Abstract
La detección de pequeñas concentraciones de moléculas hasta el límite de una sola molécula tiene impacto en áreas como la detección precoz de la enfermedad, y los estudios fundamentales sobre el comportamiento de las moléculas. Técnicas individuales de detección molécula comúnmente utilizan etiquetas como etiquetas fluorescentes o puntos cuánticos, sin embargo, las etiquetas no siempre están disponibles, aumentar el costo y la complejidad, y pueden perturbar los eventos están estudiando. Resonadores ópticos han surgido como un medio prometedor para detectar moléculas individuales sin el uso de etiquetas. Actualmente la partícula más pequeña detectada por un sistema resonador óptico no mejorada plasmonically desnudo en solución es un poliestireno esfera 25 nm 1. Hemos desarrollado una técnica conocida como frecuencia de bloqueo óptico Whispering Evanescent Resonador (FLOR) que puede superar este límite y lograr sola detección de moléculas de etiqueta libre en solución acuosa 2. Como fuerza de la señal escalas con el volumen de partículas, nuestro trabajo representa un> improveme 100xnt en la relación señal a ruido (SNR) sobre el estado actual de la técnica. Aquí los procedimientos detrás FLOR se presentan en un esfuerzo por aumentar su uso en el campo.
Introduction
Experimentos de detección de moléculas individuales son útiles para reducir la cantidad de analito utilizado en biosensores, para la detección precoz de la enfermedad, y para examinar las propiedades fundamentales de moléculas 3. Tales experimentos se realizan normalmente usando etiquetas, sin embargo, las etiquetas no siempre son posibles de obtener para una proteína particular, aumentar el costo, puede perturbar los eventos están estudiando, y puede ser un inconveniente, sobre todo por el tiempo real en el sitio experimentos o punto-de- diagnósticos de atención.
El estándar de oro actual de biosensor libre de etiquetas es resonancia de plasmón superficial 4, sin embargo los sistemas comercial resonancia de plasmón superficial tienen típicamente un límite inferior de detección típica del orden de nM. Recientemente, resonadores ópticos han emergido como una tecnología prometedora para la etiqueta libre sola molécula biodetección 5. Resonadores ópticos trabajo basado en los de largo plazo (ns) confinamiento de la luz 6,7. La luz es evanescentejunto a estos dispositivos normalmente a través de una fibra óptica. Cuando la longitud de onda de la luz que pasa a través de la fibra coincide con la longitud de onda de resonancia del resonador, de manera eficiente la luz se acopla al resonador. Esta luz acoplada refleja totalmente internamente dentro de la cavidad del resonador generar un campo evanescente en la proximidad de la circunferencia del resonador. Como partículas entran en el campo evanescente y se unen al resonador, la longitud de onda de resonancia de los cambios de resonador en proporción al volumen de la partícula 8.
En términos de capacidad de detección, resonadores de microesferas anterior se han utilizado para detectar solo la influenza A partículas de virus (100 nM) 9,10. Recientemente, resonadores ópticos mejorada plasmonically en microesferas se han utilizado para detectar el suero de albúmina bovina sola moléculas de oligonucleótidos 11 y 8-mer 12, sin embargo, este enfoque limita el área de captura de partículas de 0,3 micras por 2 devicio. Grandes biosensores zona de captura son ideales para maximizar la posibilidad de detección de partículas. Las tecnologías actuales basados en soluciones de etiqueta libre de biosensores con grandes (> 100 m 2) zonas de captura se han limitado a la detección de partículas de poliestireno ≥ 25 nm.
Hemos desarrollado un sistema biosensor etiqueta gratuito basado en la tecnología resonador óptico conocido como Frecuencia Bloqueo óptico Whispering Evanescent Resonador (FLOR) 13 (Figura 1) que es capaz de detectar de resolución temporal de las moléculas individuales en solución. FLOR utiliza la larga vida útil de fotones de resonadores ópticos microtoroid combinados con una frecuencia de bloqueo de control de retroalimentación, detección equilibrada, y filtrado de cómputo para detectar partículas pequeñas a moléculas de proteínas individuales. El uso de la frecuencia de bloqueo permite que el sistema para rastrear siempre la resonancia desplazamiento de la microtoroid como partículas se unen, sin la necesidad de barrer o escanear la longitud de onda láser sobregrandes rangos. Los principios de la FLOR pueden utilizarse para mejorar las capacidades de detección de otras técnicas que incluyen la mejora plasmónica. En lo que sigue, se describen los procedimientos para realizar FLOR.
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Protocol
1. Configuración experimental y la preparación de muestras
- Fabrique microtoroids utilizando la litografía, el grabado, y el derretimiento de procedimiento que el descrito anteriormente 6. Fabricar microtoroids en la parte superior de una oblea de silicio (chip) que típicamente tienen un diámetro mayor de de 80-100 micras, y un diámetro menor de 2 micras.
- Relájese más o menos un metro de la fibra óptica monomodo (125 revestimiento m, 4,3 m de diámetro modo de campo) de su carrete de fibra.
- En el centro de la porción desenrollada de la fibra óptica, tira de un pequeño segmento (2,5 cm) del recubrimiento de polímero alrededor de la fibra óptica utilizando pelacables. Nota: Esta es la parte de la fibra óptica que se utilizará para evanescente de luz par en el microtoroid.
- Limpie la fibra despojado con alcohol isopropanol y un trapo que no suelte pelusa.
- Mantenga esta parte de la fibra en su lugar usando un soporte de fibra hecha de abrazaderas magnéticas.
- Delgado la fibra despojado a ~ 500 nm por melting y tirando usando un soplete de hidrógeno y dos motores paso a paso que se mueven en direcciones opuestas a 60 m / min. Coloque la fibra óptica dentro de la porción superior de la llama, que debe ser ~ 10 mm de altura. Deje de tirar la fibra cuando la transmisión a través de la fibra se detiene fluctuante, que puede ser monitoreada, ya sea visualmente (mirando la luz que se dispersa lateralmente desde el abrir y cerrar de fibra de encendido y apagado) o mediante la conexión de la fibra a un fotodiodo que está unido a un osciloscopio .
- Cleave un extremo de la fibra óptica y la inserta en un adaptador de fibra desnuda. Coloca este extremo de la fibra en la entrada del fotorreceptor.
- Fibra acoplar el otro extremo del carrete de fibra para el láser mediante el uso de un acoplador de fibra óptica.
- Coloque el chip microtoroid en la parte superior de un soporte de muestra (acero inoxidable, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) utilizando epoxi o cinta de doble cara.
- Montar el soporte de la muestra en la parte superior de una etapa de posicionamiento que comprende de un 3-eje nano-posicionamiento (nanocube) etapa (ver lista de equipo) en la parte superior de un micrómetro de 3 ejes. Realizar todos los experimentos sobre una mesa óptica neumática aislado para minimizar las vibraciones.
- Posición aproximada del chip muestra utilizando el micrómetro de 3 ejes.
- Alinear la que contiene microtoroid-chip paralelo a la fibra óptica usando el nano-posicionador. Nota: Alinear el microtoroid dentro de una distancia de una longitud de onda de la luz de entrada (~ 633 nm). Para la visualización de este proceso de usar dos columnas de imagen (tubo con lente objetivo y la cámara, ver la lista de equipo) colocado en la parte superior y en el lado del chip.
- Optimizar la polarización de la luz láser dirigido a través de la fibra óptica que utiliza un controlador de polarización en línea (ver lista de equipo) con un mando para ajustar la polarización. Nota: la polarización óptimo se consigue cuando el dip medido en la transmisión de la fibra óptica aparece el más estrecho. Observar esta inmersión en un osciloscopio (consulte el paso 2.2 para más detalles).
- Construiruna cámara de muestra por epoxying un cubreobjetos de vidrio sobre la etapa de la muestra usando un portaobjetos de vidrio como un espaciador. Nota: Un recinto de plexiglás que cubre toda la configuración puede ser útil para minimizar las corrientes de aire. Una pequeña abertura debe dejarse para permitir la solución para ser bombeada en el uso de tubos.
- Térmicamente equilibre suspensiones de partículas o soluciones acuosas de una sola molécula de ≥ 1 hora en un baño de agua RT (~ 500 ml). Nota: Las muestras se diluyeron a la concentración deseada en tubos de microcentrífuga utilizando los buffers asociados especificados por el fabricante, por ejemplo, PBS o HEPES. Si no se detectan eventos de unión, aumentar la concentración de sal del tampón.
- Partícula Vortex contiene soluciones (1 ml) brevemente durante ~ 2 seg.
- Inyectar las soluciones de partículas que contiene en la cámara de muestra a 1 ml / min utilizando una bomba de jeringa 1 ml.
- Después de la cámara de la muestra ha llenado, apague la bomba de jeringa.
- Espere 30 segundos antes de la grabación de datos para reducir al mínimolos efectos de las vibraciones mecánicas que resultan de flujo de fluido que puede afectar a la medición.
2. Frecuencia de bloqueo
- Re-acoplar el toroide a la fibra óptica moviendo el soporte de la muestra con el nanopositioner, debido a que el acoplamiento se verá perturbada debido a la inyección de fluido.
- Ubicar la longitud de onda de resonancia de la microtoroid mediante el escaneo de láser de entrada controlada por ordenador a través de una variedad de longitudes de onda. Realice este paso mediante el envío de una señal de tensión de forma de onda triangular de un elemento piezoeléctrico dentro del controlador de láser que regula la longitud de onda del láser. Realizar experimentos usando la luz visible (635 nm ± 2,5 nm), ya que es baja absorción de la luz en el agua en esta longitud de onda.
- Medir la transmisión de la luz a través de la fibra óptica conectando la salida de la fibra óptica en una fotorreceptor auto-equilibrado. Enchufe la salida del fotorreceptor en un osciloscopio mediante un cable BNC. Observar on el osciloscopio que en la longitud de onda de resonancia de la microtoroid, transmisión a través de la fibra óptica gotas.
- Conecte la salida del fotorreceptor a la entrada principal de la frecuencia de bloqueo de controlador de realimentación (ver lista de equipo) a través de un cable.
- Ejecute el controlador de realimentación de frecuencia de bloqueo en el modo de bloqueo automático usando el pico más alto de bloqueo con una frecuencia de oscilación de 2 kHz y una amplitud de onda de oscilación de 19 fm. Empíricamente establecer la configuración proporcional-integral-derivados en la ventana del software usando reglas de ajuste de Ziegler-Nichols 14. Nota: Estos valores sólo deben fijarse una vez al comienzo de todos los experimentos.
- Auto-bloqueo de la longitud de onda del láser a la longitud de onda de resonancia de la microtoroid. Realice este paso después de llenar la cámara de muestra. Nota: Si el cambio de longitud de onda es demasiado grande, entonces el controlador de realimentación perderá bloqueo y cambia automáticamente a modo de exploración con el fin de localizar la ubicación de longitud de onda de resonancia. Este occurs de longitud de onda desplaza más grande que aproximadamente una anchura de línea (al menos 600 fm para todos los sistemas investigados aquí).
- Registre la salida del controlador de retroalimentación a 20 kHz usando una tarjeta de adquisición de datos de 24 bits. Exportar los datos como un archivo de texto a través del software de adquisición de datos.
3. Procesamiento de Datos y Análisis
- Transformada de Fourier de los datos en MATLAB.
- Paso Bajo los datos utilizando un filtro de "ladrillo-pared" con un corte a 1 kHz para eliminar la frecuencia de oscilación impuesto de 2 kHz (ver Código Suplementario Captura de pantalla 1 archivo).
- Muesca Computacionalmente filtrar los datos utilizando un tamaño de ventana de 16 Hz. Nota: Esto se hace para eliminar las fuentes conocidas de ruido, en este caso, 60 Hz ruido en la línea electrónica y sus armónicos, además de 100 Hz (viniendo desde el controlador de láser) y sus armónicos (ver Código Suplementario Captura de pantalla 1 archivo).
- Fourier transformada inversa de los datos de nuevo en el dominio del tiempo.
- Filtro de mediana de los datos utilizando una ventanatamaño de 1.001 muestras (ver Código Suplementario de pantalla 2 archivos).
- Busque cambios de paso en la longitud de onda de resonancia utilizando el algoritmo paso a la búsqueda de Kerssemakers et al. 15.
- Generar histogramas de la amplitud de cada etapa de unión.
- Calcular el tamaño de partícula medio de la ecuación. (1) (ver Discusión).
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Representative Results
Eventos de unión de partículas se ven claramente como cambios de paso-como en la longitud de onda de resonancia de la microtoroid lo largo del tiempo (Figura 2). Las alturas de estos pasos se muestran como un histograma en la Figura 2B. Figuras 2-4 muestran trazas representativas de la unión de los exosomas (nanovesículas), perlas de sílice 5 nm y solteras humanos interleucina-2 moléculas, respectivamente. El hecho de que los eventos escalonadas escala con el tamaño de las partículas muestra que la técnica se ha realizado correctamente. Esto puede ser analizado mediante la generación de un histograma de alturas de escalón (Figura 2B) y la comparación de la altura máxima de paso observado que las predicciones teóricas, como se discute a continuación.
Figura 1. Diagrama de bloques del sistema de detección de toroide. La luz de un láser de diodo sintonizable es dividida w ITH una porción enviado a través de la fibra óptica que las parejas luz en el toroide y la otra porción enviado directamente a una entrada de un fotorreceptor auto-equilibrado. La salida de la fibra óptica se envía a la segunda entrada del fotorreceptor auto-equilibrado. La salida del fotorreceptor se envía al controlador de retroalimentación que modula la luz de láser para localizar el valor de la longitud de onda de resonancia de la microtoroid. Cuando las partículas se unen a la toroide, los cambios de frecuencia de resonancia. La diferencia entre la longitud de onda del láser y la longitud de onda de resonancia de la microtoroid se envía a un controlador proporcional-integral-derivado que permite que el láser para que coincida con la longitud de onda del toroide lo más rápido y lo más suavemente posible. Por favor, haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
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Figura 2. Resonancia cambio de longitud de onda en el tiempo como perlas de 20 nm se unen a la superficie de la microtoroid. (A) Cambio en la longitud de onda de resonancia de la microtoroid con el tiempo como perlas de 20 nm se unen a la superficie. (B) Histograma de las alturas (amplitudes) de cada evento de paso de longitud de onda de resonancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Resonancia cambio de longitud de onda en el tiempo como exosomas individuales se unen a la superficie de la microtoroid. Eventos de unión individuales se ven como cambios discretos (pasos) en la longitud de onda de resonancia a través del tiempo."> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Resonancia cambio de longitud de onda en el tiempo como perlas de sílice 5 nm se unen a la superficie de la microtoroid. Las partículas se adhieren a la superficie de la toroide a través de la adsorción pasiva. Eventos de unión de partículas son vistos como pasos discretos en la longitud de onda de resonancia del toroide con el tiempo. La desorción de una partícula es visto como un paso hacia abajo. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Resonancia cambio de longitud de onda en el tiempo como IL-2 moléculas se unen a la superficie de la microtoroid. Eventos de unión macromolecularesson vistos como pasos discretos en la longitud de onda de resonancia con el tiempo. Estos pasos son similares a los de la Figura 4 como los dos tipos de partículas son de un tamaño más o menos similar. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Como una partícula se une, la longitud de onda de resonancia (λ) del toroide aumenta. Si una partícula desenlaza, la longitud de onda de resonancia disminuye correspondientemente (un evento de bajada). El diámetro de partícula (d) se puede determinar a través de histogramas de la amplitud de cada paso de longitud de onda. La altura de cada paso de longitud de onda varía debido a las variaciones de tamaño de la partícula atado y debido a la ubicación en la microtoroid donde la partícula se une. El cambio máximo en la longitud de onda de resonancia (altura de los escalones) se produce cuando las partículas se unen en el ecuador del microtoroid donde el campo eléctrico (E 0, max) es un máximo. Esta altura máxima paso (Δλ) está relacionado con el diámetro de las partículas a través de la ecuación. (1) 8, donde a es el radio de la partícula, D es una constante dieléctrica basado en el índice de refracción de la partícula unida y sus medios de comunicación de los alrededores, m V es el volumen de modo light dentro de la microtoroid determina a través de simulaciones de elementos finitos 2, y E 0 (r s) es la amplitud del campo eléctrico en el ecuador de partícula también se determina por medio de simulaciones de elementos finitos:
La inversión de la ecuación. (1) indica que la intensidad de señal (Δλ) con escalas de volumen de la partícula (a 3). Nuestro factor de dieléctrico se define como:
donde es el índice de refracción de los medios de comunicación de los alrededores, y es el índice de refracción de la partícula. Estimaciones teóricas para tamaño de partícula basada en la ecuación (1), así como histogramas y tamaño de cal adicionalesculations se presentan en 2, 16.
Flor puede ser modificado para el seguimiento más rápido al aumentar la frecuencia a la que la frecuencia de bloqueo controlador de realimentación un seguimiento de la longitud de onda de la microtoroid. El procedimiento de procesamiento de datos se puede modificar mediante el uso de una media móvil en lugar de un filtro de mediana, y los acontecimientos de unión todavía se puede recuperar, sin embargo, el filtro de mediana provoca bordes paso a ser mejor conservados. Las limitaciones de esta técnica incluyen el hecho del cambio de longitud de onda del microtoroid tras la unión de las partículas depende de en qué parte del resonador de las tierras de partículas. Por lo tanto, la confirmación de la unión de una sola partícula se basa en la generación de un histograma de muchos eventos de unión discretos. Si no se detectan eventos de unión distintas, aumentando la concentración de sal del disolvente ayuda.
La importancia de esta técnica con respecto a los métodos existentes es que no se requieren etiquetas para interrogar a la molécula diana.Unión selectiva sin embargo, requiere la funcionalización del sensor con anticuerpos. Otras ventajas incluyen el hecho de que desde resonadores microtoroid tienen áreas de captura más grandes en comparación con los métodos de resonancia de plasmón de superficie de alta sensibilidad, eventos de unión de partículas son más probable que ocurra. Además, debido a FLOR no requiere etiquetas fluorescentes que pueden fotoblanqueador, flor es capaz de largos mediciones (> 10 seg) con rápida (milisegundo) resolución de tiempo.
Los pasos críticos en el protocolo incluyen la alineación de la cinta por fibra óptica con la microtoroid. Una vez que el toroide se sumerge en un líquido demasiado movimiento de la fibra a través del líquido, puede causar el estrechamiento de romper, poniendo así fin al experimento. FLOR en su formulación actual es, por lo tanto inadecuado para experimentos en la escala de tiempo de horas. Además, una vez que el microtoroid se ha sumergido en el líquido y las partículas se unen, el factor de calidad (Q) cae irremediablemente sobre una escala de tiempo de hora y pico de lómo bloquear el tiempo puede volverse inestable. En esta situación se requiere un nuevo dispositivo. Porque Dither nuestra frecuencia láser en un rango muy pequeño alrededor del pico de resonancia, FLOR no analiza de forma simultánea en todo el espectro de resonancia y por lo tanto no mide los cambios en el factor de calidad en tiempo real, ya que las partículas se unen. Mirando el factor de calidad antes y después de la unión de las pocas partículas, no vemos una degradación significativa del factor Q. Esperamos que esto se debe a que los toroides vírgenes originales tienen relativamente bajo factor Q (carga Q en el agua del ~ 1x10 5 -5x10 6).
Tomamos nota de que el ruido de fluctuación inducida por láser se resta a cabo usando el fotorreceptor auto-equilibrado. Minimizamos las fluctuaciones de la fibra óptica contra el toroide colocando la fibra en contacto directo el microtoroid. Además, si los parámetros PID no se establecen correctamente, aparecerán las fluctuaciones, es decir, el sistema no rápidamente y accurately cambios de longitud de onda de la pista. Reglas de sintonía de Ziegler-Nichols se pueden utilizar para ajustar correctamente el PID settings 14. Siguiendo los procedimientos descritos aquí, debe ser posible detectar y nanopartículas de tamaño que varía de cientos de nanómetros hasta unos pocos nanómetros, incluyendo moléculas biológicas individuales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable diode laser | Newport | TLB-6300 | |
| Laser controller | Newport | TLB-6300-LN | |
| Frequency locking feedback controller | Toptica Photonics | Digilock 110 | |
| Auto-balanced photoreceiver | Newport | Model 2007 | |
| In-line polarization controller | General Photonics | PLC-003-S-90 | |
| 24-bit data acquisition card | National Instruments | NI-PCI-4461 | |
| Recombinant human interleukin-2 | Pierce Biotechnology | R201520 | |
| 20 nm polystyrene beads | Thermo Scientific | 3020A | |
| NanoCube XYZ Piezo Stage | Physik Instrumente | P-611.3 | |
| Optical table | Newport | VH3660W-OPT | |
| Objective lens for imaging column | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| Imaging column (adaptor tube) | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| High-Res CCD camera for imaging column | Edmund Industrial Optics | NT39244 |
References
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