Summary
Vi mäter perigenital mekanisk känslighet och mastcellsaktivering i prostatan manliga C57BL / 6 möss som genomgick en tidig livet stressen paradigm - neonatal maternal separation, i syfte att förmå en preklinisk modell av kronisk prostatit / kronisk bäckensmärtsyndrom.
Abstract
Kronisk prostatit / kronisk bäckensmärta syndrom (CP / CPP) har en livstidsprevalens på 14% och är den vanligaste urologiska diagnos för män under 50 års ålder, men det är den minst förstådda och studerade kronisk bäckensmärta sjukdom. En betydande undergrupp av patienter med kronisk bäckensmärta rapport ha upplevt tidiga liv stress eller missbruk, som markant kan påverka funktion och reglering av hypotalamus-hypofys-binjure (HPA) axel. Mastcellaktivering, vilket har visat sig öka i både urin och uttryckta prostatasekre av CP / CPP-patienter, är delvis regleras genom nedströms aktivering av HPA-axeln. Neonatal moderns separation (NMS) har använts i över två decennier att studera resultaten av tidiga liv stress i gnagarmodeller, inklusive förändring i HPA-axeln och visceral känslighet. Här ger vi ett detaljerat protokoll för att använda NMS som en preklinisk modell av CP / CPP i manliga C57BL / 6-möss. Vi beskriver metodikenför utförande av NMS, bedöma perigenital mekanisk allodyni, och histologiska tecken på mastcellaktivering. Vi tillhandahåller också belägg för att tidigt psykisk stress kan ha långvariga effekter på den manliga urogenitala systemet hos möss.
Introduction
Kronisk bäckensmärta är inte i sig en sjukdom, utan snarare ett begrepp i samband med den pågående spontan och / eller framkallade smärta upplevs av patienter som diagnostiserats med colon irritabile (IBS), interstitiell cystit / smärtsam blåsa (IC / PBS), vulvodynia, eller kronisk prostatit / kronisk bäckensmärta syndrom (CP / CPP). Dessa syndrom är ofta samtidiga och delar många egenskaper genom att de inte har någon tillhörande patologi eller identifieras underliggande etiologi, men dysfunktion i immunsystemet, det centrala nervsystemet och perifera nervsystemet har visat sig bidra till att bevara och utvecklingen av dessa sjukdomar 1 -3. Patienter med kronisk bäckensmärta är mer benägna att uppvisa symptom på ytterligare, icke-bäckenet relaterade funktionella smärttillstånd och humörstörningar, inklusive ångest, depression och panikångest 4-6, som har satts i samband med förändrad funktion hypothalamic- hypofysadrenal (HPA) axel 7-10. Exponering för tidiga liv stress eller trauma är en betydande riskfaktor för att utveckla HPA avvikelser och tillhörande kroniska smärtsyndrom 10,11 och, som sådan, rapporterar en betydande undergrupp av patienter med funktionella bäckensmärttillstånd ha upplevt negativa barndom händelser såsom övergrepp eller försummelse 12-14.
Gnagare modeller av neonatal maternal separation (NMS), vilket innebär att ta bort valparna från sin mor under en viss tid under preweaning perioden, har använts under de senaste två decennierna för att studera resultaten av tidiga liv stress. I allmänhet, har NMS visats öka HPA-axeln aktivering och resulterande ångestliknande beteenden, genom att direkt påverka genuttryck i hypotalamus, samt störa nedströms reglering från limbiska strukturer 15-18. Störningar av korrekt HPA-axeln funktion har visat sig bidra till ökad kolorektal 19-22 16 känslighet visas av gnagare NMS modeller, men trots omfattande karakterisering av den långsiktiga effekten av postnatal inflammation i urinblåsan 23-25, har effekterna av tidiga liv stressen till stor del gått unstudied i urogenitalorganen. Därför kommer följande studie beskriver hur man utför NMS hos möss och senare utvärdera perigenital mekanisk känslighet och mastcellinfiltration / aktivering i prostatan att kontrollera användningen av manliga NMS möss som en preklinisk modell för CP / CPP.
Av alla de diagnostiserade kroniska bäckensmärttillstånd, är CP / CPP kanske minst välkänt och kännetecknas syndrom, trots att de har en livstidsprevalens på cirka 14% 26 och årliga patientens kostnader uppskattas till $ 4400 (dubbelt så stor som ländryggssmärta eller reumatoid artrit 27). Patienter med CP / CPP rapport smärta i mellangården, ändtarm, prostata, penis, testiklar, och / eller buk 28, uppleva en hiGher grad av psykisk stress än kontrollpatienter 29, och vanligt förekommande med symtom på eller diagnostiseras med comorbid kronisk bäckensmärta eller humörstörningar 5,29-31. Återkommande infektion, läckande epitel, neurogen inflammation och autoimmunitet har alla surmised som potentiella bakomliggande orsaker till CP / CPP 2,32,33, samt mastcellsaktivering och degranulering 34. Uttryckt prostatasekret från män med CP / CPP hade ökat mastcells tryptas och nervtillväxtfaktor (NGF) nivåer 34, och en senare studie bekräftade att tryptas och karboxipeptidas A (CPA3), en markör för mastcellsaktivering, har också ökat i urin av CP / CPP patienter 35. Den potentiella roll mastceller i uppkomsten och upprätthållandet av CP / CPP har varit ett stort fokus för djurförsök på detta syndrom hittills. Den vanligast användes gnagarmodell används för att studera CP / CPP är en experimentell autoimmun prostatit (EAP) modell allmbetade genom subkutan injektion av prostata antigen i fullständigt Freunds adjuvans, vilket resulterar i varierande grader av prostatainflammation beroende på art och stam som används 34,36-39. Mast cellinfiltration och aktivering / degranulering har visat sig öka efter induktion av EAP 34,35,40. Transgena möss som saknar antingen mastceller 34 eller tryptas receptorn PAR2 35 utvecklar inte prostata taktik känslighet efter EAP, till skillnad från vildtyp EAP möss. Även om detta preklinisk modell replikerar många av de egenskaper hos mänskliga CP / CPP, är induktionsprotokollet inte ett tecken på människans villkor, som har ett mångsidigt etiologi och ofta inte innebär direkt inflammation, infektion eller skada prostatan.
Inverkan av tidiga liv stress på utvecklingen av CP / CPP hos människa har till stor del gått undersöks inte; Men en studie av Hu et al. 41, visade att mign som rapporterade en historia av barndomen fysiska, känslomässiga och / eller sexuella övergrepp var betydligt mer benägna att uppleva symtom som tyder på CP / CPP. Dessutom visade de att både smärta och urin poäng var förhöjd hos patienter med en historia av fysisk och psykisk misshandel. Vi har tidigare visat att samma NMS paradigm i C57BL / 6-möss producerar vaginala överkänslighet och onormal genexpression i både slidan och urinblåsan tyder på dysfunktionell HPA-axeln utgång 16. Detta bevis i kombination med den höga förekomsten av CP / CPP patienter med andra sjukdomstillstånd 42, inklusive IC / PBS och humörstörningar, som tydligare har visat sig vara kopplat till tidiga liv spännings exponering 12-14, ger grunden för att använda en NMS modell för att undersöka CP / CPP i möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök som beskrivs i detta protokoll överensstämmer med NIH riktlinjer i enlighet med de riktlinjer som anges av University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Neonatal Maternal Separation (NMS)
- Övervaka gravida dammar dagligen för kull födda.
Obs: Dagen kullen föds anses P0. - På P1, ta bort dammen från buren och placera i en ren sekundära behållaren.
- Gnid en handfull strö mellan rena-handskar på händerna för att upprätthålla doften av buren.
- Lägg till ett djup av 1 - 2 cm i hemmet buren sängkläder i en ren, lämpligt märkt 2 L glasbägare. Tillsätt ungefär hälften av ytterligare anrikning strö som är närvarande i hemmaburen, t.ex. nestlet, crinklen papper, till glasbägare.
- Placera försiktigt alla valparna från en enda kull, individuellt, i samma bägaren.
- Placera omedelbartbägaren i en inkubator som hölls vid 33 ° C och 50% fuktighet under 180 minuter.
- Ta dammen från den sekundära behållaren och tillbaka henne till hemmet buren. Returnera buren till dess lämpliga bostäder plats i terrariet.
- Upprepa denna procedur för varje kull genomgår NMS, med hjälp av rena handskar och sekundära behållare för varje kull / damm.
- Vid slutet av 180 min separationsperiod tillbaka kullar till sina hem burar i samma ordning som de togs bort.
- Hämta hem buren av den första kullen som separerades tidigare under dagen. Ta dammen från buren och placera i en ren sekundära behållaren.
- Ta bort den första bägaren från inkubatorn och gnida en handfull strö mellan rena handskar på händerna för att hålla doften av buren vid hantering valparna.
- Rör försiktigt valparna, individuellt, från bägaren till hemmaburen.
- Avkastning eventuell berikning och kvar i bägaren till sängkläderhemmaburen.
- Återgå dammen från den sekundära behållaren till hemmet buren och återlämna den till sin lämpliga bostäder plats i terrariet.
- Skölj bägaren med vatten och återlämna den till inkubatorn. Använd samma bägare under varje kull under hela separationsförfarandet.
- Upprepa denna procedur för varje kull som genomgår NMS i samma ordning som de placerades i inkubatorn.
- Upprepa hela proceduren för varje kull genomgår NMS varje dag genom P21.
- Avvänja NMS och naiva valpar på P22 genom att placera syskon av samma kön tillsammans i rena burar komplett med mat och vatten. Naiva valpar skulle födas och inrymt på samma villkor som NMS möss, men genomgår ingen ytterligare hantering utanför normala djurhållning uppgifter.
2. Perigenital Mekanisk känslighet
- von Frey Apparatus Setup
- Föra mössen till testrummet och tillåta dem att acklimatisera sig under 30min under kvar i sina hemmaburar.
- Förbered testområde genom att placera ett absorberande underlägg under en förhöjd trådnät-top bord (79 cm x 28 cm) som ger tillräckligt med utrymme för att göra det möjligt för utredaren att närma från undersidan utan uppseendeväckande mössen, ca 55 cm i höjd.
- Placera upp till 12 möss, individuellt, enligt klara, perforerade plastkammare (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) ovanpå trådnätet tabellen. Placera ett tungt föremål ovanpå kamrarna för att förhindra möss från att fly.
- Acklimatisera mössen i ytterligare 30 minuter på skärmen innan uttag utvärderingströskeln.
- Bedömning Perigenital Mekanisk känslighet
- Utför upp-ner-metoden med användning av en standarduppsättning av graderade von Frey enfibertrådar 43. Använd följande enfibertrådarna: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g och 4,74 g.
- Håll basen av 3,22 g monofilament och exponera indragna monofilament.
Obs: Vissa modeller kanske inte har ett indraget monofilament. - Placera proben så att monofilamentet är vertikalt orienterad och när musen är alert, orörlig, och dess kroppsvikt fördelas jämnt mellan baktassarna tillämpa den på antingen vänster eller höger sida av pungen, undvika mittlinjen, tills ett lätt böj observeras i tråden.
- Håll monofilament i stället för 10 sekunder eller tills djuret visar ett positivt svar.
Obs: Ett positivt svar anses vara en rask ryck eller hopp i beroende av monofilament ansökan eller slick eller bitande beteende riktat mot monofilamentet. Om musen rör sig under 10 sekunder monofilament ansökan utan att visa dessa beteenden, måste monofilamentet testas efter minst 1 minut lång viloperiod. Om en mus varken rörelser eller uppvisar något av ovan angivna beteenden under 10 sek monofilament ansökan, anses det ett negativt svar. - Spela in svaret, antingen negativ eller positiv, i ett labb anteckningsbok eller laptop och upprepa proceduren på alla de återstående möss med användning av 3,22 g monofilament.
- Testa alla mössen igen med nästa lämpliga monofilament. Obs: Om musen uppvisade ett negativt svar till 3,22 g monofilament, tillämpa 3,61 g monofilament på samma sätt och spela in svaret. Om musen uppvisade ett positivt svar på den 3,22 g monofilament, applicera 2,83 g monofilament och registrera svaret.
- Håll basen av 3,22 g monofilament och exponera indragna monofilament.
- Fortsätt att testa varje mus med nästa större eller mindre monofilament, i förekommande fall, för ytterligare 4 ansökningar efter den första positiva responsen observeras.
- Återgå möss till hemmet burar.
- Använda värdet av den slutliga von Frey-monofilament används i försöksserien i log-enheter för att beräkna ett g dragningsgränsvärdet 50% såsom beskrivs i Chaplan et al. 43.
- Utför upp-ner-metoden med användning av en standarduppsättning av graderade von Frey enfibertrådar 43. Använd följande enfibertrådarna: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g och 4,74 g.
- Vävnadsbearbetning
- Dissekera prostatavävnaden 44 från möss som har intracardially perfunderade med iskall 4% paraformaldehyd 45. Postfix vävnaden i 4% paraformaldehyd under 1 h vid RT och sedan cryoprotect i 30% sackaros i 1 x PBS vid 4 ° CO / N.
- Förbered en liten (30 ml) bad heptan och placera den på torris.
- Skölj prostatavävnaden i 1x PBS och torka med hjälp av en lätta torka.
- Sätt i prostatavävnaden in i kall heptan tills den är frusen.
- Placera omedelbart den frusna prostatavävnad i en cryomold innehåller monterings media och plats på torris tills fryst.
- Butiks cryomolds vid -20 ° C.
- Skurna på tvären prostatavävnaden i 7 pm tjocka kryosnitt med en kryostat.
- Placera 8-12 icke-seriella kryosnitt som spänner över längden av vävnaden, på positivt laddade objektglas.
- Butiks färdiga objektglas vid -20 ° C tills vidare bearbetning.
- Förbereda surgjord toluidinblått
- Lägg ett g toluidinblått O till 100 ml 70% etanol och skaka tills i lösning för framställning av en 1% stamlösning. Förrådslösningen kan lagras vid rumstemperatur under upp till tre veckor.
- Lägg ett g NaCl till 100 ml vatten i en bägare placerad på toppen av en omrörningsplatta.
- Justera pH i NaCl-lösning med användning av 12 M HCl tills ett pH-område av 0,5 till 1,0 uppnås.
- Förbered 0,25% toluidinblått arbetslösning genom att kombinera 8 ml av toluidinblått stamlösning och 32 ml av den 1% NaCl-lösning. Pipettera upp och ner för att säkerställa total inkorporering av toluidinblått stamlösningen och blanda med hjälp av en virvel. Arbets lösningen måste göras färskt och kasseras efter användning.
- Färgning Prostate Kryosnitt
- Avlägsna objektglasen som skall bearbetas från frysen och låt jämvikt till rumstemperatur under cirka 30 mi.
- Tvätta vävnadssnitt genom att individuellt doppa glasen under ca 1 sekund till en 50 ml koniskt rör innehållande en tillräcklig volym av 1 x PBS för att säkerställa att glidmonterade vävnadssektioner kommer att vara helt nedsänkt. Låt objektglasen lufttorka på en pappershandduk.
- Placera objektglasen i en glasfärgnings burk innehållande tillräckligt 0,25% arbetar toluidinblått lösning för att säkerställa att glidmonterade vävnadssektioner kommer att vara helt nedsänkta och inkubera under 10 - 15 min medan på en plattform rocker inställd på 15 varv per minut.
- Doppa objektglasen i 1x PBS för ca 1 sekund för att tvätta bort överskottet av toluidinblått.
- Placera objektglasen i en glidlåda eller ett ställ på ett sådant sätt att bilderna är på sina sidor för att medge dränering.
- Torka glasen i en ugn vid 37 ° C under minst 2 timmar eller O / N vid RT.
- Torka glider snabbt med hjälp av alkohol, vilket gör bilderna till helt torr mellan alkoholexponeringar. Torra glider genom dränering på en pappershandduk ennd torka ryggen och kanter med lätta torka.
- Sänk bilderna i 95% EtOH under ca 1 sekund och låt torka helt. Upprepa denna procedur 1 - 10 gånger tills vävnaden torkar mer blå än lila.
- Sänk bilderna i 100% EtOH under ca 1 sekund och låt torka helt. Upprepa denna procedur 1 - 10 gånger tills vävnaden är mörkt till medel blå, men inte lila.
- Fäst fläcken genom att inkubera objektglasen i 100% xylen under 3 minuter. Låt torka.
- Täckglasen med glycerol, PBS eller xylen baserade permanent monteringsmedia. Tappa överskott media och förvara vid rumstemperatur.
- Kvantifiera mastceller
- Visualisera toluidinblå-färgade vävnadssnitt vid 20X förstoring med användning av Ijusmikroskopi (figur 2).
- Räkna det totala antalet mastceller som finns inuti det visualiserade området och differentierar mellan icke-degranulated och degranulated mastceller. 40X magnificatjon kan vara nödvändigt att bekräfta granulering status i vissa mastceller.
Obs: Icke-degranulated mastceller uppvisar täta metachromasia med ingen eller svag kärn kontur och / eller ingen granulat extrudering runt cellen. Degranulated mastceller uppvisar mindre intensiv metachromasia och har ett uppenbart tydlig beskrivning av kärnan och / eller fria granuler i cytoplasman och utsidan av cellen gränsen. - Fortsätt att bedöma det totala antalet icke-degranulated och degranulated mastceller i hela den nuvarande vävnadssnitt. Upprepa denna procedur på ytterligare minst 7 separata sektioner, som spänner över längden varje vävnad.
- Beräkna procenten degranulated (GD) till totala mastceller för varje vävnad / mus enligt följande ekvation: (GD mastceller / Totala mastceller) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Möss som har genomgått NMS visade beteende bevis tyder på CP / CPP. Vid testning med en graderad serie av von Frey monofilament, 8 veckor gamla NMS möss (n = 4) visas perigenital mekanisk allodyni jämfört med naiva motsvarigheter (n = 5, fig 2). Detta framgår som en signifikant minskning (p <0,01, t-test) i den mekaniska återtagströskel som framkallade en positiv beteende svar, redovisas som en rask ryck eller hoppa som svar på monofilament ansökan eller slickar eller bitande beteende riktad mot monofilament .
Möss som exponerats för NMS visas också histologiska tecken på CP / CPP. Kryostatsnitt av prostatavävnad färgades med surgjord o-toluidinblått att observera Tryptas granulat inrymda i mastceller (Figur 3A-D). Den procentuella andelen mastceller som visade tecken på aktivering, t ex, diffust metachromasia, granulat närvarande utanför cellen gränsen (Figur 3D), ökade signifikant i prostatavävnad från 8 veckor gamla NMS möss, jämfört med naiva (p <0,0001, t-test, figur 3E). Det totala antalet infiltrerade mastceller, oavsett granulering status, sågs ingen signifikant skillnad mellan naiva (99,5 ± 15,2 celler / avsnitt) och NMS möss (108,2 ± 22,5 celler / avsnitt).
Figur 1. Procedur tidslinje. Schemat beskriver en rekommenderad tidslinje för att utföra den beskrivna metoden. Neonatal moderns separation (NMS) utförs dagligen från postnatal dag (P) 1 tills P21 och möss är avvanda på P22. Möss förblir ostörd utanför normal djurhållning till 8 veckors ålder då de testas för perigenital mekaniska sensitivity. Om samma möss kommer att bedömas för mastcellfärgning, bör en vecka tillåtas förflyta efter beteendetestning för att möjliggöra eventuella kvarvarande spänningseffekter att lösa.
Figur 2. Perigenital mekanisk känslighet. Perigenital mekanisk känslighet mättes med användning av von Frey monofilament ansökan. Hanmöss som genomgick neonatal mödrars separation (NMS) visade en signifikant minskning av indragning tröskelvärde, jämfört med naiva möss, som är indikativa för mekanisk allodyni. Data representerar medelvärdet SEM, n = 4 för varje grupp. * P <0,05, Students t-test.
Figur 3. Mastcellaktivering. Acidified toluidinblått användes för att visualisera tryptas granuler och beräkna procentandelen av aktiverade / degranulated mastceller i kryostatsektioner av prostatavävnad. Representativa mikrofotografier visas av toluidin blå-färgade sektioner från naiva (A) och NMS (B) prostata med pilar som anger intakta (icke-degranulated) och pilspetsar indikerande aktiverade (degranulated) mastceller. Högre förstoring från naiva (C) och NMS (D) blåsan visas för att illustrera histologiska skillnader från icke-degranulated (C) och degranulated (D) mastceller. En betydligt större andel av degranulated mastceller observerades i prostatasektioner från NMS möss jämfört med naiva möss (E). Data representerar medelvärdet SEM, n = 4 för varje grupp. **** P <0,0001, Students t-test.= "_ Blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger metodik för användning av neonatal stress i form av NMS, att inducera symptomologi indikerar CP / CPP hos vuxna hanmöss. Som vuxna, de NMS möss uppvisar betydande perigenital mekanisk allodyni, samt bevis på mastcelldegranulering i prostatavävnad. Användningen av NMS är ett nytt sätt att utveckla en preklinisk modell av CP / CPP att det replikerar tidiga liv stress som ofta rapporteras av patienter med kronisk bäckensmärta 12-14, samt att införliva en icke-invasiv induktion, som motsats till mer vanligt förekommande, kemisk-och immunologiskt inducerad inflammation i prostatan 34,36-39. Dessutom NMS i möss har visat sig ge comorbid symptomologi, inklusive förändrade ångest-liknande och anhedonic beteenden, ökad vattenkastnings priser, och baktass överkänslighet (16, data ej visade), som liknar de komorbida somatiska, humör och viscerala sjukdomar som uppvisas av CP / CPP patieNTS 4-6.
Den främsta fördelen med att använda NMS för att inducera CP / CPP i möss är att den använder en psykologisk intervention för att initiera fysiologiska förändringar. Patienter med CP / CPP har variant etiologi som till stor del inte innebär tidigare infektion eller direkt skada prostatan 1-3. Trots detta faktum har publicerade modellerna av CP / CPP införlivas direkt eller indirekt inflammation i prostatan för att inducera överkänslighet av perigenital regionen och / eller mastcellaktivering. En betydande del av CP / CPP och kronisk bäckensmärtpatienter i allmänhet rapport ha upplevt tidiga liv motgångar, som till stor del har gått unstudied i gnagarmodeller av urogenitala smärtsyndrom. Tidigare arbete från vårt labb har visat att NMS inducerar vaginal överkänslighet och tillhörande störningar av väl fungerande HPA-axeln 16. Framtida arbete med denna modell kommer att undersöka de mekanismer som drivs av tidiga liv stress producera tHan ändrade fenotyp i vuxen ålder, liksom att undersöka potentiella farmakologiska eller livsstilingripanden som skulle kunna tillämpas i en preklinisk eller klinisk miljö.
Uppnå optimala och reproducerbara resultat från detta protokoll beror på att observera flera viktiga steg som kan behöva optimeras beroende på miljön och utrustning som används. Med tanke på att NMS dramatiskt påverkar hur HPA-axeln, är det viktigt att kontrollera för yttre stimuli och miljöstress under både neonatala och vuxna perioder. Åldersmatchade, icke-hanteras naiva möss skulle födas och inrymt i överensstämmelse med varje kohort av NMS möss för att kontrollera för externa faktorer som finns i miljön som kan påverka utvecklingen av HPA-axeln. Det är viktigt att bestämma antalet möss som behövs för att utföra den avsedda experiment innan man inleder avel eller beställa dräktiga honor i djuranläggningen. Samtidigt utför NMS, greatest oro är avvisande av valparna från dammen, därför är det viktigt att behålla doften av buren hela NMS protokollet. För att minimera effekterna av dygnsrytmer, är den föreslagna separation tid för NMS under mitten av den ljuscykel (11:00 till 02:00). Perigenital mätningar känslighet bör erhållas i fullt mogna vuxna hanmöss, cirka 8 veckors ålder, och tas vid samma tid på dagen för varje grupp, företrädesvis i början av ljus cykel för att sammanfalla med tråget i dygnsrytmer. För att minska förekomsten av icke-framkallade rörelser under denna procedur, kan bedömningar göras i en temperaturkontrollerad, ljudisolerade rum med vitt brus spelar (20 - 20.000 Hz). Samma utredare ska bedöma alla återtagströsklarna genom hela studien för att upprätthålla konsekvens i efterlevnaden av positiva och negativa svar. Som alternativ till att mäta den mekaniska tröskel 50%, indragning frekvens till en enda monofilament pald bedömas eller en elektronisk von Frey apparat 46 skulle kunna användas. För mastcell visualisering, bör alla objektglas som skall analyseras att behandlas tillsammans för att säkerställa lika färgning av mastceller, såsom färgningsintensitet kan variera mellan experimenten. Ett pH under 1,0 är nödvändigt för korrekt kontrast mellan de djupa lila mastceller och ljusblå bakgrund. Alltför många sköljningar i alkohol kan tvätta bort fläcken från mastcellerna och påverkar kontrasten negativt. Slutligen kan överlagra ett rutnät på vävnaden vara till hjälp för att räkna celler under hela vävnadssnitt den.
Flera överväganden bör göras innan användning av NMS att inducera CP / CPP eller relaterade centraliserad smärttillstånd. För det första har den stora majoriteten av publikationer som har införlivat tidiga liv stressen gjorts i råttmodeller av NMS, med hjälp av en stympad period separation av P1 - P14. Många grupper har visat att detta paradigm alstrar en IBS-liknande symptomologi i rats och möss 15; Men i vår tidigare studie en P1 - P14 separationsperiod i C57BL / 6-möss inte generera en betydande ökning av vaginal känslighet 16, inte heller generera kolorektal överkänslighet (data visas ej). Därför kan de arter och längd av NMS bestämma den specifika utfallet i vuxenlivet, inklusive svårighetsgrad symptomologi och visst organ (s) som påverkas. För det andra, de beteende- och molekylära förändringar till följd av NMS är till stor del på grund av dysreglering av HPA-axeln 15-18, vilket tyder på att effekten är centralt förmedlad och kunde ha komorbida resultat, inklusive förändringar i ångest- och / eller depressionsliknande beteenden och ökad känslighet i andra bäckenorgan eller mer avlägsna platser. Detta comorbid fenotyp är ett tecken på vad som brukar ses kliniskt och kan vara mer representativ för CP / CPP patienter som helhet 5,28-31,42. Tredje, baserat på dessa förändringar som sker som ett resultat av HPA-axeln dysregulation bör effekterna av stressen vara av yttersta oro under både NMS förfarandet och senare beteendetestning och in vitro analys. Produktionen från HPA-axeln är dagaktiva, med större effekt under mer aktiva cykel mörk och mindre produktionen under mer stilla ljus cykel, vilket kan ha påverkat utgången av beteende eller in vitro analys beroende på tidpunkten för testning / offra 47. På samma sätt, exponering för stressfaktorer, bland annat genomgår perigenital mekanisk känslighet testning, tillfälligt kan påverka funktionen hos HPA-axeln 18 och potentiellt förändra genuttryck inom tillhörande områden i hjärnan och nedströms perifera vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant C57BL/6 female mice | Charles River | 027 | Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth. |
| 2 L glass beaker(s) | Sigma-Aldrich | CLS10002L | Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period. |
| VWR Forced Air Incubator, Basic | VWR International | 414005-124 | The incubator should be held at 33°C and 50% humidity. |
| Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) | Stoelting | 58011 | The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g. |
| Animal Enclosure (12 mice 6 rats) | IITC | 435 | Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. |
| Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) | IITC | 410 | Place stand on a stable table top for comfortable access. |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight. |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | Chill heptane on dry ice to freeze tissue. |
| Standard Cryomold | VWR International | 4557 | To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning |
| Tissue-Tek OCT Compound | Sakura | 4583 | 12 x 125 ml |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR International | 48311-703 | 75 x 25 x 1 mm |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells. |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections. |
| GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes | BioExpress | C-3394 | Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS. |
| Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover | Fisher Scientific | 08-815 | Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene. |
| Xylenes (Histological) | Fisher Scientific | X3P | Once dehydrated, tissue is cleared with xylene. |
| Microscope Slide Boxes, 100-Place | VWR International | 82003 | Boxes can be used for storage and transportation of slides. |
| Fisherbrand Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 22-363-400 | These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol is a traditional mounting medium. |
| Mounting Medium, Richard-Allan Scientific | VWR International | 4111 | Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide. |
| Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 | VWR International | 48393-106 | A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample. |
| Light Microscope | Nikon | The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E. |
References
- Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
- Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
- Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
- Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
- Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
- Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
- Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
- Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
- Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
- Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
- Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
- Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
- Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
- Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
- Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
- Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
- Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
- Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
- Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
- Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
- Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
- Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
- DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
- Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
- Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18 (2011).
- Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
- Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
- Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
- Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
- Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
- Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
- Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
- Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
- Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
- Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
- Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
- Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
- Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
- Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
- Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
- Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
- Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3791 (2012).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51212 (2013).
- Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).
