Abstract
Detecção de pequenas concentrações de moléculas até o único limite molécula tem impacto sobre áreas como a detecção precoce da doença, e estudos fundamentais sobre o comportamento das moléculas. Técnicas de detecção de moléculas individuais comumente utilizam rótulos como marcadores fluorescentes ou pontos quânticos, no entanto, os rótulos não são sempre disponível, aumentar o custo ea complexidade, e pode perturbar os eventos que estão sendo estudados. Ressoadores ópticos têm emergido como um meio promissor para detectar moléculas individuais, sem o uso de etiquetas. Atualmente, a menor partícula detectada por um sistema ressonador não plasmonically-reforçada nua óptica em solução é uma esfera de poliestireno de 25 nm 1. Nós desenvolvemos uma técnica conhecida como Bloqueio de frequência óptica Whispering Evanescent ressonador (FLOR), que pode ultrapassar esse limite e conseguir única molécula de detecção livre-label em solução aquosa a 2. Como a força do sinal escalas com o volume de partículas, o nosso trabalho representa um> 100x improvement na relação sinal-ruído (SNR) em relação ao estado actual da técnica. Aqui, os procedimentos por trás FLOR são apresentados em um esforço para aumentar o seu uso no campo.
Introduction
Experiências individuais de detecção de moléculas são úteis para reduzir a quantidade de analito usada em biossensores, para a detecção precoce da doença, e para examinar as propriedades fundamentais de moléculas 3. Tais experiências são tipicamente realizada utilizando etiquetas, no entanto, etiquetas nem sempre são possíveis de obter, para uma proteína em particular, aumentar o custo, pode perturbar os eventos a ser estudada, e pode ser inconveniente, particularmente para tempo real no local de experiências ou ponto-de- diagnóstico cuidado.
O padrão de ouro para biosensoriamento corrente livre de marcador é ressonância de plasma de superfície 4, no entanto os sistemas de ressonância de plasmon de superfície comercial tipicamente tem um limite inferior de detecção típico da ordem de nM. Recentemente, ressonadores ópticos emergiram como uma tecnologia promissora para livre-label única molécula biodetection 5. Ressonadores trabalho óptico baseado nas de longo prazo (ns) confinamento da luz 6,7. A luz é evanescentlyacoplado a estes dispositivos, normalmente através de uma fibra óptica. Quando o comprimento de onda da luz que passa através da fibra corresponde ao comprimento de onda de ressonância do ressonador, luz de forma eficiente acopla ao ressonador. Isto reflecte a luz acoplada totalmente internamente dentro da cavidade do ressonador gerando um campo evanescente na vizinhança da circunferência do ressonador. Medida que as partículas entram no campo evanescente e ligam-se ao ressoador, o comprimento de onda de ressonância do ressonador as alterações na proporção do volume da partícula 8.
Em termos de capacidade de detecção, ressoadores de microsferas têm sido anteriormente utilizados para detectar a gripe A única partículas de vírus (100 nm) 9,10. Recentemente, plasmonically-reforçada de microsferas ressonadores ópticas têm sido utilizadas para detectar soro bovino único moléculas de albumina e 11 oligonucleótidos 8-meros 12, no entanto, esta abordagem limita a área de captura da partícula de 0,3 um por de 2vício. Biossensores maiores da área de captura são ideais para maximizar a chance de detecção de partículas. Biosensoriamento tecnologias atuais baseados na solução livre de rótulo com grandes áreas de captura (> 100 mm 2) limitaram-se a detecção de partículas de poliestireno ≥ 25 nm.
Nós desenvolvemos um sistema biosensoriamento livre de marcador com base na tecnologia ressonador óptico conhecido como a frequência de travamento óptica Sussurrar Evanescentes ressonador (FLOR) 13 (Figura 1) que é capaz de detecção resolvida no tempo de moléculas individuais em solução. FLOR usa o tempo de vida do fóton longo dos ressonadores óticos microtoroid combinados com frequência de bloqueio de controle de feedback, detecção equilibrada, e filtragem computacional para detectar as pequenas partículas para baixo para moléculas de proteínas individuais. A utilização de frequência de bloqueio permite que o sistema sempre controlar o deslocamento de ressonância do microtoroid como partículas ligar, sem a necessidade de varrer ou digitalizar o comprimento de onda do laser sobregrandes intervalos. Os princípios da FLOR pode ser usado para melhorar as capacidades de detecção de outras técnicas, incluindo aprimoramento plasmonic. No que se segue, os procedimentos para a realização de FLOR são descritos.
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Protocol
1. Setup Experimental e Preparação de Amostras
- Fabricar microtoroids usando a litografia, gravura, e procedimento de fusão como descrito anteriormente 6. Fabricar microtoroids no topo de uma pastilha de silício (chip) que tipicamente têm um diâmetro maior de 80-100 um, e um diâmetro menor de 2 um.
- Descontraia-se cerca de um metro de fibra óptica monomodo (125 revestimento mm, 4,3 mm de diâmetro campo mode) a partir do seu carretel fibra.
- No meio da porção de desenrolado de fibra óptica, retirar um pequeno segmento (2,5 cm) do revestimento do polímero em torno da fibra óptica usando descascadores de fios. Nota: Esta é a porção da fibra óptica que será usado para evanescently luz par no microtoroid.
- Limpe a fibra descascada com álcool isopropílico e um fiapo livre wipe.
- Mantenha essa porção da fibra no local usando um suporte feito de fibra de grampos magnéticos.
- Diluir a fibra evaporadas para ~ 500 nm por Melting e puxando através de um maçarico de hidrogénio e dois motores passo a passo que se deslocam em direcções opostas a 60 uM / min. Posicionar a fibra óptica no interior da porção superior da chama, a qual deve ser ~ 10 mm de altura. Pare de puxar a fibra, quando a transmissão através da fibra pára flutuante, que pode ser monitorizada quer visualmente (observando a luz que é dispersa lateralmente a partir do piscar de fibras dentro e fora) ou conectando-se a fibra para um fotodiodo, que está ligada a um osciloscópio .
- Cleave uma extremidade da fibra óptica e insira-o em um adaptador de fibra nua. Coloque esta extremidade da fibra para a entrada do fotorreceptor.
- Fibra par a outra extremidade da bobina de fibra para o laser, utilizando um acoplador de fibra óptica.
- Colocar o chip microtoroid no topo de um suporte de amostras (de aço inoxidável, 37,8 mm x 6.4 mm x 3,2 mm) usando um epoxi ou fita adesiva de dupla face.
- Montar o suporte da amostra no topo de uma fase que compreende o posicionamento de um nano-posicionamento de 3 eixos (nanocube) estágio (veja lista de equipamentos) em cima de um micrômetro de 3 eixos. Executar todas as experiências em uma mesa óptica pneumaticamente isolada para minimizar as vibrações.
- Posição grosseira o chip amostra usando o micrômetro de 3 eixos.
- Alinhar o contendo microtoroid chip de paralelo para a fibra óptica utilizando o nano-posicionador. Nota: Alinhar o microtoroid dentro de uma distância de um comprimento de onda da luz de entrada (~ 633 nm). Para a visualização de usar este processo de duas colunas de imagem (tubo com a lente objectiva e da câmara, ver lista de equipamento), posicionado na parte superior e no lado do chip.
- Optimizar a polarização da luz laser dirigida através da fibra óptica utilizando um controlador de polarização em-linha (ver lista de equipamentos) com um botão para ajustar a polarização. Nota: polarização óptima é conseguida quando o mergulho medido na transmissão da fibra óptica é exibido o mais estreito. Observe este mergulho em um osciloscópio (veja o passo 2.2 para mais detalhes).
- Construiruma câmara de amostra por epoxying uma lamela de vidro sobre o estágio da amostra usando uma lâmina de vidro como um espaçador. Nota: Um gabinete de Plexiglas cobrindo toda a configuração pode ser útil para minimizar as correntes de ar. Uma pequena abertura deve ser deixada para permitir que a solução seja bombeada utilizando tubagem.
- Equilibrar termicamente suspensões ou soluções aquosas de partículas de molécula única para ≥ 1 hora num banho de água a temperatura ambiente (~ 500 mL). Nota: As amostras são diluídas para a concentração desejada em tubos de microcentrífuga utilizando os tampões associados especificados pelo fabricante, por exemplo, PBS ou HEPES. Se não forem detectados eventos de ligação, aumenta a concentração de sal do tampão de.
- Vortex partículas contendo soluções (1 ml) rapidamente para ~ 2 seg.
- Injectar as soluções contendo partículas para dentro da câmara da amostra em 1 mL / min usando uma bomba de seringa de 1 ml.
- Após a câmara de amostra preencheu, desligar a bomba de seringa.
- Aguarde 30 segundos antes de gravar dados para minimizaros efeitos das vibrações mecânicas resultantes do fluxo de fluido que pode afectar a medição.
Fecho 2. Freqüência
- Re-par do toro para a fibra óptica, movendo o suporte de amostra com o nanopositioner, porque o acoplamento será alterada devido à injecção de fluido.
- Localize o comprimento de onda de ressonância do microtoroid digitalizando o laser de entrada controlado por computador através de uma variedade de comprimentos de onda. Executar este passo, enviando um sinal de tensão da forma de onda triangular com um elemento piezoeléctrico dentro do controlador laser que regula o comprimento de onda do laser. Realizar experimentos usando luz visível (635 nm ± 2,5 nm) como há baixa absorção da luz na água neste comprimento de onda.
- Medir a transmissão de luz através da fibra óptica ligando a saída da fibra óptica para um fotorreceptor auto-equilibrado. Ligue a saída do fotorreceptor em um osciloscópio usando um cabo BNC. Observe on o osciloscópio que ao comprimento de onda de ressonância do microtoroid, a transmissão através da fibra óptica gotas.
- Anexar a saída do fotorreceptor para o principal insumo da frequência de bloqueio controlador de feedback (ver lista de equipamentos) através de um cabo.
- Execute o controlador de feedback frequência de bloqueio no modo de bloqueio automático usando pico top-of-bloqueio com uma frequência de 2 kHz dither e uma amplitude de comprimento de onda oscilação de 19 fm. Empiricamente definir as configurações proporcional-integral derivativos na janela do software usando as regras de ajuste de Ziegler-Nichols 14. Nota: Estes valores só precisa ser definido uma vez no início de todos os experimentos.
- Auto-travar o comprimento de onda do laser no comprimento de onda de ressonância do microtoroid. Faça este passo após o enchimento da câmara de amostra. Nota: Se o deslocamento do comprimento de onda é muito grande, então o controlador de feedback vai perder bloqueio e mudar automaticamente para o modo de digitalização, a fim de localizar o local de comprimento de onda de ressonância. Este occurs para comprimento de onda se desloca maior do que aproximadamente uma largura de linha (pelo menos 600 fm para todos os sistemas estudados aqui).
- Gravar a saída do controlador de realimentação a 20 kHz utilizando uma 24-bit placa de aquisição de dados. Exportar os dados como um arquivo de texto via software de aquisição de dados.
3. Processamento de Dados e Análise
- Transformada de Fourier os dados em MATLAB.
- Low passar os dados usando um filtro "-parede de tijolos" com um ponto de corte em 1 kHz para remover a freqüência exaltação imposto de 2 kHz (ver Código Suplementar Arquivo Screenshot 1).
- Computacionalmente notch filtrar os dados usando um tamanho de janela de 16 Hz. Nota: Isto é feito para remover fontes conhecidas de ruído, neste caso, 60 Hz ruído na linha eletrônica e suas harmônicas, assim 100 Hz (vindo do motorista laser) e suas harmônicas (ver Código Suplementar Arquivo Screenshot 1).
- Transformada de Fourier inversa os dados de volta para o domínio do tempo.
- Filtro Median os dados usando uma janelatamanho de 1.001 amostras (ver Código Suplementar Arquivo de tela 2).
- Localize mudanças graduais no comprimento de onda de ressonância usando o algoritmo de encontrar passo de Kerssemakers et al. 15.
- Gerar histogramas de a amplitude de cada passo de ligação.
- Calcular o tamanho de partícula usando a Eq. (1) (ver Discussão).
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Representative Results
Eventos de ligação de partícula são claramente vistas como modificações tipo degrau no comprimento de onda de ressonância do microtoroid ao longo do tempo (Figura 2A). As alturas destas etapas são mostradas como um histograma na Figura 2B. As Figuras 2-4 mostram traços representativos da ligação de exossomos (nanovesulas), esferas de sílica 5 nm e individuais humanos interleucina-2 moléculas, respectivamente. O facto de que os eventos da etapa-escala como com tamanho de partícula indica que a técnica tem sido realizada correctamente. Isto pode ser analisado por meio da geração de um histograma da altura do degrau (Figura 2B) e comparando a altura máxima observada ao passo previsões teóricas, como discutido abaixo.
Figura 1. Diagrama de Bloco de sistema de detecção de toro. A luz de um laser de diodo sintonizável é dividida w om uma parte enviada através da fibra óptica que acopla a luz para o toro e a outra porção enviado directamente para uma entrada de um fotorreceptor auto-equilibrado. A saída da fibra óptica é enviado para a segunda entrada do fotorreceptor auto-equilibrado. A saída do fotorreceptor é enviada para o controlador de feedback que modula a luz laser para localizar o valor do comprimento de onda de ressonância do microtoroid. Medida que as partículas se ligam ao toróide, os deslocamentos de frequência de ressonância. A diferença entre o comprimento de onda de laser e o comprimento de onda de ressonância do microtoroid é enviado para um controlador proporcional-integral-derivativo que permite que o laser para coincidir com o comprimento de onda da toroid tão rapidamente e tão bem quanto possível. Por favor clique aqui para ver um maior versão desta figura.
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Figura 2. Ressonância mudança de comprimento de onda ao longo do tempo como 20 nm esferas se ligar à superfície do microtoroid. (A) Deslocamento no comprimento de onda de ressonância do microtoroid ao longo do tempo como 20 nm esferas se ligar à superfície. (B) Histograma das alturas (amplitudes) de cada evento ressonância passo comprimento de onda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Ressonância mudança de comprimento de onda ao longo do tempo como exossomas individuais se ligam à superfície da microtoroid. Eventos de ligação individuais são vistos como alterações discretas (passos) no comprimento de onda de ressonância ao longo do tempo."> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Ressonância mudança de comprimento de onda ao longo do tempo como esferas de sílica de 5 nm ligar à superfície do microtoroid. As partículas aderem à superfície do toróide através de adsorção passiva. Eventos de ligação de partículas são consideradas passos discretos no comprimento de onda de ressonância do toro ao longo do tempo. Dessorção de uma partícula é visto como um passo para baixo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Ressonância mudança de comprimento de onda ao longo do tempo como a IL-2 se ligam a moléculas da superfície da microtoroid. Eventos de ligação Macromolecularessão considerados como passos discretos no comprimento de onda de ressonância ao longo do tempo. Estes passos semelhante ao aqueles na Figura 4 como os dois tipos de partículas são de tamanho mais ou menos semelhantes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como uma partícula se liga, o comprimento de onda de ressonância (λ) do toro aumenta. Se uma partícula unbinds, o comprimento de onda de ressonância correspondentemente diminui (um evento passo-baixo). O diâmetro das partículas (d) pode ser determinada através de histogramas da amplitude de cada passo de comprimento de onda. A altura de cada degrau varia de comprimento de onda, devido às variações de tamanho de partícula do ligado e devido à localização na microtoroid onde se liga a partícula. A alteração máxima no comprimento de onda de ressonância (altura passo) ocorre quando as partículas se ligam ao equador do microtoroid onde o campo eléctrico (E 0, max) é um máximo. Esta altura máxima passo (Δλ) está relacionada com o diâmetro das partículas através da Eq. (1) 8, onde a é o raio da partícula, D é uma constante dieléctrica com base no índice de refracção da partícula ligada e os seus meios de comunicação vizinhas, m V é o volume de modo light dentro do microtoroid determinada através de simulações de elementos finitos 2, e E 0 (R S) é a amplitude do campo eléctrico no equador de partícula também determinado por meio de simulações de elementos finitos:
Invertendo Eq. (1) indica que a intensidade do sinal (Δλ) com escalas de volume de partícula (A 3). O nosso factor de dieléctrico é definido como:
em que é o índice de refracção do meio circundante, e é o índice de refracção da partícula. Estimativas teóricas para a dimensão de partícula com base na equação (1), bem como histogramas e tamanho cal adicionaisculations são apresentados em 2, 16.
FLOR pode ser modificado para rastreamento mais rápido, aumentando a freqüência com que a frequência de bloqueio controlador de feedback controla o comprimento de onda da microtoroid. O procedimento de processamento de dados pode ser modificado utilizando uma média móvel em vez de um filtro mediano, e eventos de ligação podem ainda ser recuperados, no entanto, o filtro de média provoca bordas passo a ser melhor preservada. Limitações desta técnica incluem o fato de a mudança de comprimento de onda da microtoroid após a ligação da partícula depende de onde no ressonador as terras de partículas. Assim, a confirmação da ligação de uma única partícula baseia-se na geração de um histograma de muitos eventos de ligação discretos. Se não forem detectados eventos de ligação distintos, aumentando a concentração de sal do solvente ajuda.
O significado desta técnica em relação a métodos existentes é que não são necessárias etiquetas para interrogar a molécula alvo.Ligação seletiva exige, contudo, o sensor de funcionalização com anticorpos. Outras vantagens incluem o facto de, desde ressonadores microtoroid têm áreas maiores em comparação com captura de alta sensibilidade métodos de ressonância de plasmon de superfície, os eventos de ligação de partícula são mais prováveis de ocorrer. Além disso, porque FLOR não requer marcadores fluorescentes que podem photobleach, FLOR é capaz de medições longas (> 10 seg) com rápido (milissegundos) resolução de tempo.
As etapas críticas no âmbito do protocolo incluem o alinhamento do cone de fibra óptica com a microtoroid. Uma vez que o toro é imersa no líquido demasiado movimento da fibra através do líquido, pode fazer com que o cone de quebrar, terminando assim o experimento. FLOR na sua formulação atual é, portanto, inadequado para experiências com a escala de tempo de horas. Além disso, uma vez que o microtoroid foi imerso em líquidos e partículas se ligam, o fator de qualidade (Q) cai irremediavelmente sobre uma escala de tempo de horas e pico locking pode eventualmente tornar-se instável. Nesta situação, é necessário um novo dispositivo. Porque nós hesitar nossa frequência do laser em um intervalo muito pequeno em torno do pico de ressonância, FLOR não verifica simultaneamente em todo o espectro de ressonância e, portanto, não mede mudanças no fator de qualidade em tempo real, como as partículas se ligam. Olhando para o fator de qualidade antes e após a ligação de apenas algumas partículas, nós não ver a degradação fator Q significativa. Esperamos que isso acontece porque os toros imaculadas originais têm relativamente baixo fator Q (Q carregado na água de ~ 1x10 5 -5x10 6).
Notamos que o ruído flutuação induzida por laser é subtraído para fora usando o fotorreceptor auto-equilibrado. Nós minimizamos as flutuações da fibra óptica contra o toro colocando a fibra em contacto directo o microtoroid. Além disso, se parâmetros PID não estão definidas corretamente, as flutuações aparece, ou seja, o sistema não será rápida e ACCURATEly mudanças de comprimento de onda pista. Regras de ajuste de Ziegler-Nichols pode ser usado para definir corretamente o PID Definições 14. Seguindo os procedimentos descritos aqui, deve ser possível de detectar e nanopartículas de tamanho variando de centenas de nanómetros para baixo para alguns nanómetros, incluindo moléculas biológicas únicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable diode laser | Newport | TLB-6300 | |
| Laser controller | Newport | TLB-6300-LN | |
| Frequency locking feedback controller | Toptica Photonics | Digilock 110 | |
| Auto-balanced photoreceiver | Newport | Model 2007 | |
| In-line polarization controller | General Photonics | PLC-003-S-90 | |
| 24-bit data acquisition card | National Instruments | NI-PCI-4461 | |
| Recombinant human interleukin-2 | Pierce Biotechnology | R201520 | |
| 20 nm polystyrene beads | Thermo Scientific | 3020A | |
| NanoCube XYZ Piezo Stage | Physik Instrumente | P-611.3 | |
| Optical table | Newport | VH3660W-OPT | |
| Objective lens for imaging column | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| Imaging column (adaptor tube) | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| High-Res CCD camera for imaging column | Edmund Industrial Optics | NT39244 |
References
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