיד המטוהרים) המטוהר ב149 μl של 50 מ"מ פתרון TCEP.
- הערה: בשלב זה dfTAT מצטמצם מועמית nomer fTAT לחסל את מרווה הספיגה שמתרחשת עקב הקרבה של fluorophore TMR בdfTAT (ε מקדם הכחדה של TMR בdfTAT מופחת בהשוואה לε של TMR בfTAT המופחת).
- לאפשר את המדגם כדי להגיב לכ -20 דקות (HPLC אנליטי ניתן להשתמש כדי לאשר הקמת fTAT).
- הוסף את כל הפתרון לקובט קוורץ ולמדוד את הספיגה ב 556 ננומטר.
- שימוש בחוק של באר (= εcl: ε = 91500 M -1 סנטימטר -1) כדי לחשב את הריכוז של fTAT, לקבוע את הריכוז של dfTAT, ולחלק [fTAT] על ידי שתי.
4. ניסויי משלוח סלולריים
- זרעי התאים (הלה, HDF, וכו '.) בצלחת בconfluency של 80 - 90% (לדוגמא, מנה 8 היטב או 24 גם). לגדל תאים במדיום מתאים (למשל, DMEM בתוספת 10% FBS ופן / סטרפטוקוקוס) עד 80 - confluency 90% ב37 מעלות צלזיוסאווירת humidified המכילה 5% CO 2.
- שוטפים את התאים שלוש פעמים (3X) עם PBS (על ידי הוספת 200 μl של PBS ולאחר מכן להסיר אותו שלוש פעמים).
- הפוך ריכוז עובד 5 מיקרומטר של dfTAT על ידי דילול מניות של dfTAT (במים) בNRL-15 תקשורת (ל8 גם לחלק את הנפח הכולל צריך להיות 200 μl). ריכוז של 5 מיקרומטר dfTAT מוביל לאספקה יעילה (רמה גבוהה של משלוח cytosolic בלמעלה מ -90% מתאים הנמצאים בצלחת) ברוב סוגי התאים נבדקו עד כה (איור 3). עם זאת, ריכוזים נמוכים יותר או גבוהים יותר עשויים להיות מתאימים יותר לסוגי תאים עם נטייה גבוהה או נמוכה לחדירה.
הערה על אמצעי תקשורת: NRL-15 משמשת למשלוח של dfTAT שכן הוא אינו מכיל ציסטאין אשר יכול להפחית את קשר דיסולפיד בdfTAT. עם זאת, הנתונים שלנו מצביעים על כך ששניהם DMEM הרגיל L-15 (עם ציסטאין) ויכול לשמש כאמצעי תקשורת המשלוח. L-15 מכיל חומצת אמינו ציסטאין הפחתה אבל presumab ציסטאיןly מתחמצן בתקשורת כדי ליצור ציסטין (DMEM הוא ניסח עם ציסטין). dfTAT לכן נותר בשלמותה בתקשורת אלה והמשלוח עובד באותה היעילות כמו שהושג עם nrL15. - דגירה תאים עם dfTAT (5 מיקרומטר) עם או בלי מטען (למשל., EGFP (10 מיקרומטר)) ולשמור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (זמן דגירה יכול להיות מופחת אבל dfTAT בדרך כלל דורש כ -30 עד 45 דקות כדי לגרום לדליפת endosomal ).
- לשטוף את התאים עם הפרין (1 מ"ג / מיליליטר) בL-15 (3 שוטף מומלץ) כדי להסיר dfTAT חייב קרום הפלזמה של תאים.
- דגירה תאים עם כתם גרעיני תאים אטומים, למשל., Sytox כחול, ירוק Sytox (2 מיקרומטר בNRL-15), כדי לקבוע אם קרום הפלזמה של תאים נפגעת (תאים מתים יהיו מוכתמים בזמן תאי חיים לא) על פי הפרוטוקול של היצרן.
- תאי תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (טבילת שמן 100X או אובייקטיבי 20X). תמונת dfTAT באמצעות מסנן RFP (אקס =560 ± 20 ננומטר / Em = 630 ± 35 ננומטר).
הערה: משלוח מוצלח מוביל לקרינה מפוזרת של dfTAT ברחבי התא (הערכת המסירה של חלבון או פפטיד של עניין יהיה תלויה ביישום). הכתמה של nucleoli ידי fTAT (המוצר המופחת של dfTAT עם כניסת cytosolic) יכולה לשמש כאינדיקציה לכך שהקרינה שזוהתה היא תאית. fTAT יהיה לבזות בתוך כמה שעות. בשלב זה, הקרינה של שברי השפלה תופיע כpunctate. זה לא צריך להיות מבולבל להפצת punctate שהוא ראה גם אם dfTAT נשאר לכודה ללא הצלחה בתוך endosomes (זה יכול לקרות אם dfTAT נמצא בנמוך מדי של ריכוז).
5. ריכוז ניהול ושל משרד הפנים נמסר
- זהה את הריכוז "משלוח אופטימלי" הנדרש להשגת שחרור cytosolic יעיל של dfTAT בסוג התא בשימוש. בצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי על תאים הודגרו עם increasinריכוזי גרם של dfTAT. ריכוז dfTAT האופטימלי מוגדר כריכוז המינימלי שמוביל כדי לנקות cytosolic "לפזר" הקרינה TMR בכ -100% מתאים בתרבות.
- להשתנות הריכוז של משרד הפנים בשימוש בפרוטוקול שיתוף דגירה, תוך שמירה על הריכוז של קבוע dfTAT (למשל, באמצעות ריכוז המשלוח האופטימלי של dfTAT). שינוי זמן הדגירה לשעה פחות מ 1 יכול להיות גם אפשרות לשנות את הכמות של משרד הפנים נמסרו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את ההבדל בין fTAT וdfTAT, תאי הלה מודגרת עבור שעה 1 עם כל פפטיד כדי לקבוע את ההבדל בלוקליזציה הסלולרית שלהם. ההפנמה של שני CPP של הוערכה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 2 מראה כי fTAT (20 מיקרומטר) localizes בהפצת punctate. התפלגות זו עולה בקנה אחד עם פפטיד שנותר לכוד בתוך endosomes. בניגוד לכך, אות הקרינה של dfTAT (5 מיקרומטר) מציגה חלוקה הומוגנית ברחבי cytosol והגרעין. איור 3 מראה כי חלוקת cytosolic של dfTAT הוא ציינה במספר שורות תאים השונים כולל 316 קולורדו, NIH 3T3, HaCaT, קשה transfect נוירו-2a, MCH58, קו התא הראשוני HDF, DRG-F11 וNCL-H1299. תמונות 20X מראה כי אחוז גבוה מאוד (> 80%) בצלחת להציג הפצת cytosolic של dfTAT ללא רעילות תאית (לא stainin הגרעיני הכחול Sytoxז).
כדי לקבוע אם דליפת endosomal תיווך dfTAT מספקת חלבונים גדולים לתוך cytosol של תאים. EGFP (26 KDA) נבחר כמודל חלבון. זאת, משום שהקרינה שלה יכולה לשמש כדי לזהות מסירתו לתוך התאים על ידי התבוננות הלוקליזציה של הקרינה הירוקה (המקופלת אם בצדק). כדי לעשות assay זה, EGFP וdTAT הודגרו במשך שעה 1 עם תאים, כפי שמוצגים באיור 4, EGFP מוצג cytosolic והפצת ניאון ירוק גרעינית דומה למה שרואה לdfTAT בלמעלה מ -90% מתאים ללא רעילות לצפייה.
איור 1. עיקרון מציג סכמטי של משלוח מולקולרי בתיווך dfTAT. משמאל לימין. סכמטי תערוכות משלוח סלולארי dfTAT יחד עם מטען בלתי חדיר תא. הראשון dfTAT גורם אנדוציטוזה שתוצאת uptakדואר של dfTAT יחד עם המטען לתוך שלפוחית endocytic. בשלב השני dfTAT בורח משלפוחית endocytic שגורמת לשחרור של dfTAT והמולקולה בלתי חדירה לתוך תא cytosol של תאים. Cytosol של תאי יונקים הוא סביבה מצמצמת, ולכן בdfTAT cytosol מצטמצם לעמית מונומר fTAT. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונות איור 2. הקרינה ומוארת שדה של שני תאי הלה מודגרות עם 20 מיקרומטר fTAT (פנל משמאל) ו -5 מיקרומטר dfTAT (פנל מימין) באמצעות מטרת 100X. תמונות בשחור-לבן fTAT תערוכות תאים כי התערוכה הפצת punctate הקרינה בעוד תמונות dfTAT תערוכות תאים בו מוצגות cytosolic הומוגנית וfluorescenc הגרעיני הפצת דואר. בר סולם:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. אספקה יעילה של dfTAT לתאים חיים הושגה בשורות תאים מרובות. שורות התאים שנבדקו היו הבא: הלה, NIH 3T3, קולורדו 316 וHaCaT, נוירו-2a, MCH58, HDF, DRG-F11 וNCL- H1299. תאים הודגרו עם 5 מיקרומטר dfTAT עבור שעה 1 ואחריו צעד כביסה על פי פרוטוקול וצלם. אות הקרינה זוהתה הייתה בcytosol והגרעין של תאים (פנל עליון: מטרת 20X, פנל תחתון: מטרת 100X). הכתם הגרעיני התאים בלתי חדירים Sytox הכחול שימש להערכת כדאיות תא לאחר טיפול dfTAT. ברים סולם, מטרת 20X: 50 מיקרומטר; מטרת 100X: 10 מיקרומטר."Target =" _ jove.com/files/ftp_upload/53175/53175fig3large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. dfTAT מספק EGFP ללא פגע לשורות תאים שונים. () הלה (פנל עליון) וNIH 3T3 (פנל תחתון) תאים הודגרו עם EGFP (10 מיקרומטר) וdfTAT (5 מיקרומטר) במשך שעה 1 והשלב הבא בוצעו על פי פרוטוקול. תמונות להראות חלוקה הומוגנית cytosolic הקרינה של EGFP בשתי שורות התאים. ברים סולם, 10 מיקרומטר. (ב) הלה ותאי HDF העיקריים הודגרו עם EGFP (10 מיקרומטר) וdfTAT (5 מיקרומטר) על פי פרוטוקול. תמונות 20X להראות הפצת הקרינה cytosolic הומוגנית של EGFP וdfTAT בהלה ותאי HDF העיקריים. הכיסוי (pseudocolor: לבן) מצביע על נוכחות של dfTAT (pseudocolor: סגול), EGFP (pseudocolאו: ירוק) במרחב cytosolic של שני תאי הלה וHDF. Sytox כחול (מוצג בכחול) שימש לישבנים לכדאיויות תא. ברים סולם:. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התאים המשמשים למשלוח dfTAT לא צריך להיות יותר מדי מחוברות (> confluency 90%) מאז זה עשויים להשפיע על יעילות המשלוח. התאים צריכים להיות גם בריאים: תאים מתים בתרבות יכולים לשחרר ברים אפופטוטיים עם שdfTAT יכול לקיים אינטראקציה (לדוגמא, ה- DNA מגרעינים מושפלים). זה בתורו יכול להפריע ליעילות משלוח ואת איכות ההדמיה. תאים יש לשטוף ביסודיות כדי להסיר FBS לפני הוספת dfTAT. הווה BSA בFBS יכול להיקשר לdfTAT וזה יכול להפחית את היעילות של משלוח dfTAT. שטיפות עם זאת, יש לבצע עם כוח מופרז כטיפול עלול לגרום לתאים חסיד להתנתק ממנת התרבות או לגרום מתח שגורם לendocytic הנמוכה uptake.When אספקת חלבון / פפטיד באמצעות dfTAT, מדגם פתרון מניות החלבון / פפטיד צריך להיות מספיק מרוכז כדי למנוע דילול מוגזם של NRL-15 התקשורת במהלך דגירה: למשל, הוספה על 5 - 10 μl של מדגם 200 μl NRL-15 מומלץ.
פפטידים תא חודר fluorescently שכותרתו יכולים להציג פעילות קרום-משיבוש אור-מושרה. 15 זהו המקרה לdfTAT כאשר מינוני אור בעוצמה גבוהה משמשים. זה יכול להתבטא בקרע של אברונים תאיים (למשל, endosomes, מיטוכונדריה), blebbing פני תא, ומוות של תאים. כדי למזער את ההשפעות הללו, יש להקפיד לשמור על חשיפה לאור למינימום (תנאים סטנדרטיים הנדרשים להדמיה על ידי confocal או epifluorescence נסבל בדרך כלל).
כאשר אספקת משרד הפנים כגון חלבונים, אחד מתמודד לבעיה שכל מקרומולקולה הוא ייחודי ושהכוונון עדין, כתוצאה מכך, כל ניסוי משלוח עשוי לדרוש (יותר מאשר במקרה של transfection DNA שבו המולקולות נמסרו תמיד טעון שלילי פולימר עשוי, T, G, C ו.) פתרון הבעיות לכן חשובה וצריכים להיחשב כמה היבטים.ראשית, חלבונים עם PIS נמוך מאוד יכולים להיקשר אלקטרוסטטי לdfTAT ולהשבית אותו. לעומת זאת, חלבונים גבוהים מאוד עם PIS עשויים להתחרות עם dfTAT למחייבים עם glycosaminoglycans הטעון שלילי על פני התא. זה עלול לאחר מכן להפחית אנדוציטוזה ולהפחית את ספיגת מתחת לסף endosomolytic. בשני המקרים, פתרון אפשרי לבעיה זו הוא הגדלת ריכוז dfTAT.
כפי שניתן היה לצפות, בשל נוכחותם של פרוטאזות הסלולרית (כגון cathepsins 16) לאורך מסלול endocytic, השפלה של משרד הפנים במהלך הלידה היא דאגה. בעוד dfTAT יכול לספק חלבונים שלמים, כמות החלבון שהוא באופן מלא או באופן חלקי מושפל במהלך תהליך הלידה לא הוקמה. זה שוב עניין זה משרד הפנים-תלויים ושצריך להיות במעקב בהתאם ליישום רדף.
dfTAT הוא סוכן משלוח יעיל ביותר. הבסיס המולקולרי להרמ"א הפעילות של dfTATins לא ברור עם זאת. בפרט, התכונות המבניות או כימיות הנדרשות להשגת בריחת endosomal לא זוהו. לכן כרגע לא ניתן לחזות כמה מבנה dfTAT יכול להיות שונה מבלי לשנות את יעילות משלוח. יש לנו כבר נקבע כי קשר דיסולפיד הנוכחי בdfTAT יכול להיות מוחלף על ידי מקשר שאינו מצטמצם ללא השפעות מזיקות. יחסי מבנה-פעילות נוספות נמצאים בשלבי הקמה.
הנתונים שלנו מראים שזה אפשרי כדי להקטין את זמן הדגירה של פפטיד לשעה פחות מ -1 (נמוך כמו 5 דקות שבוצעה). עם זאת, על שחרורו של dfTAT בתוך תאים לא נצפה באוכלוסייה גדולה של תאים עד כ 15-30 דקות. הדבר מצביע על כך זמן דגירה קצר עשוי להיות מספיק לאנדוציטוזה dfTAT או ספיגה סלולרית. עם זאת זמן נדרש להבשלת endosomal דרושה לבריחה dfTAT ממסלול endocytic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
References
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
