Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הערכה של הפעלת תא Perigenital רגישות וערמונית תורן במודל עכבר של הפרדה אימהית עובריים

Published: August 13, 2015 doi: 10.3791/53181
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center

Summary

אנו מודדים הפעלת perigenital מכאנית רגישות ותורן תא בערמונית של C57BL / 6 עכברי זכרים שעברו הפרדיגמה מתח בתחילת חיים - הפרדה אימהית יילודים, על מנת לגרום למודל פרה-קליני של תסמונת ערמונית כרונית / כרוני כאבים באגן.

Abstract

ערמונית כרונית / תסמונת כאב כרונית באגן (CP / CPPS) יש שכיחות לאורך חיים של 14%, והוא אבחון האורולוגים הנפוץ ביותר עבור גברים מתחת לגיל 50, ובכל זאת היא הפרעת כאבי אגן לפחות הבינה ולמד כרונית. משנה משמעותי של חולים עם כאבי אגן כרוני דו"ח שחווה מתח מוקדם חיים או התעללות, אשר במידה ניכרת יכול להשפיע על התפקוד והרגולציה של ציר ההיפותלמוס בלוטת יותרת המוח-יותרת הכליה (HPA). הפעלת תא פיטום, שהוכחה להיות מוגבר בשני השתן והביעה הפרשות של הערמונית של חולים / CPPS CP, מוסדרת באופן חלקי על ידי הפעלה במורד הזרם של ציר HPA. הפרדה אימהית יילודים (NMS) הייתה בשימוש כבר למעלה משני עשורים ללמוד את התוצאות של מתח בתחילת חיים במודלים של מכרסמים, לרבות שינויים בציר HPA והרגישות קרביים. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש בNMS כמודל פרה-קליני של CP / CPPS בC57BL / 6 עכברי זכרים. אנו מתארים את המתודולוגיהלביצוע NMS, הערכת אלודיניה perigenital המכנית, וראיות היסטולוגית של הפעלת תא פיטום. כמו כן אנו מספקים ראיות לכך שלחץ פסיכולוגי מוקדם יכול להיות השפעות ארוכות טווח על המערכת ואברי המין הגברית בעכברים.

Introduction

כאבי אגן כרוניים הוא לא בעצמו מחלה, אלא לטווח הקשורים לכאב המתמשך הספונטני ו / או עורר של חולים שאובחנו עם תסמונת מעי רגיז (IBS), דלקת שלפוחית ​​השתן / תסמונת שלפוחית ​​השתן כואבת ביניים (IC / PBS), vulvodynia, או ערמונית כרונית / תסמונת כאב כרונית באגן (CP / CPPS). תסמונות אלה לעתים קרובות נלווים וחולקים מאפיינים רבים שבאין להם פתולוגיה קשורה או אטיולוגיה הבסיסית מזוהה, למרות בעיות בתפקוד במערכת החיסונית, מערכת עצבים מרכזית, ומערכת עצבים היקפית הוכחו לתרום לתחזוקה וההתקדמות של הפרעות אלה 1 -3. חולים עם כאבי אגן כרוניים נוטים יותר להציג עם סימפטומים של נוסף, הפרעות תפקודיות כאב והפרעות במצב רוח, כולל חרדה, דיכאון, והפרעת פאניקה 4-6, אשר נקשרה עם תפקוד שינה של hypothalamic- שאינו קשור-אגן- pituitary-ציר יותרת הכליה (HPA) 7-10. חשיפה ללחץ חיים מוקדם או טראומה מהווה גורם סיכון משמעותי לפיתוח הפרעות HPA ותסמונות כאב כרוניים קשורות 10,11 ו, כאמורים, משנה משמעותי של חולים עם הפרעות כאבי אגן פונקציונליות מדווח על אירועי ילדות שליליים כגון התעללות או הזנחה חווה 12-14.

מודלים של מכרסמים של הפרדת ילוד אימהית (NMS), הכולל הסרת הגורים מסכרם לתקופה קצובה של זמן במהלך תקופת preweaning, שימשו במשך שני העשורים האחרונים כדי ללמוד את התוצאות של מתח בתחילת חיים. באופן כללי, NMS הוכח להגדיל הפעלת HPA ציר, והתנהגויות כמו חרדה-תוצאה, ישירות על ידי המשפיע על ביטוי גנים בהיפותלמוס, כמו גם שיבוש רגולציה במורד הזרם ממבנים הלימבית 15-18. שיבוש תפקוד ציר HPA הנכון הוכח לתרום למעי גס עלה 19-22 16 רגישות המוצגת על ידי מודלים NMS מכרסמים, אך למרות אפיון נרחב של ההשפעה לטווח הארוך של דלקת בשלפוחית ​​השתן לאחר לידה 23-25, את ההשפעה של לחץ בתחילת חיים במידה רבה הלכה לא נחקרה באיברים ואברי המין. לכן, המחקר הבא יתאר כיצד לבצע NMS בעכברים, ולאחר מכן להעריך רגישות perigenital מכאנית וחדירת תא תורן / הפעלה בערמונית כדי לאמת את השימוש בעכברי NMS גבריים כמודל פרה-קליני עבור CP / CPPS.

של כל הפרעות כאבי אגן אובחנו כרוניות, CP / CPPS היא אולי תסמונת לפחות מוכרת היטב ומאופיינת, למרות שיש שכיחות לאורך חיים של כ 14% -26 ועלויות מטופל שנתיות נאמדו ב$ 4400 (כפול מזו של כאב גב תחתון או שגרונית דלקת פרקים 27). חולים עם CP כאב דו"ח / CPPS בחיץ הנקבים, רקטום, ערמונית, איבר מין, אשכים, ו / או 28 בטן, לחוות הייתוארן גר בלחץ פסיכולוגי בהשוואה לחולי שליטת 29, ובהווה נפוץ עם סימפטומים של או אובחן עם הפרעות נלוות כרוניות אגן כאב או מצב רוח 5,29-31. זיהום חוזר ונשנה, האפיתל הדולף, דלקת עצבית, ואוטואימוניות יש כל שיערו כגורמים אפשריים הבסיסיים של CP / CPPS 2,32,33, כמו גם הפעלת תא פיטום וdegranulation 34. הפרשות של הערמונית הביעו מהגברים עם CP / CPPS עלו רמות tryptase תא פיטום וגורם גדילה עצבית (NGF) 34, ומחקר מאוחר יותר אישר כי tryptase וקרבוקסיפפטידאז (CPA3), סמן של הפעלת תא פיטום, גם הוגדלו ב שתן של חולי CP / CPPS 35. התפקיד הפוטנציאלי לתאי פיטום בתחילה והתחזוקה של CP / CPPS היה מוקד עיקרי של מחקר בבעלי חיים בתסמונת זו עד כה. המודל המכרסם הנפוצה ביותר מועסק בשימוש ללמוד CP / CPPS הוא ערמונית אוטואימוניות ניסיונית (EAP) המודל generated על ידי הזרקה תת עורית של אנטיגן הערמונית באדג'ובנט של פרוינד המלא, מה שגורם בדרגות שונות של דלקת ערמונית תלוי במין וזן המשמש 34,36-39. חדירת תא פיטום והפעלה / degranulation הוכח להגדיל אינדוקציה של EAP 34,35,40 הבאה. עכברים מהונדסים חסרים או תאי פיטום 34 או קולט tryptase 35 PAR2 לא לפתח רגישות ערמונית טקטיקה הבאה EAP, בניגוד לעכברי EAP wildtype. בעוד מודל פרה-קליני זה משכפל רב של המאפיינים של CP האדם / CPPS, פרוטוקול האינדוקציה הוא לא מעיד על מצבו של האדם, שבו יש אטיולוגיה מגוונת ולעתים קרובות אינו כרוכות דלקת ישירה, זיהום או פציעה של הערמונית.

ההשפעה של מתח בתחילת חיים על התפתחות CP / CPPS בבני אדם במידה רבה הלכו נחקרת; עם זאת, מחקר על ידי הו, et al. 41, הוכיח כיn שדיווח על היסטוריה של ילדות פיזית, רגשי, ו / או התעללות מינית היתה באופן משמעותי סיכוי גבוה יותר לחוות סימפטומים המעידים על CP / CPPS. יתר על כן, הם הראו כי הן כאב ועשרות שתן היו גבוהים יותר בחולים עם היסטוריה של התעללות פיזית ורגשית. אנחנו הוכחנו בעבר כי באותו הפרדיגמה NMS בC57BL / 6 נקבות עכברים מייצרת רגישות יתר בנרתיק וביטוי גנים לא תקין בשני נרתיק ושלפוחית ​​שתן מרמז על תפוקת ציר HPA מתפקד 16. עדות זו בשילוב עם השכיחות הגבוהה של CP חולים / CPPS הצגה עם מחלות רקע אחרים 42, כוללים IC / PBS והפרעות במצב רוח, שברורים יותר הוכחו להיות מקושר עם חשיפת מתח חיים המוקדמים 12-14, מספקת רציונל לשימוש ב מודל NMS לחקור CP / CPPS בעכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה תואמים את הנחיות NIH בהתאם להנחיות שצוינו על ידי המרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

1. הפרדת ילודים אימהית (NMS)

  1. צג סכרים בהריון יומי ללידות המלטה.
    הערה: יום ההמלטה נולדה נחשבת P0.
  2. על P1, להסיר את הסכר מהכלוב בבית ואת המקום לתוך מיכל המשני נקי.
  3. לשפשף את קומץ המצעים בין ידיים בכפפות נקיות כדי לשמור על ריח של הכלוב בבית.
  4. להוסיף עומק של 1 - 2 סנטימטר של מצעי כלוב בבית לנקי, כראוי שכותרת 2 כוס זכוכית L. להוסיף כמחצית מכל חומר נוסף להעשרת מצעים שנמצא בכלוב בבית, למשל, נייר nestlet, להתקמט, לכוס הזכוכית.
  5. מניח בעדינות את כל הגורים מהמלטה אחת, בנפרד, באותו הכוס.
  6. מייד למקוםהכוס בחממה שנערכה בלחות 33 מעלות צלסיוס ו -50% עבור 180 דקות.
  7. הסר את הסכר מיכל המשני ולהחזיר אותה לכלוב בבית. להחזיר את הכלוב בבית למיקום הדיור המתאים בתוך ביבר.
  8. חזור על תהליך זה עבור כל המלטה עוברת NMS, באמצעות כפפות נקיות ומכולות המשניות עבור כל המלטה / סכר.
  9. בסוף תקופת ההפרדה 180 דקות, להחזיר את ההמלטות לכלובים בביתם באותו סדר כפי שהם הוסרו.
  10. אחזר את הכלוב בבית של ההמלטה הראשונה שהופרדה מוקדם יותר ביום. הסר את הסכר מהכלוב בבית ואת המקום לתוך מיכל המשני נקי.
  11. הסר את הכוס הראשונה מהחממה ולשפשף קומץ של מצעים בין ידיים בכפפות נקיות כדי לשמור על ריח של הכלוב בבית בזמן טיפול הגורים.
  12. בעדינות להזיז את הגורים, בנפרד, מהכוס לכלוב בבית.
  13. לחזור כל העשרה ומצעים שנותר בכוס להכלוב בבית.
  14. להחזיר את הסכר מיכל המשני לכלוב בבית ולהחזיר אותו למיקום הדיור המתאים בתוך ביבר.
  15. יש לשטוף את הכוס עם מים ולהחזיר אותו לחממה. השתמש באותה כוס לכל המלטה לאורך כל הליך ההפרדה.
  16. חזור על תהליך זה עבור כל המלטה עוברת NMS באותו סדר כפי שהם הושמו באינקובטור.
  17. חזור על הליך כל זה עבור כולם מצויה המלטה NMS כל יום דרך P21.
  18. לגמול את גורי NMS ונאיביים על P22 על ידי הצבת המלטה מאותו המין יחד בכלובים נקיים מלאים במזון ובמים. צריכים להיוולד גורים נאיביים ושוכנו באותם תנאים כמו עכברי NMS, אבל לא לעבור טיפול נוסף מחוץ למשימות גידול בעלי חיים נורמלים.

2. Perigenital מכאני רגישות

  1. התקנת מכשירי פון פריי
    1. להביא את העכברים לחדר הבדיקות ולאפשר להם להסתגל ל30דקות בעוד שנותרו בכלובים בביתם.
    2. הכן את אזור הבדיקה על ידי הצבת underpad סופג מתחת שולחן מוגבה רשת תיל העליון (79 סנטימטרים X 28 סנטימטרים) שמספק מספיק מקום על מנת לאפשר לחוקר להתקרב מן החלק התחתון בלי להבהיל את העכברים, כ 55 סנטימטר בגובה.
    3. הנח עד 12 עכברים, בנפרד, תחת תאי פלסטיק שקופים, מחוררים (11 סנטימטרים X 5 סנטימטרים X 3.5 סנטימטרים) בחלק העליון של טבלת רשת תיל. מניחים חפץ כבד על גבי התאים כדי למנוע עכברים לברוח.
    4. להסתגל לעכברים 30 דקות נוספות על המסך לפני הערכת סף נסיגה.
  2. הערכת Perigenital מכאנית רגישות
    1. בצע את השיטה למעלה למטה באמצעות סט סטנדרטי של monofilaments פון פריי המדורג 43. השתמש בmonofilaments הבא: 1.65 גר ', 2.36 גר', 2.83 גר ', 3.22 גר', 3.61 גר ', 4.08 גר', 4.31 גר ', וגרם 4.74.
      1. החזק את הבסיס של monofilament גרם 3.22 ולחשוף את מונו חזר בונימה.
        הערה: בדגמים מסוימים לא יכולים להיות חוט חד חזר.
      2. למקם את החללית כדי שהחוט חד הוא בכיוון אנכי וכאשר העכבר הוא ערני, חסר תנועה, ומשקל הגוף שלה מחולק באופן שווה בין רגליו האחוריות להחיל אותו אל צד ימין או השמאל של כיס האשכים, הימנעות קו האמצע, עד קל העיקול הוא ציין בנימה.
      3. החזק את החוט חד במקום במשך 10 שניות או עד שהחיה מראה תגובה חיובית.
        הערה: תגובה חיובית נחשבת לאידיוט או לקפוץ נמרצים בתגובה לבקשת monofilament או ליקוק או נשיכת התנהגות המכוונת לחוט חד. אם מהלכי העכבר במהלך יישום monofilament 10 שניות מבלי להציג התנהגויות אלו, monofilament יש הערכה מחדש לאחר תקופה שאר 1 דקות ארוכות מינימום. אם עכבר לא מהלכים ולא מציג כל מעל התנהגויות המופיעות ביישום monofilament 10 שניות, זה נחשב תגובה שלילית.
      4. רשום את התגובה, שלילי או חיובי, במחברת מעבדה או מחשב נייד ולחזור על הליך זה על כל העכברים שנותרו באמצעות החוט חד 3.22 גר '.
      5. לבדוק את כל העכברים שוב באמצעות החוט חד המתאים הבא. הערה: אם העכבר הציג תגובה שלילית לmonofilament 3.22 גר ', להחיל את החוט חד 3.61 גר', באותו אופן ולהקליט את התגובה. אם העכבר הציג תגובה חיובית לmonofilament 3.22 גר ', להחיל את החוט חד 2.83 גר' ולהקליט את התגובה.
    2. המשך בדיקה של כל עכבר באמצעות החוט חד גדול יותר או קטן יותר הבא, כפי שמתאים, ל4 אפליקציות נוספות לאחר התשובה החיובית הראשונה הוא ציינה.
    3. חזור עכברים בכלובים הביתה.
    4. השתמש בשווי של החוט חד פון פריי הסופי שיושם בסדרת המשפט ביחידות יומן לחשב 50% סף נסיגה גרם כפי שמתואר בet al Chaplan. 43.
כותרת "> 3. מכתים תא acidified toluidine הכחול הפיטום

  1. עיבוד רקמות
    1. לנתח רקמת ערמונית 44 מעכברים שכבר perfused intracardially עם paraformaldehyde 4% קרים כקרח 45. Postfix הרקמה paraformaldehyde 4% עבור שעה 1 ב RT ואז cryoprotect בסוכרוז 30% ב1x PBS על 4 מעלות CO / N.
    2. הכן אמבט (30 מיליליטר) קטן של heptane ולמקם אותו על קרח יבש.
    3. יש לשטוף את רקמת הערמונית ב1x PBS ולייבש באמצעות אור החובה למחות.
    4. הכנס את רקמת הערמונית לheptane הקר עד שהוא קפוא.
    5. מייד למקם את רקמת הערמונית הקפואה בcryomold מכיל תקשורת ומקום לתלייה על קרח יבש עד שקפא.
    6. חנות cryomolds ב -20 ° C.
    7. רוחבי לחתוך את רקמת הערמונית ל7 cryosections מיקרומטר עבה באמצעות cryostat.
    8. הנח 8-12 cryosections אינו סידורי כי היקף האורך של הרקמה, על גבי שקופיות מיקרוסקופ חיובי טעונים.
    9. חנות סיימה שקופיות ב -20 ° C עד עיבוד נוסף.
  2. הכנת acidified toluidine הכחול
    1. להוסיף 1 גרם של toluidine הכחול O 100 מיליליטר 70% אתנול ו מערבולת עד בפתרון להכין פתרון מניות 1%. פתרון המניות יכול להיות מאוחסן על RT עד שלושה שבועות.
    2. הוסף 1 גרם NaCl למים 100 מיליליטר בכוס מונחת על גבי צלחת ומערבבים.
    3. התאם את ה- pH של תמיסת NaCl באמצעות 12 M HCl עד טווח pH של 0.5-1.0 מושגת.
    4. הכן את פתרון toluidine הכחול 0.25% עובד על ידי שילוב של 8 מיליליטר של פתרון מניות toluidine הכחול ו -32 מיליליטר של 1% פתרון NaCl. פיפטה מעלה ומטה כדי להבטיח שילוב כולל של פתרון מניות toluidine הכחול ומערבבים בעזרת מערבולת. הפתרון עובד חייב להיעשות טרי ומושלך לאחר השימוש.
  3. מכתים cryosections הערמונית
    1. הסר את השקופיות להיות מעובד מהמקפיא ולאפשר לאזן לRT לכ -30 מ 'ב.
    2. שטוף את חלקי רקמות על ידי בנפרד טבילת השקופיות עבור כ 1 שניות לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל נפח מספיק של 1x PBS על מנת להבטיח כי סעיפי רקמות רכוב שקופיות יהיו שקועים לחלוטין. לאפשר שקופיות לאוויר יבשות במגבת נייר.
    3. מגלשות מקום בצנצנת מכתימה זכוכית המכילה 0.25% פתרון toluidine הכחול עובד מספיק כדי להבטיח שסעיפי רקמות רכוב שקופיות יהיו שקועים לחלוטין ודגירה במשך 10 - 15 דקות ואילו על כיסא נדנדה פלטפורמה נקבעה על 15 סל"ד.
    4. טובלים שקופיות ב1x PBS כ 1 שניות כדי לשטוף את עודף toluidine הכחול.
    5. מניחים שקופיות בתיבת שקופיות או מדף בצורה כזו כי השקופיות על צדם, כדי לאפשר ניקוז.
    6. ייבש את השקופיות בתנור על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 2 שעות או O / N ב RT.
    7. מייבשים שקופיות באמצעות אלכוהול במהירות, מה שמאפשרים את השקופיות להתייבש לחלוטין בין חשיפות אלכוהול. מגלשות יבשים על ידי ניקוז על מגבת ניירND גב וקצות מנגב עם אור חובה למחות.
      1. לטבול את השקופיות ב -95% EtOH כ 1 שניות ולאפשר לו להתייבש לחלוטין. חזור על תהליך זה 1 - 10 פעמים עד שהרקמה מתייבשת יותר כחולה יותר מסגול.
      2. לטבול את השקופיות בEtOH 100% לכ 1 שניות ולאפשר לו להתייבש לחלוטין. חזור על תהליך זה 1 - 10 פעמים עד שהרקמה היא כהה לכחול בינוני, אבל לא סגולה.
    8. תקן את הכתם על ידי דוגרים שקופיות קסילן 100% במשך 3 דקות. לאפשר לו להתייבש.
    9. Coverslip השקופיות עם גליצרול, PBS, או תקשורת הרכבה קבועה מבוסס קסילן. מסננים תקשורת וחנות עודפות בRT.
  4. תאי פיטום כימות
    1. דמיינו את סעיפי רקמות כחולים-הצבעוניים toluidine בהגדלה 20X באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 2).
    2. לספור את המספר הכולל של תאי הפיטום הנוכחיים בתחום דמיין ולהבדיל בין תאי פיטום הלא degranulated וdegranulated. מגניפיקט 40Xיון עשוי להיות נחוץ כדי לאשר מעמד פרור בכמה תאי פיטום.
      הערה: תאי פיטום ללא degranulated תערוכה metachromasia הצפוף עם קלוש אין או מתווה גרעינית ו / או לא חול גרגירים סביב התא. תאי פיטום Degranulated התערוכה metachromasia פחות אינטנסיבי ויש לי מתווה ברורה ברורה של הגרעין ו / או גרגירים חופשיים בתוך הציטופלסמה ומחוץ לגבול התא.
    3. תמשיך להעריך את המספר הכולל של תאי פיטום הלא degranulated וdegranulated בשלמות של סעיף הרקמה הנוכחי. חזור על הליך זה על לפחות 7 סעיפים נפרדים נוספים, המשתרע לכל האורך כל רקמה.
    4. חישוב אחוזי degranulated (DG) לסך תאי פיטום לכל רקמה / עכבר על פי המשוואה הבאה: (תאי פיטום DG / תאי פיטום סה"כ) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עכברים שעברו NMS הראו ראיות התנהגותיות מעידות על CP / CPPS. כאשר נבדק עם סדרה מדורגת של monofilaments פון פריי, עכברי NMS 8 שבוע-ישנים (n = 4) מוצג אלודיניה המכנית perigenital בהשוואה לעמיתיהם נאיביים (n = 5, איור 2). עדות לכך שהפחתה משמעותית (p <0.01; מבחן t) בסף הנסיגה המכני שעורר תגובה התנהגותית חיובית, נרשם כאידיוט נמרץ או לקפוץ בתגובה לבקשת monofilament או ליקוק או התנהגות נשיכה מופנה כלפי monofilament .

עכברים שנחשפו לNMS מוצגים גם ראיות היסטולוגית של CP / CPPS. סעיפי cryostat של רקמת ערמונית הוכתמו o-toluidine acidified הכחול להתבונן גרגרי tryptase שוכנים בתוך תאי פיטום (איור 3 א-ד). אחוז תאי פיטום שהראה ראיות להפעלה, לדוגמא, metachroma מפוזרSIA, גרגירים מחוץ נוכחי של גבול התא (איור 3D), הוגדל באופן משמעותי ברקמת ערמונית מעכברי NMS 8 שבועות בן, בהשוואה לנאיבי (p <0.0001, מבחן t, איור 3E). המספר הכולל של תאי פיטום הסתננו, ללא קשר למעמד פרור, לא היה שונה באופן משמעותי בין נאיבי (99.5 ± 15.2 תאים / סעיף) ועכברים NMS (108.2 ± 22.5 תאים / סעיף).

איור 1
איור 1. קו זמן פרוצדורלי. סכמטי מתאר קו זמן מומלץ לביצוע המתודולוגיה שתוארה. הפרדה בילוד אימהית (NMS) מתבצעת מדי יום מהיום (P) לאחר הלידה 1 עד P21 ועכברים נגמלים על P22. עכברים יישארו ללא הפרעה מחוץ לגידול בעלי חיים נורמלים עד 8 שבועות של גיל שבו הם נבחנים לsens המכני perigenitalitivity. אם אותו העכברים הולכים להיות מוערכים למכתים תא פיטום, יש לאפשר שבוע לחלוף בדיקות התנהגותיות הבאות כדי לאפשר לכל תופעות מתח שיורי כדי לפתור.

איור 2
2. רגישות מכאנית איור Perigenital רגישות מכאנית. Perigenital נמדדה באמצעות יישום monofilament פון פריי. עכברי זכרים שעברו הפרדה בילוד אימהית (NMS) מוצגים הפחתה משמעותית בסף נסיגה, בהשוואה לעכברים נאיביים, מעידים על אלודיניה המכנית. הנתונים מייצגים SEM ממוצע, n = 4 לכל קבוצה. * P <0.05, מבחן t.

איור 3
toluidine איור 3. הפעלת תא פיטום. acidified הכחול שימש לדמיין גרגרי tryptase ולחשב את אחוז מופעלים תאי פיטום degranulated / בסעיפים cryostat של רקמת ערמונית. photomicrographs נציג מוצג סעיפים toluidine מוכתמים כחולים מנאיבי (א) ו NMS ערמונית (ב ') עם חצים המצביעים על שלמות ראשי חץ (לא degranulated) ומצביעים על תאים פעילים (degranulated) תורן. תמונות גבוהות יותר מהגדלה הנאיבי (C) וNMS שלפוחית ​​השתן (ד) מוצגים להמחשת הבדלים היסטולוגית מאינו degranulated (C) וdegranulated תאים (ד) תורן. אחוז גבוה יותר באופן משמעותי של תאי פיטום degranulated נצפה בקטעים ערמונית מעכברי NMS בהשוואה לעכברים נאיביים (E). הנתונים מייצגים SEM ממוצע, n = 4 לכל קבוצה. **** P <0.0001, מבחן t.= "_ Blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה לשימוש בלחץ בילוד, בצורה של NMS, כדי לגרום לsymptomology מעיד על CP / CPPS בעכברי זכרים בוגרים. כמבוגרים, עכברי NMS להציג אלודיניה המשמעותית perigenital המכנית, כמו גם ראיות של degranulation תא תורן ברקמת ערמונית. השימוש בNMS הוא גישה חדשנית לפיתוח מודל פרה-קליני של CP / CPPS בכך שהוא משכפל את המתח בתחילת החיים, כי הוא דיווח לעתים קרובות על ידי חולים עם כאבי אגן כרוניים 12-14, כמו גם שילוב אינדוקציה לא פולשנית, כ בניגוד לשימוש נפוץ יותר, ומערכת החיסון chemically--induced דלקת של הערמונית 34,36-39. יתר על כן, NMS בעכברים הוכח לייצר symptomology נלווה, כוללים התנהגויות כמו חרדה וanhedonic שינו, שיעורי השתנה מוגברים, וhindpaw רגישות יתר (16; מידע לא מוצג), דומה לסומטיים, מצב רוח, והפרעות נלוות קרביים הוצגו על ידי CP / patie CPPSNTS 4-6.

היתרון העיקרי של שימוש בNMS לגרום CP / CPPS בעכברים הוא שהיא משתמשת התערבות פסיכולוגית ליזום שינויים פיסיולוגיים. יש חולים עם CP / CPPS אטיולוגיה גרסה כי במידה רבה אינו כרוכה זיהום קודם של פציעה או ישירה לערמונית 1-3. למרות זאת, מודלים שפורסמו של CP / CPPS שילבו דלקת ישירה או עקיפה של הערמונית כדי לגרום לרגישות יתר של אזור perigenital ו / או הפעלת תא פיטום. חלק משמעותי של CP / CPPS וחולי כאבי אגן כרוניים באופן כללי, דו"ח שחווה מצוקת חייו מוקדמת, אשר במידה רבה הלכה לא נחקר במודלים של מכרסמים של תסמונות כאב ואברי המין. העבודה קודמת מהמעבדה שלנו הראתה כי NMS גורם לרגישות יתר בנרתיק ושיבוש הקשורים לתפקוד התקין של HPA ציר 16. עבודה בעתיד באמצעות מודל זה יהיה לחקור את המנגנונים שמונעים על ידי לחץ חיים מוקדם כדי לייצר tהוא שינה פנוטיפ בבגרות, כמו גם לחקור התערבויות תרופתיות או אורח חיים פוטנציאליות שיכול להיות מיושמות בסביבה פרה-קלינית או קלינית.

השגת תוצאות אופטימליות ודיר מפרוטוקול זה תלויה בהתבוננות כמה שלבים קריטיים שעשויות צריך להיות מותאמים בהתאם לסביבה וציוד המשמש. בהתחשב בכך שNMS דרמטי משפיע על התפקוד של ציר HPA, חשוב לשלוט על גירויים חיצוניים ולחץ סביבתי במהלך שתי תקופות בילוד ומבוגרים. צריכים להיוולד, עכברים נאיביים באותו גיל שאינן מטופלות ושוכנו בהתאמה עם כל קבוצה של עכברי NMS לשלוט ללחצים חיצוניים הנמצאים בסביבה שעשויה להשפיע על ההתפתחות של ציר HPA. חשוב לקבוע את מספר העכברים הדרושים לביצוע הניסוי המיועד לפני ייזום רבייה או הזמנת נשים בהריון למתקן בעלי החיים. NMS בעת ביצוע, greatesהדאגה t היא דחייה של הגורים על ידי הסכר, ולכן זה הכרחי כדי לשמור על הריח של הכלוב בבית לאורך כל פרוטוקול NMS. כדי למזער את ההשפעות של מקצבים היומיים, זמן ההפרדה הציע לNMS הוא באמצע מחזור האור (11:00-14:00). יש לקבל מדידות רגישות Perigenital בעכברי זכרים בוגרים באופן מלא, כ 8 שבועות של גיל, ולקחו באותו הזמן של יום, לכל קבוצה, רצוי בתחילת מחזור האור תעלה בקנה אחד עם השוקת במקצבים היומיים. כדי להפחית את התרחשותן של תנועות עוררות לא במהלך הליך זה, הערכות עשויות להתבצע ב, חדר הוכחת קול בטמפרטורה מבוקרת עם רעש לבן משחק (20 - 20,000 הרץ). אותו החוקר צריך להעריך כל ספי הנסיגה לאורך כל תקופת המחקר לשמור על עקביות בשמירה על תגובות חיוביות ושליליות. כחלופות למדידת 50% הסף מכאני, תדירות הנסיגה לcou monofilament אחתLD להעריך או מנגנון פון פריי אלקטרוני 46 יכול להיות מנוצל. להדמיה תא פיטום, כל השקופיות שכדי להיות מנותחים צריכים להיות מעובד יחד כדי להבטיח מכתים שווה של תאי פיטום, כעוצמת מכתים יכולה להשתנות בין ניסויים. PH מתחת 1.0 הוא הכרחי לניגוד ראוי בין התאים העמוקים הסגולים תורן והרקע תכלת. מדי שטיפות רבות באלכוהול יכולות לשטוף את הכתם מתאי הפיטום ולהשפיע לרעה על הניגוד. לבסוף, superimposing רשת על גבי הרקמה יכול להיות מועיל בספירת תאים לאורך כל קטע הרקמה.

כמה שיקולים צריכים להיעשות לפני השימוש בNMS לגרום CP / CPPS או הפרעות כאב מרכזי בנושא. ראשית, רובם המכריע של פרסומים ששלבו מתח חיים מוקדם נעשו במודלים של עכברים של NMS, באמצעות תקופה קטועה הפרדת P1 - P14. קבוצות רבות הראו כי פרדיגמה זו יוצרת symptomology כמו תסמונת המעי הרגיז בrATS ועכברים 15; עם זאת, במחקר הקודם שלנו P1 - תקופת הפרדת P14 בעכברי C57BL / 6 לא ליצור עלייה משמעותית ברגישות בנרתיק 16, וגם לא ליצור רגישות יתר מעי גס (מידע לא מוצג). לכן, המינים ואורך של NMS עשויים לקבוע את התוצאה הספציפית בבגרות, כוללים חומרת symptomology והאיבר הספציפי (ים) שמושפע. שנית, השינויים התנהגותיים ומולקולריים הנובעים מNMS הם במידה רבה בשל חוסר ויסות של ציר HPA 15-18, מה שמרמז כי ההשפעה היא בתיווך מרכזי ויכולה להיות תוצאות נלוות, לרבות שינויים בחרדות ו / או התנהגויות כמו דיכאון ו רגישות מוגברת באברי אגן אחרים או במקומות רחוקים יותר. פנוטיפ נלווה זה מעיד על מה שנראה לרוב קליני ויכול להיות יותר נציג של חולי CP / CPPS בכללות 5,28-31,42. שלישי, המבוסס על שינויים אלה מתרחשים כתוצאה מdysregul ציר HPAני, את ההשפעה של לחץ צריכה להיות דאגה רבה במהלך שני הליך NMS ובדיקות התנהגותיות מאוחר יותר ובניתוח מבחנה. פלט מהציר HPA הוא יומי, עם תפוקה גדולה יותר במהלך המחזור הכהה הפעיל יותר ותפוקה פחותה במהלך מחזור האור שקט יותר, שעלול להשפיע על התוצאה של התנהגות או בניתוח מבחנה תלוי בזמן של הבדיקה / להקריב 47. כמו כן, חשיפה לגורמי לחץ, כולל עובר בדיקת רגישות מכאנית perigenital, יכולה להשפיע על תפקודו של זמני HPA ציר 18 ואפשרות לשנות ביטוי גנים באזורים במוח הקשורים וברקמות היקפי במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant C57BL/6 female mice  Charles River 027 Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s) Sigma-Aldrich CLS10002L Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic VWR International 414005-124 The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) Stoelting 58011 The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats) IITC 435 Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. 
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) IITC 410 Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5493 Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose Sigma-Aldrich S5016 Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane Sigma-Aldrich 246654 Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold  VWR International 4557 To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound Sakura 4583 12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide VWR International 48311-703 75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161 Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-4 Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888 Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes  BioExpress C-3394 Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover Fisher Scientific 08-815 Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological) Fisher Scientific X3P Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place VWR International 82003 Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box Fisher Scientific 22-363-400 These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific VWR International 4111 Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 VWR International 48393-106 A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope Nikon The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
  2. Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
  3. Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
  4. Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
  5. Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
  6. Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
  7. Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
  8. Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
  9. Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
  10. Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
  11. Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
  12. Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
  13. Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
  14. Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
  15. Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
  16. Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
  17. Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
  18. Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
  19. Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
  20. Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
  21. Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
  22. Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
  23. DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
  24. Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
  25. Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18 (2011).
  26. Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
  27. Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
  28. Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
  29. Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
  30. Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
  31. Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
  32. Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
  33. Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
  34. Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
  35. Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
  36. Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
  37. Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
  38. Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
  39. Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
  40. Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
  41. Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
  42. Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
  43. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
  44. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3791 (2012).
  45. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  46. Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51212 (2013).
  47. Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).

Tags

רפואה גיליון 102 מתח דלקת ערמונית כרונית כאבי אגן כרוניים עכברים תאי פיטום אלודיניה ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-יותרת הכליה
הערכה של הפעלת תא Perigenital רגישות וערמונית תורן במודל עכבר של הפרדה אימהית עובריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fuentes, I. M., Pierce, A. N.,… More

Fuentes, I. M., Pierce, A. N., O'Neil, P. T., Christianson, J. A. Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation. J. Vis. Exp. (102), e53181, doi:10.3791/53181 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter