Summary
Vi måler perigenital mekanisk følsomhed og mastcelleaktivering i prostata af C57BL / 6 mus, der undergik en tidlig liv stress paradigme - neonatal maternal separation, for at inducere en præklinisk model af kronisk prostatitis / kronisk bækkensmerter syndrom.
Abstract
Kronisk prostatitis / kronisk bækkensmerter syndrom (CP / CPP'er) har en levetid prævalens på 14% og er den mest almindelige urologisk diagnose for mænd under 50 år, men det er det mindste forstået og studerede kroniske bækkensmerter lidelse. En væsentlig undergruppe af patienter med kroniske bækkensmerter rapport have oplevet tidligt i livet stress eller misbrug, som kan påvirke markant funktion og regulering af hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) aksen. Mastcelleaktivering, hvilket har vist sig at blive forøget i både urin og udtrykt prostatasecerneringer af CP / CPP patienter, er delvist reguleret af nedstrøms aktivering af HPA-aksen. Neonatal maternal separation (NMS) er blevet anvendt i mere end to årtier at studere resultaterne af tidlige liv stress i gnavermodeller, herunder ændringer i HPA-aksen og visceral følsomhed. Her giver vi en detaljeret protokol for brug af NMS som en præklinisk model af CP / CPP'er hos mandlige C57BL / 6 mus. Vi beskriver metodentil udførelse af NMS, vurderer perigenital mekanisk allodyni og histologiske tegn på mastcelleaktivering. Vi tilbyder også dokumentation for, at tidlig psykologisk stress kan have langvarige effekter på den mandlige urogenitale system hos mus.
Introduction
Kroniske bækkensmerter ikke i sig selv en sygdom, men snarere en sigt er forbundet med den igangværende spontan og / eller fremkaldt smerte oplevet af patienter diagnosticeret med irritabel tarmsyndrom (IBS), interstitiel cystitis / smertefuld blære syndrom (IC / PBS), vulvodynia, eller kronisk prostatitis / kroniske bækkensmerter syndrom (CP / CPP). Disse syndromer er ofte komorbide og deler mange egenskaber i at de ikke har tilknyttet patologi eller identificeret underliggende ætiologi, selv er blevet vist dysfunktion i immunsystemet, centralnervesystemet, og det perifere nervesystem til at bidrage til vedligeholdelse og progression af disse lidelser 1 -3. Patienter med kroniske bækkensmerter er mere tilbøjelige til at præsentere med symptomer på yderligere, ikke-bækken-relaterede funktionelle smertelidelser og affektive lidelser, herunder angst, depression og panikangst 4-6, som er blevet associeret med ændret funktion af hypothalamus- hypofyseadrenal (HPA) aksen 7-10. Udsættelse for tidlige liv stress eller traumer er en væsentlig risikofaktor for udvikling af HPA abnormiteter og tilhørende kroniske smerter syndromer 10,11, og som sådan, rapporterer en betydelig undergruppe af patienter med funktionelle Bækkensmerter lidelser har oplevet negative barndomsoplevelser begivenheder såsom misbrug eller forsømmelse 12-14.
Gnaver modeller af neonatal maternal separation (NMS), som indebærer fjernelse af hvalpe fra deres mor for en fastsat periode i løbet af før fravænning periode, er blevet brugt til de sidste to årtier til at studere resultaterne af tidlige liv stress. Generelt har NMS vist sig at øge HPA-akse-aktivering, og resulterende angst-lignende adfærd, ved direkte at påvirke genekspression i hypothalamus, samt forstyrrer nedstrøms regulering fra limbiske strukturer 15-18. Afbrydelse af korrekt HPA akse funktion har vist sig at bidrage til øget kolorektal 19-22 16 følsomhed vises af gnaver NMS modeller, men trods omfattende karakterisering af den langsigtede effekt af postnatal blære betændelse 23-25, har effekten af tidlige liv stress stort set gået unstudied i urogenitale organer. Derfor vil følgende undersøgelse beskriver, hvordan du udfører NMS i mus og senere evaluere perigenital mekanisk følsomhed og mast celle infiltration / aktivering i prostata for at validere brugen af mandlige NMS mus som en præklinisk model for CP / CPP'er.
Af alle de diagnosticerede kroniske bækkensmerter lidelser, CP / CPP'er er måske den mindst velkendt og karakteriseret syndrom, trods en langtidsprævalens på ca. 14% 26 og årlige patient omkostninger anslås til $ 4400 (det dobbelte af lændesmerter eller rheumatoid arthritis 27). Patienter med CP / CPP rapport smerter i mellemkødet, rektum, prostata, penis, testikler, og / eller maven 28, opleve en hiGher grad af psykologisk stress end kontrolpatienter 29, og almindeligt til stede med symptomer på eller er diagnosticeret med komorbide kroniske bækkensmerter eller humørsvingninger 5,29-31. Tilbagevendende infektion, utætte epitel, neurogen inflammation, og autoimmunitet er alle blevet formodet som potentielle underliggende årsager til CP / CPP 2,32,33 samt mastcelleaktivering og degranulering 34. Udtrykte prostatasecerneringer fra mænd med CP / CPP var steget mastcelletryptase og nervevækstfaktor (NGF) niveauer 34, og en senere undersøgelse bekræftede, at tryptase og carboxypeptidase A (CPA3), en markør for mastcelleaktivering, blev også forøget i urin fra CP / CPP patienter 35. Den potentielle rolle for mastceller i indtræden og opretholdelse af CP / CPP har været et stort fokus for animalsk forskning på dette syndrom hidtil. Den mest almindeligt anvendte gnaver-model anvendes til at undersøge CP / CPP er en eksperimentel autoimmun prostatitis (EAP) model genbejdede ved subkutan injektion af prostata antigen i Freunds komplette adjuvans, hvilket resulterer i forskellige grader af prostata inflammation afhængig af art og stamme anvendes 34,36-39. Mast celle infiltration og aktivering / degranulation har vist sig at stige efter induktion af EAP 34,35,40. Transgene mus mangler enten mastceller 34 eller tryptase receptor PAR2 35 ikke udvikler prostata taktik følsomhed efter EAP modsætning vildtype EAP mus. Mens dette prækliniske model replikerer mange af de særlige kendetegn ved den menneskelige CP / CPP'er, induktion protokollen er ikke udtryk for den menneskelige tilstand, som har en varieret ætiologi og ofte involverer ikke direkte inflammation, infektion eller skade af prostata.
Indflydelsen af tidlige liv stress på udvikling af CP / CPP hos mennesker er stort set gået ikke undersøgt; Men en undersøgelse fra Hu, et al. 41, viste, at mign som rapporterede en historie af barndommen fysiske, følelsesmæssige og / eller seksuelle overgreb var signifikant mere tilbøjelige til at opleve symptomer på CP / CPP'er. De viste desuden, at både smerte og urinveje scoringer blev øget hos patienter med en historie af fysisk og følelsesmæssig misbrug. Vi har tidligere vist, at den samme NMS paradigme i kvindelig C57BL / 6 mus producerer vaginal overfølsomhed og unormal genekspression i både vagina og blære antyder dysfunktionel HPA-akse-udgang 16. Dette beviser kombineret med den høje forekomst af CP / CPP'er patienter med andre co-morbiditet 42, herunder IC / PBS og humørsvingninger, der er mere tydeligt vist sig at være forbundet med tidlige liv stress eksponering 12-14, giver rationalet for at bruge en NMS model til at undersøge CP / CPP i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg er beskrevet i denne protokol i overensstemmelse med NIH retningslinjer i overensstemmelse med de retningslinjer, der er angivet af University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Neonatal Maternal Separation (NMS)
- Overvåg gravide moderdyr dagligt for strøelse fødsler.
Bemærk: Den dag kuldet er født anses P0. - På P1, fjerne dæmningen fra hjemmet bur og anbringes i en ren sekundær beholder.
- Gnid en håndfuld strøelse mellem rene-behandskede hænder til at opretholde duft af hjemmet bur.
- Tilføj en dybde på 1 - 2 cm i hjemmet bur strøelse i en ren, passende mærket 2 L bægerglas. Tilsæt ca. halvdelen af yderligere berigelse strøelse, der er til stede i det oprindelige bur, f.eks nestlet, crinkle papir, til bægerglas.
- Forsigtigt placere alle hvalpene fra et enkelt kuld, enkeltvis, i samme bæger.
- Umiddelbart placererbægerglasset i en inkubator holdt ved 33 ° C og 50% fugtighed i 180 minutter.
- Fjern dæmningen fra den sekundære beholder og returnere hende til hjemmet bur. Returnere hjem bur under den relevante boliger placering i terrariet.
- Gentag denne procedure for hver kuld undergår NMS, ved hjælp af rene handsker og sekundære beholdere for hvert kuld / dæmning.
- Ved afslutningen af den 180 min separation periode returnere kuld til deres bure i samme rækkefølge, som de blev fjernet.
- Hente hjemmet bur af det første kuld, der blev skilt fra tidligere på dagen. Fjern dæmningen fra hjemmet bur og anbringes i en ren sekundær beholder.
- Fjern det første bæger fra inkubatoren og gnid en håndfuld strøelse mellem rene behandskede hænder til at opretholde duft af hjemmet bur mens håndtering hvalpene.
- Bevæge sig forsigtigt hvalpene individuelt fra bægeret til hjemmet bur.
- Returnere eventuelle berigelse og strøelse er tilbage i bægeret tilhjemburet.
- Retur dæmningen fra den sekundære beholder til hjemmet bur og returnere det til sin passende bolig placering i terrariet.
- Skyl bægerglasset med vand og returnere den til inkubatoren. Bruge det samme bægerglas for hvert kuld hele separation procedure.
- Gentag denne procedure for hver kuld undergår NMS i samme rækkefølge, som de blev placeret i inkubatoren.
- Gentag hele denne procedure for hver kuld undergår NMS hver dag gennem P21.
- Vænne NMS og naive unger på P22 ved at placere søskende af samme køn sammen i rene bure komplet med mad og vand. Naive unger skulle fødes og husede under de samme betingelser som NMS mus, men undergår ingen yderligere håndtering uden for normal dyrehold opgaver.
2. Perigenital Mechanical Følsomhed
- von Frey Apparatur Setup
- Bring musene til test værelse og give dem mulighed for at akklimatisere sig i 30min mens de resterende i deres hjem bure.
- Forbered testområdet ved at placere et absorberende underlag under en forhøjet trådnet-top table (79 cm x 28 cm), der tilvejebringer tilstrækkelig plads til at tillade investigator at nærme fra undersiden uden overraskende musene, ca. 55 cm i højden.
- Placere op til 12 mus individuelt efter klare, perforerede plast kamre (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) oven på trådnet tabel. Placer en tung genstand oven på kamrene for at forhindre mus i at undslippe.
- Akklimatisere musene i yderligere 30 min på skærmen før tilbagetrækningstærskel vurdering.
- Perigenital Mechanical Følsomhed Assessment
- Udføre op-ned metoden under anvendelse af et standardsæt af sorterede von Frey-monofilamenter 43. Brug følgende monofilamenter: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g og 4,74 g.
- Hold bunden af 3,22 g monofilamenter og eksponere den tilbagetrukne monofilament.
Bemærk: Nogle modeller har måske ikke en tilbagetrukket monofilament. - Placere sonden så monofilamentet er vertikalt orienteret og når musen er vågen, immobile, og dens kropsvægt er fordelt ligeligt mellem bagpoterne anvende det til enten venstre eller højre side af pungen, undgå midterlinjen, indtil en svag bøjning observeres i filament.
- Hold monofilamenter på plads i 10 sekunder, eller indtil dyret viser en positiv reaktion.
Bemærk: En positiv reaktion anses for at være en rask ryk eller hoppe som reaktion på monofilament ansøgning eller slikning eller bidende adfærd rettet mod monofilament. Hvis musen bevæger sig i løbet af 10 sek monofilament ansøgning uden at vise disse adfærdsmønstre, skal monofilament testes igen efter minimum 1 min lange hvileperiode. Hvis en mus hverken flytter eller udviser nogen af ovennævnte adfærd under 10 sek monofilament ansøgning, anses det for et negativt svar. - Optage svaret, enten negativ eller positiv, i en notesbog eller laptop lab og gentage denne procedure på alle de resterende mus ved hjælp af 3,22 g monofilament.
- Test alle musene igen med den næste relevante monofilament. Bemærk: Hvis musen udviste en negativ reaktion på 3,22 g monofilament, anvende 3,61 g monofilament på samme måde og registrere svaret. Hvis musen udviste en positiv reaktion på 3,22 g monofilament, anvende 2,83 g monofilamenter og optage svaret.
- Hold bunden af 3,22 g monofilamenter og eksponere den tilbagetrukne monofilament.
- Fortsæt teste hver mus ved hjælp af den næste større eller mindre monofilament givet fald yderligere 4 ansøgninger efter den første positive reaktion observeres.
- Retur mus til hjem bure.
- Bruge værdien af den endelige von Frey monofilamenter anvendt i forsøget serie i log-enheder til at beregne en tærskel på 50% g tilbagetrækning som beskrevet i Chaplan et al. 43.
- Udføre op-ned metoden under anvendelse af et standardsæt af sorterede von Frey-monofilamenter 43. Brug følgende monofilamenter: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g og 4,74 g.
- Vævsbehandling
- Dissekere prostatavæv 44 fra mus, der er blevet intracardialt perfunderet med iskold 4% paraformaldehyd 45. Postfix vævet i 4% paraformaldehyd i 1 time ved stuetemperatur og derefter cryoprotect i 30% saccharose i 1 x PBS ved 4 ° CO / N.
- Forbered en lille (30 ml) bad heptan og placere den på tøris.
- Skyl prostata væv i 1x PBS og tørres under anvendelse af en let arbejde tørre.
- Indsæt prostata vævet ind i kold heptan, indtil den er frosset.
- Umiddelbart placere frosne prostata væv i en kryoformen indeholder montering medier og sted på tøris indtil frosset.
- Store cryomolds ved -20 ° C.
- Tværs skære prostata væv i 7 um tykke kryosnit bruger kryostat.
- Placer 8-12 ikke-serielle kryosektioner, der spænder over længden af vævet, på positivt ladede mikroskopobjektglas.
- Opbevares færdige dias ved -20 ° C indtil videre forarbejdning.
- Forberedelse Forsuret toluidinblåt
- Tilsæt 1 g toluidinblåt O til 100 ml 70% ethanol og vortex indtil i opløsning for at fremstille en 1% stamopløsning. Stamopløsningen kan opbevares ved stuetemperatur i op til tre uger.
- Tilsæt 1 g NaCl til 100 ml vand i et bægerglas anbragt oven på en omrøringsplade.
- Justere pH af NaCl-opløsning ved anvendelse af 12 M HCI indtil en pH på 0,5 - 1,0 opnås.
- Forbered toluidinblåt arbejdsopløsning 0,25% ved at kombinere 8 ml toluidinblåt stamopløsning og 32 ml af 1% NaCl-opløsning. Pipettere op og ned for at sikre total inkorporering af toluidinblåt stamopløsningen og blandes under anvendelse af en vortex. Arbejdsgruppen opløsning skal lavet frisk og kasseres efter brug.
- Farvning Prostata kryosnit
- Fjern objektglassene skal forarbejdes fra fryseren og lad det ækvilibrere til stuetemperatur i ca. 30 mi.
- Vask vævssnit ved individuelt at dyppe slides i ca. 1 sek I et 50 ml konisk rør indeholdende en tilstrækkelig mængde af 1 x PBS at sikre, at slide monterede vævssnit vil være helt nedsænket. Tillad slides til luft tørre på et stykke køkkenrulle.
- Glassene anbringes i et glas farvning beholder indeholdende nok 0,25% arbejder toluidinblåt løsning for at sikre, at glideren monterede vævssnit vil være helt nedsænket og inkuberes i 10 - 15 minutter, medens på en platform rocker på 15 rpm.
- Dip objektglassene i 1x PBS til ca. 1 sek at udvaske overskydende toluidinblåt.
- Placere objektglassene i et dias boks eller et rack på en sådan måde, at dias er på deres sider for at tillade dræning.
- Tør dias i en ovn ved 37 ° C i mindst 2 timer eller O / N ved stuetemperatur.
- Dehydrere slides hurtigt ved hjælp af alkohol, så de slides til helt tørre mellem alkohol engagementer. Tørre slides ved afdrypning på et stykke køkkenrulle ennd aftørring rygge og kanter med en let pligt tørre.
- Fordyb dias i 95% EtOH i ca. 1 sek og lad det helt tørt. Gentag denne procedure 1 - 10 gange, indtil vævet tørrer mere blå end lilla.
- Fordyb dias i 100% EtOH i ca. 1 sek og lad det helt tørt. Gentag denne procedure 1 - 10 gange, indtil vævet er mørk til medium blå, men ikke lilla.
- Fastgør pletten ved at inkubere dias i 100% xylen i 3 min. Lad det tørre.
- Coverslip dias med glycerol, PBS eller xylen-baserede permanente montering medier. Dræn overskydende medier og opbevares ved stuetemperatur.
- Kvantificering Mast Cells
- Visualisere toluidinblåt-farvede vævssnit ved 20X forstørrelse med anvendelse af lysmikroskopi (figur 2).
- Tælle det samlede antal mastceller stede i visualiseret område og skelne mellem ikke-degranulerede og degranulerede mastceller. 40X Magnification kan være nødvendigt at bekræfte granulering status i nogle mastceller.
Bemærk: Ikke-degranulerede mastceller udviser tætte metachromasia med ingen eller svag nukleare skitse og / eller ingen kornet ekstrudering omkring cellen. Degranulerede mastceller udviser mindre intens metachromasia og har en indlysende klar oversigt over kernen og / eller frie granuler i cytoplasmaet og ydersiden af cellen grænsen. - Fortsat vurdere det samlede antal ikke-degranulerede og degranulerede mastceller i hele det aktuelle vævssnit. Gentag denne procedure på mindst 7 yderligere adskilte sektioner, der spænder over længden hver vævet.
- Beregn procentdelen af degranulerede (GD) og den totale mastceller for hvert væv / mus ifølge følgende ligning: (GD mastceller / samlede mast celler) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus, der har undergået NMS viste adfærdsmæssige beviser indikerer CP / CPP. Når det testes med en gradueret serie af von Frey-monofilamenter, 8 uger gamle NMS mus (n = 4) vises perigenital mekanisk allodyni sammenlignet med naive modstykker (n = 5, figur 2). Dette fremgår som en signifikant reduktion (p <0,01; t-test) i den mekaniske tilbagetrækningstærskel der fremkaldte en positiv adfærdsmæssig reaktion, registreres som en rask ryk eller hoppe som reaktion på monofilament ansøgning eller slikning eller bidende adfærd rettet mod monofilament .
Mus, som blev udsat for NMS vises også histologiske tegn på CP / CPP. Mikrotomsnit af prostata væv blev farvet med syrnet o-toluidin blå at observere tryptase granulat huses inden mastceller (Figur 3A-D). Procentdelen af mastceller, som viste tegn på aktivering, f.eks diffus metachromasia, granulat foreliggende ydersiden af cellen grænsen (figur 3D), blev signifikant forøget i prostatavæv fra 8 uger gamle NMS mus, sammenlignet med naive (p <0,0001, t-test, fig 3E). Det samlede antal infiltrerede mastceller, uanset granulering status, var ikke signifikant forskellig mellem naive (99,5 ± 15,2 celler / afsnit) og mus (NMS 108,2 ± 22,5 celler / afsnit).
Figur 1. Proceduremæssig tid linje. Den skematiske skitserer en anbefalet tid linje for at udføre den beskrevne metode. Neonatal maternal separation (NMS) udføres dagligt fra postnatal dag (P) 1, indtil P21 og mus er vænnet på P22. Mus forbliver uforstyrret uden for normal dyrehold indtil 8 uger, når de testes for perigenital mekaniske sensitivity. Hvis den samme mus vil blive vurderet for mastcelle-farvning, bør en uge have lov til at forløbe efter adfærdstestning at muliggøre eventuelle resterende stress effekter skal løses.
Figur 2. Perigenital mekanisk følsomhed. Perigenital mekanisk følsomhed blev målt ved hjælp af von Frey monofilament ansøgning. Hanmus, der undergik neonatal maternel separation (NMS) udviste en signifikant reduktion i tilbagetrækningstærskel, sammenlignet med naive mus, indikerer mekanisk allodyni. Data repræsenterer middelværdien SEM, n = 4 for hver gruppe. * P <0,05, t-test.
Figur 3. Mast celleaktivering. Syrnet toluidinblåt blev anvendt til at visualisere tryptase granulat og beregne procentdelen af aktiverede / degranulerede mastceller i cryostatsektioner af prostatavæv. Repræsentative mikrofotografier er vist af toluidinblåt-farvede snit fra naive (A) og NMS (B) prostata med pile, der viser intakte (ikke-degranulerede) og pilespidser angiver aktiverede (degranulerede) mastceller. Højere forstørrelse billeder fra naive (C) og NMS (D) blære er vist for at illustrere histologiske forskelle fra ikke-degranulerede (C) og degranulerede (D) mastceller. En signifikant højere procentdel af degranulerede mastceller blev observeret i prostata sektioner fra NMS mus sammenlignet med naive mus (E). Data repræsenterer middelværdien SEM, n = 4 for hver gruppe. **** P <0,0001, t-test.= "_ Blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver metode til at bruge neonatal stress, i form af NMS, at fremkalde symptomologi tegn på CP / CPP'er i voksne hanmus. Som voksne, de NMS mus viser betydelig perigenital mekanisk allodyni, samt bevis for mastcelledegranulering i prostata væv. Brugen af NMS er en ny tilgang til at udvikle en præklinisk model af CP / CPP ved, at den gentager det tidlige liv stress, der ofte rapporteret af patienter med kroniske bækkensmerter 12-14, samt inkorporering af et ikke-invasiv induktion, som modsætning til mere almindeligt anvendt ved kemisk og immunologisk induceret betændelse i prostata 34,36-39. Endvidere NMS i mus har vist, at producere comorbid symptomologi, herunder ændrede angst-lignende og anhedonisk adfærd, forhøjede vandladningsproblemer satser, og bagpote overfølsomhed (16; data ikke vist) i lighed med de samtidige somatiske, humør og viscerale sygdomme udvises af CP / CPP'er patieNTS 4-6.
Den væsentligste fordel ved at anvende NMS at inducere CP / CPP i mus er, at den bruger en psykologisk intervention at indlede fysiologiske ændringer. Patienter med CP / CPP har variant ætiologi, der i vid udstrækning ikke involverer tidligere infektion eller direkte skade på prostata 1-3. På trods af dette faktum, har offentliggjort modeller af CP / CPP'er indarbejdet direkte eller indirekte betændelse i prostata til at fremkalde overfølsomhed af perigenital region og / eller mastcelleaktivering. En betydelig del af CP / CPP'er og kroniske bækkensmerter smertepatienter generelt rapport har oplevet tidlige liv modgang, der har stort set gået unstudied i gnaver modeller af urogenitale smertesyndromer. Tidligere arbejde fra vores laboratorium har vist, at NMS inducerer vaginal overfølsomhed og tilhørende forstyrrelser i velfungerende HPA aksen 16. Det fremtidige arbejde ved hjælp af denne model vil undersøge de mekanismer, der er drevet af tidlige liv stress for at producere tHan ændrede fænotype i voksenalderen, samt at udforske potentielle farmakologiske eller livsstil interventioner, som kan anvendes i et præklinisk eller klinisk miljø.
Opnåelse optimale og reproducerbare resultater fra denne protokol er afhængig af at observere flere kritiske trin, der kan have brug for at være optimeret afhængigt af det miljø og udstyr, der anvendes. I betragtning af at NMS dramatisk påvirker driften af HPA-aksen, er det vigtigt at kontrollere for eksterne stimuli og miljømæssig stress under både den neonatale og voksne perioder. Alderskategori, ikke-håndteret naive mus bør født og har til huse i overensstemmelse med hver kohorte af NMS mus til at styre eksterne stressfaktorer til stede i miljøet, der kan påvirke udviklingen af HPA-aksen. Det er vigtigt at bestemme antallet af mus, der er nødvendige for at udføre den tilsigtede eksperiment før initiering avl eller bestilling drægtige hunner i dyret facilitet. Under udførelsen NMS, de greatest bekymring er afvisningen af hvalpene ved dæmningen, er det derfor bydende nødvendigt at bevare duften af hjemmet bur hele NMS-protokollen. At minimere virkningerne af døgnbestemte rytmer, den foreslåede adskillelse tid for NMS er under midten af lyset cyklus (11:00 til 02:00). Perigenital følsomhed målinger bør opnås i fuldt modne voksne hanmus, ca. 8 uger gamle, og tages på samme tidspunkt af dagen for hver gruppe, helst tidligt i lyset cyklus for at falde sammen med truget i døgnets rytmer. At reducere forekomsten af ikke-fremkaldte bevægelser under denne procedure kan udføres vurdering i et temperaturreguleret, lyddæmpet rum med hvid støj spille (20 - 20.000 Hz). Samme investigator skal vurdere alle tærskelværdier tilbagetrækning hele undersøgelsen for at bevare sammenhængen i overholdelse af positive og negative reaktioner. Som alternativ til måling af mekaniske tærskel 50%, hyppigheden tilbagetrækning til en enkelt monofilament could vurderes eller en elektronisk von Frey apparat 46 kunne anvendes. For mastcelle visualisering, skal alle objektglas, der skal analyseres behandles sammen for at sikre lige farvning af mastceller, som farvningsintensitet kan variere mellem forsøg. En pH-værdi under 1,0 er nødvendig for korrekt kontrast mellem de dybe lilla mastceller og den lyseblå baggrund. Alt for mange skylninger i alkohol kan vaske ud pletten fra mastceller og påvirke kontrasten negativt. Endelig kan overlejre et gitter på vævet være nyttige i at tælle celler i hele vævssnit.
Flere overvejelser bør gøres, inden brugen af NMS at fremkalde CP / CPP'er eller beslægtede centraliseret smerte lidelser. For det første har det store flertal af publikationer, der har inkorporeret tidlige liv stress blevet gjort i rottemodeller af NMS, ved anvendelse af en trunkeret adskillelse periode på P1 - P14. Mange grupper har vist, at dette paradigme genererer en IBS-lignende symptomologi i rATS og mus 15; men i vores tidligere undersøgelse en P1 - P14 adskillelse periode i C57BL / 6-mus ikke generere en betydelig stigning i vaginal sensitivitet 16, heller ikke generere kolorektal overfølsomhed (data ikke vist). Derfor kan de pågældende arter og længde af NMS bestemme den specifikke udfaldet i voksenalderen, herunder sværhedsgraden af symptomatologi og specifikt organ (er), der er påvirket. For det andet, de adfærdsmæssige og molekylære ændringer som følge af NMS er i høj grad skyldes dysregulering af HPA-aksen 15-18, hvilket tyder på, at effekten er centralt medieret og kunne have comorbide resultater, herunder ændringer i anxiety- og / eller depression-lignende adfærd og øget følsomhed i andre bækken organer eller mere fjerntliggende steder. Denne comorbid fænotype er vejledende for, hvad der almindeligvis ses klinisk og kan være mere repræsentative for CP / CPP'er patienter som helhed 5,28-31,42. For det tredje, er baseret på disse forandringer som følge af HPA-akse dysregulation, bør virkningen af stress være af allerstørste bekymring både under NMS procedure og senere adfærdsmæssige test og in vitro analyse. Output fra HPA-aksen er daglige, med større produktioner i det mere aktive mørke cyklus og mindre produktion i mere hvilende lys cyklus, hvilket kunne påvirke resultatet af adfærdsmæssige eller in vitro analyser afhængigt af tidspunktet for afprøvning / ofre 47. Ligeledes udsættelse for stressfaktorer, herunder undergår perigenital mekanisk følsomhed test, kan forbigående påvirke funktion HPA aksen 18 og potentielt ændre genekspression i tilknyttede områder af hjernen og downstream perifere væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant C57BL/6 female mice | Charles River | 027 | Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth. |
| 2 L glass beaker(s) | Sigma-Aldrich | CLS10002L | Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period. |
| VWR Forced Air Incubator, Basic | VWR International | 414005-124 | The incubator should be held at 33°C and 50% humidity. |
| Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) | Stoelting | 58011 | The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g. |
| Animal Enclosure (12 mice 6 rats) | IITC | 435 | Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. |
| Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) | IITC | 410 | Place stand on a stable table top for comfortable access. |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight. |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | Chill heptane on dry ice to freeze tissue. |
| Standard Cryomold | VWR International | 4557 | To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning |
| Tissue-Tek OCT Compound | Sakura | 4583 | 12 x 125 ml |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR International | 48311-703 | 75 x 25 x 1 mm |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells. |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections. |
| GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes | BioExpress | C-3394 | Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS. |
| Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover | Fisher Scientific | 08-815 | Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene. |
| Xylenes (Histological) | Fisher Scientific | X3P | Once dehydrated, tissue is cleared with xylene. |
| Microscope Slide Boxes, 100-Place | VWR International | 82003 | Boxes can be used for storage and transportation of slides. |
| Fisherbrand Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 22-363-400 | These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol is a traditional mounting medium. |
| Mounting Medium, Richard-Allan Scientific | VWR International | 4111 | Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide. |
| Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 | VWR International | 48393-106 | A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample. |
| Light Microscope | Nikon | The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E. |
References
- Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
- Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
- Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
- Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
- Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
- Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
- Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
- Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
- Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
- Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
- Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
- Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
- Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
- Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
- Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
- Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
- Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
- Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
- Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
- Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
- Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
- Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
- DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
- Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
- Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18 (2011).
- Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
- Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
- Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
- Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
- Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
- Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
- Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
- Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
- Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
- Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
- Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
- Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
- Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
- Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
- Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
- Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
- Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3791 (2012).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51212 (2013).
- Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).
