Summary
Wij meten perigenital mechanische gevoeligheid en mestcel activering in de prostaat van mannelijke C57BL / 6 muizen die een vroege levensspanning paradigma ondergingen - neonatale maternale scheiding teneinde een preklinisch model van chronische prostatitis / chronisch bekkenpijnsyndroom induceren.
Abstract
Chronische prostatitis / chronische bekkenpijn syndroom (CP / CPPS) heeft een prevalentie van 14% en is de meest voorkomende urologische diagnose voor mannen onder de leeftijd van 50, maar het is de minst begrepen en studeerde chronische pijn in het bekken stoornis. Een aanzienlijk deel van de patiënten met chronische pijn in het bekken rapport vroege leven stress of misbruik, die sterk kan invloed hebben op het functioneren en de regulering van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA-as) hebben meegemaakt. Mestcelactivatie, waarvan is aangetoond worden verhoogd in zowel urine als uitgedrukt prostatic afscheidingen van CP / CPPS patiënten wordt gedeeltelijk gereguleerd door stroomafwaartse activering van de HPA-as. Neonatale moeder scheiding (NMS) is gebruikt voor meer dan twee decennia aan de uitkomsten van het vroege leven van stress studeren in knaagdiermodellen, waaronder veranderingen in de HPA-as en viscerale gevoeligheid. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het gebruik NMS als preklinisch model van CP / CPPS bij mannelijke C57BL / 6-muizen. We beschrijven de methodologievoor het uitvoeren van NMS, beoordelen perigenital mechanische allodynie en histologisch bewijs van de mestcel activering. We hebben ook aangetoond dat vroege psychologische stress langdurige effecten op het mannelijke urogenitale stelsel bij muizen hebben.
Introduction
Chronische pijn in het bekken op zich geen ziekte, maar een begrip in verband met de voortdurende spontaan en / of opgeroepen pijn die patiënten met irritable bowel syndrome (IBS), interstitiële cystitis / pijnlijke blaas syndroom (IC / PBS), vulvodynia, of chronische prostatitis / chronische bekkenpijn syndroom (CP / CPPS). Deze syndromen worden vaak comorbide en hebben veel kenmerken gemeen, dat ze geen geassocieerde pathologie of geïdentificeerd onderliggende etiologie, maar disfunctie in het immuunsysteem, centraal zenuwstelsel en perifere zenuwstelsel is aangetoond bij te dragen aan het behoud en progressie van deze aandoeningen 1 -3. Patiënten met chronische bekkenpijn vaker met symptomen echter extra, niet-bekken-gerelateerde functionele pijn stoornissen en stemmingsstoornissen, waaronder angst, depressie en paniekstoornis 4-6, die is geassocieerd met veranderde werking van de hypothalamus hypofysebijnier (HPA-as) 7-10. Blootstelling aan vroege leven stress of trauma is een belangrijke risicofactor voor het ontwikkelen HPA afwijkingen en bijbehorende chronische pijn syndromen 10,11 en als zodanig, rapporteren een significant deel van de patiënten met functionele bekkenpijn aandoeningen hebben ondervonden nadelige jeugd evenementen, zoals mishandeling of verwaarlozing 12-14.
Knaagdiermodellen van neonatale maternale scheiding (NMS), wat inhoudt dat het verwijderen van de pups van de dam voor een bepaalde tijd tijdens de het spenen periode, zijn gebruikt voor de afgelopen twee decennia aan de uitkomsten van het vroege leven stress te bestuderen. Over het algemeen is NMS aangetoond dat activatie HPA as en resulterende angst-achtig gedrag vergroten door direct beïnvloeden genexpressie in de hypothalamus, en verstoren stroomafwaartse regulering van limbische structuren 15-18. Verstoring van goede HPA-as werking is aangetoond bij te dragen aan verhoogde colorectale 19-22 16 gevoeligheid weergegeven door knaagdieren NMS-modellen, maar ondanks uitgebreide karakterisering van de lange-termijn effect van postnatale blaasontsteking 23-25, is de impact van vroege leven spanning grotendeels verdwenen unstudied in de urogenitale organen. Daarom zal de volgende studie beschrijven hoe NMS presteren bij muizen en later perigenital mechanische gevoeligheid en mestcellen infiltratie / activatie evalueren de prostaat het gebruik van mannelijke muizen NMS valideren als preklinisch model voor de CP / CPPS.
Van alle van de diagnose chronische pijn in het bekken aandoeningen, CP / CPPS is misschien wel het minst goed herkend en gekarakteriseerd syndroom, ondanks het feit dat een prevalentie van ongeveer 14% 26 en de jaarlijkse patiënt de kosten geschat op $ 4400 (tweemaal die van lage rugpijn of reumatoïde arthritis 27). Patiënten met CP verslag / CPPS pijn in het perineum, het rectum, prostaat, penis, testikels, en / of buik 28, ervaring een higher mate van psychologische stress dan controle patiënten 29, en vaak aanwezig met symptomen van of zijn gediagnosticeerd met comorbide chronische pijn in het bekken of stemmingsstoornissen 5,29-31. Terugkerende infectie, lekkende epitheel, neurogene ontsteking en autoimmuniteit zijn allemaal vermoed als mogelijke oorzaken van CP / CPPS 2,32,33, alsmede mestcel activering en degranulatie 34. Uitgedrukt prostaat afscheidingen van mannen met CP / CPPS had mestceltryptase en zenuwgroeifactor (NGF) niveaus verhoogd 34, en een latere studie bevestigde dat tryptase en carboxypeptidase A (CPA3), een marker van mestcel activering, werden ook verhoogd in de urine van CP / CPPS patiënten 35. De potentiële rol van mestcellen in het ontstaan en de instandhouding van CP / CPPS is een belangrijke focus van dieronderzoek dit syndroom tot nu toe geweest. De meest gebruikte knaagdieren model gebruikt om CP studeren / CPPS is een experimentele auto-immune prostatitis (EAP) model generated door subcutane injectie van prostate antigeen in complete Freund's adjuvans, wat leidt tot verschillende graden van prostaat ontsteking afhankelijk van soort en stam gebruikt 34,36-39. Mestcel infiltratie en activering / degranulatie is aangetoond dat na inductie van EAP 34,35,40 verhogen. Transgene muizen deficiënt in beide mestcellen 34 of de tryptase receptor PAR2 35 niet ontwikkelen prostaat tactiek gevoeligheid volgende EAP, in tegenstelling tot wildtype EAP muizen. Terwijl dit preklinisch model repliceert veel van de kenmerken van de menselijke CP / CPPS, de inductie protocol is geen indicatie van de menselijke conditie, die een divers etiologie heeft en vaak niet gepaard gaat met directe ontsteking, infectie, of letsel van de prostaat.
De invloed van vroege leven nadruk op de ontwikkeling van CP / CPPS mens grotendeels niet onderzocht gegaan; Maar een studie van Hu et al. 41 aangetoond dat men die meldde een geschiedenis van de kindertijd fysieke, emotionele en / of seksueel misbruik waren significant meer kans om de symptomen die wijzen op CP / CPPS ervaren. Bovendien toonden ze aan dat zowel pijn als urine scores werden verhoogd bij patiënten met een voorgeschiedenis van fysieke en emotionele misbruik. We hebben eerder aangetoond dat dezelfde NMS paradigma vrouwelijke C57BL / 6-muizen produceert vaginale overgevoeligheid en abnormale genexpressie in zowel de vagina en de blaas wijzen op disfunctionele HPA uitgang 16. Deze gegevens in combinatie met de hoge prevalentie van CP / CPPS patiënten met andere comorbiditeiten 42, zoals IC / PBS en stemmingsstoornissen, dat duidelijker is aangetoond dat gekoppeld met vroege levensspanning exposure 12-14, voorziet de rationale voor het gebruik van een NMS model te onderzoeken CP / CPPS bij muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten beschreven in dit protocol te voldoen aan NIH richtlijnen in overeenstemming met de door de Universiteit van Kansas Medical Center Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen.
1. Neonatale Maternal Separation (NMS)
- Monitor zwanger dammen dagelijks voor zwerfafval geboorten.
Opmerking: De dag van het nest is geboren wordt beschouwd P0. - Op P1, verwijder de dam van de kooi en plaats in een schone secundaire container.
- Wrijf een handvol beddengoed tussen de clean-gehandschoende handen om geur van de kooi houden.
- Voeg een diepte van 1-2 cm van de kooi bedden in een schone, de juiste label 2 L glazen beker. Voeg ongeveer de helft van de extra verrijking strooisel die in de kooi is, bijvoorbeeld nestlet, kreukdocument aan een bekerglas.
- Plaats voorzichtig alle pups uit één nest, afzonderlijk, in dezelfde beker.
- Onmiddellijk plaatshet bekerglas in een incubator gehouden op 33 ° C en 50% vochtigheid gedurende 180 min.
- Verwijder de dam van de secundaire container en haar terug naar de kooi. Zet de kooi om zijn passende huisvesting locatie in het terrarium.
- Herhaal deze procedure voor elk nest ondergaan NMS, met behulp van schone handschoenen en secundaire containers voor elk nest / dam.
- Aan het einde van de 180 min separatieperiode terug de nesten naar hun kooien in de volgorde waarin ze werden verwijderd.
- Haal de kooi van het eerste nest, dat eerder op de dag werd gescheiden. Verwijder de dam van de kooi en plaats in een schone secundaire container.
- Verwijder de eerste beker uit de incubator en wrijf een handvol beddengoed tussen schone gehandschoende handen geur van de kooi te handhaven, terwijl de behandeling van de pups.
- Beweeg de pups, individueel, uit de beker naar de kooi.
- Terugkeer enige verrijking en beddengoed nog in de beker opde kooi.
- Terugkeer de dam van de secundaire container naar de kooi en terug te sturen binnen het terrarium om zijn passende huisvesting locatie.
- Spoel de beker met water en terug te sturen naar de incubator. Gebruik dezelfde beker voor elk nest gedurende de scheidingsprocedure.
- Herhaal deze procedure voor elk nest ondergaan NMS in dezelfde volgorde als in de incubator geplaatst.
- Herhaal deze hele procedure voor elk nest ondergaan NMS elke dag door middel van P21.
- Spenen NMS en naïef pups op P22 door het plaatsen van nestgenoten van hetzelfde geslacht met elkaar in schone kooien, compleet met voedsel en water. Naïve pups geboren zou worden en gehuisvest onder dezelfde voorwaarden als NMS muizen, maar ondergaat geen aanvullende behandeling buiten de normale veehouderij taken.
2. Perigenital Mechanische gevoeligheid
- von Frey Apparatuur Setup
- Breng de muizen om de testkamer en hen in staat stellen om te acclimatiseren voor 30min terwijl die nog in hun huis kooien.
- Bereid de testruimte door het plaatsen van een absorberende onderlegger onder verhoogde wire mesh-tafel (79 cm x 28 cm), die voldoende ruimte biedt om de onderzoeker te benaderen vanaf de onderzijde zonder schrikken de muizen, ongeveer 55 cm hoog.
- Plaats maximaal 12 muizen individueel onder heldere, geperforeerde kunststoffolie kamers (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) bovenop het gaas tabel. Plaats een zwaar voorwerp op de top van de kamers om muizen te voorkomen ontsnappen.
- Acclimatiseren de muizen gedurende nog 30 min op het scherm vóór onttrekkingsdrempel assessment.
- Perigenital Mechanische gevoeligheid Assessment
- Voer de up-down-methode met behulp van een standaard set van gesorteerde von Frey monofilamenten 43. Gebruik de volgende monofilamenten: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g en 4,74 g.
- Houd de basis van de 3,22 g monofilament en de teruggetrokken mono blootfilament.
Opmerking: Sommige modellen kunnen niet over een teruggetrokken monofilament. - Situeren probe zodat het monofilament verticaal georiënteerd en als de muis alert, onbeweeglijk en het lichaamsgewicht gelijkmatig verdeeld tussen de achterpoten toepassen op de linker- of rechterkant van het scrotum, het vermijden van de middellijn, totdat een lichte kromming wordt waargenomen in het filament.
- Houd de Monofilament voor 10 seconden of totdat het dier is een positieve reactie.
Opmerking: Een positieve respons wordt beschouwd als een stevige schok of springen in reactie op monofilament aanvraag of likken of bijten gedrag gericht op het monofilament. Als de muis beweegt tijdens de 10 sec monofilament toepassing zonder weergave van deze gedragingen, moet de monofilament worden opnieuw getest na een minimum 1 min-lange rustperiode. Als een muis niet beweegt, noch vertoont geen van bovenstaande gedragingen tijdens de 10 sec monofilament toepassing, wordt het beschouwd als een negatief antwoord. - Noteer de reactie, hetzij negatief of positief, in een laboratorium notebook of laptop en herhaal deze procedure voor alle resterende muizen met de 3,22 g monofilament.
- Test alle van de muizen opnieuw met de volgende geschikte monofilament. Opmerking: Als de muis vertoonde een negatieve reactie op de 3,22 g monofilament, toepassen 3,61 g monofilament op dezelfde wijze en noteer de respons. Als de muis vertoonde een positieve reactie op de 3,22 g monofilament, toepassen 2,83 g monofilament en noteer de respons.
- Houd de basis van de 3,22 g monofilament en de teruggetrokken mono blootfilament.
- Doorgaan testen elke muis met behulp van de volgende groter of kleiner monofilament, in voorkomend geval, voor een extra 4-toepassingen na de eerste positieve reactie wordt waargenomen.
- Terug muizen naar huis kooien.
- Met de waarde van de laatste toegepaste von Frey monofilamenten in de reeks proeven log eenheden van een 50% g onttrekkingsdrempel berekend zoals beschreven in Chaplan et al. 43.
- Voer de up-down-methode met behulp van een standaard set van gesorteerde von Frey monofilamenten 43. Gebruik de volgende monofilamenten: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g en 4,74 g.
- Weefsel Processing
- Ontleden prostaatweefsel 44 van muizen die zijn intracardiaal geperfuseerd met ijskoud 4% paraformaldehyde 45. Postfix het weefsel in 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij KT en vervolgens cryoprotect in 30% sucrose in 1 x PBS bij 4 ° CO / N.
- Maak een klein (30 ml) bad van heptaan en plaats het op droog ijs.
- Spoel de prostaatweefsel in 1x PBS en droog met een lichte vegen.
- Plaats het prostaatweefsel in de koude heptaan totdat het bevroren.
- Plaats onmiddellijk de bevroren prostaatweefsel in een cryomold met montage media en plaats op droog ijs tot bevroren.
- WINKEL cryomolds bij -20 ° C.
- Dwars snijden de prostaat weefsel in 7 urn dikke cryosecties met behulp van een cryostaat.
- Plaats 8-12 non-serial cryosecties dat de lengte van het weefsel omvatten, op positief geladen objectglaasjes.
- WINKEL eindigde slides bij -20 ° C tot verdere verwerking.
- Voorbereiding Aangezuurd toluïdineblauw
- Voeg 1 g Toluidine Blue O 100 ml 70% ethanol en vortex totdat in oplossing tot een 1% voorraadoplossing te bereiden. De voorraadoplossing kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal drie weken.
- Voeg 1 g NaCl tot 100 ml water in een bekerglas geplaatst op een roerplaat.
- Stel de pH van de NaCl-oplossing met 12 M HCl totdat een pH van 0,5-1,0 bereikt.
- Bereid de 0,25% toluidineblauw werkoplossing door het combineren van 8 ml van de voorraadoplossing toluidineblauw en 32 ml van de 1% NaCl-oplossing. Pipet op en neer om de totale opname van de toluidineblauw voorraad oplossing te zorgen en meng met behulp van een vortex. De werkende oplossing moet vers worden gemaakt en na gebruik weggegooid.
- Kleuring Prostaat Weefsel secties
- Haal de objectglaasjes uit de vriezer te verwerken om de temperatuur tot kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 min.
- Was de weefselcoupes door afzonderlijk dompelen van de objectglaasjes gedurende ongeveer 1 seconde in een 50 ml conische buis met een voldoende hoeveelheid van 1 x PBS zodat de slede gemonteerde weefselcoupes volledig wordt ondergedompeld. Laat slides droge lucht op een papieren handdoek.
- Plaats de glaasjes in een glazen pot met weinig kleuring 0,25% werkzaam Toluidine Blue oplossing zodat de slede gemonteerde weefselcoupes volledig wordt ondergedompeld Incubeer 10-15 minuten terwijl op een platform rocker ingesteld op 15 rpm.
- Dip dia's in 1x PBS gedurende ongeveer 1 seconde uit te spoelen overtollige toluïdineblauw.
- Plaats objectglaasjes in een dia doos of rek zodanig dat de schuiven op de kanten van het toestel drainage.
- Droog de objectglaasjes in een oven bij 37 ° C gedurende ten minste 2 uur of O / N bij kamertemperatuur.
- Uitdrogen glijbanen snel het gebruik van alcohol, waardoor de dia's volledig droog tussen alcohol blootstellingen. Droge dia door het laten uitlekken op keukenpapier eennd vegen ruggen en randen met een lichte vegen.
- Dompel de dia's in 95% EtOH ongeveer 1 seconde en volledig laten drogen. Herhaal deze procedure 1 - 10 keer tot weefsel droogt meer blauw dan paars.
- Dompel de dia's in 100% EtOH gedurende ongeveer 1 seconde en laat het volledig droog. Herhaal deze procedure 1-10 keer totdat weefsel is donker tot medium blauw, maar niet paars.
- Bevestig de vlek door het incuberen van de objectglaasjes in 100% xyleen gedurende 3 min. Laten drogen.
- Coverslip de dia's met glycerol, PBS, of xyleen gebaseerde permanente montage media. Giet overtollige media en bewaar bij kamertemperatuur.
- Kwantificeren mestcellen
- Visualiseren toluïdine Blue gekleurde weefselcoupes op 20x vergroting middels lichtmicroscopie (figuur 2).
- Tel het aantal mestcellen aanwezigheid in het gevisualiseerde stippellijn onderscheid tussen niet-degranulated en degranulated mestcellen. 40X magnification kan nodig zijn om granulatie status aantal mestcellen bevestigen.
Let op: Niet-degranulated mestcellen vertonen dichte metachromasie met geen of vage nucleaire overzicht en / of geen korrelige extrusie rond de cel. Degranulated mestcellen vertonen minder intens metachromasie en hangt natuurlijk duidelijk overzicht van de nucleus en / of granules in het cytoplasma en buiten de cel grens. - Blijf het totale aantal niet-degranulated en degranulated mestcellen beoordelen in het geheel van de huidige weefselsectie. Herhaal deze procedure op ten minste 7 bijkomende aparte secties, verspreid over de lengte van elk weefsel.
- Bereken het percentage degranulated (DG) aan totale mestcellen voor elk weefsel / muis volgens de volgende vergelijking: (DG mestcellen / Total mastcellen) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muizen die NMS hebben ondergaan bleek behavioral bewijs indicatie van CP / CPPS. Wanneer daarop een gegradeerde reeks van von Frey monofilamenten, 8 weken oude NMS muizen (n = 4) weergegeven perigenital mechanische allodynie in vergelijking met naïeve tegenhangers (n = 5, Figuur 2). Dit blijkt een significante reductie (p <0,01, Student's t-test) in de mechanische onttrekkingsdrempel een positieve gedragsmatige respons opgewekt, geregistreerd als stevige schok of springen naar aanleiding monofilament aanvraag of likken of bijten gedrag gericht op het monofilament .
Muizen die werden blootgesteld aan NMS getoond histologisch aangetoonde CP / CPPS. Cryostaat secties van prostaatweefsel werden gekleurd met aangezuurd o-toluïdineblauw om tryptase korrels ondergebracht binnen mestcellen (Figuur 3A-D) te observeren. Het percentage van de mestcellen dat het bewijs van de activering, bijvoorbeeld diffuse metachroma toondensia, granules aanwezige buiten de celgrens (figuur 3D), is in het prostaatweefsel aanzienlijk gestegen van 8 weken oude NMS muizen, vergeleken met naïeve (p <0,0001, Student's t-test, figuur 3E). Het totale aantal geïnfiltreerde mestcellen, ongeacht granulatie status was niet significant verschillend tussen naïeve (99,5 ± 15,2-cellen / sectie) en NMS muizen (108,2 ± 22,5 cellen / sectie).
Figuur 1. Procedurele tijd lijn. Het schema schetst een aanbevolen tijd lijn voor het uitvoeren van de beschreven methodiek. Neonatale moeder scheiding (NMS) wordt dagelijks uitgevoerd vanaf postnatale dag (P) 1 tot P21 en muizen worden gespeend op P22. Muizen blijven ongestoord buiten de normale veehouderij tot 8 weken oud wanneer ze worden getest op perigenital mechanische sensItivity. Als dezelfde muizen zullen worden beoordeeld voor mestcel kleuring, moet één week liet na gedragstesten verstreken biedt indien restspanning effecten te lossen.
Figuur 2. Perigenital mechanische gevoeligheid. Perigenital mechanische gevoeligheid werd gemeten met behulp van von Frey monofilament toepassing. Mannelijke muizen die neonatale maternale separatie (NMS) ondergingen vertoonden een significante vermindering onttrekkingsdrempel, vergeleken met naïeve muizen duiden op mechanische allodynie. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM, n = 4 voor elke groep. * P <0,05, Student's t-test.
Figuur 3. Mast cel activatie. Aangezuurde toluïdineblauw werd gebruikt om tryptase korrels visualiseren en berekenen van het percentage van de geactiveerde / degranulated mestcellen in cryostaat secties van prostaatweefsel. Representatieve microfoto's getoond van toluidine blue-gekleurde coupes van naïeve (A) en NMS (B) prostaat met pijlen intacte (niet-degranulated) en pijlpunten aangeeft geactiveerde (degranulated) mestcellen. Een hogere vergroting van naïeve (C) en NMS (D) blaas getoond histologische uit niet-degranulated (C) tonen en degranulated (D) mestcellen. Een significant hoger percentage degranulated mast cellen waargenomen in prostate gedeelten van NMS muizen in vergelijking met naïeve muizen (E). Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM, n = 4 voor elke groep. **** P <0,0001, Student's t-test.= "_ Blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol voorziet methodologie voor het gebruik van neonatale stress, in de vorm van NMS, te symptomology indicatief CP / CPPS induceren in volwassen mannelijke muizen. Als volwassenen, de NMS muizen tonen significant perigenital mechanische allodynie alsook bewijs van mestcel degranulatie in prostaatweefsel. Het gebruik van NMS is een nieuwe benadering voor de ontwikkeling van een preklinisch model van CP / CPPS doordat het de vroege leven stress die vaak wordt gemeld door patiënten met chronische bekkenpijn 12-14, repliceert en waarin een niet-invasieve inductie, zoals in tegenstelling tot meer gebruikelijke, mogen chemisch en immunologisch geïnduceerde ontsteking van de prostaat 34,36-39. Bovendien heeft NMS bij muizen aangetoond comorbide symptomology, waaronder veranderde angst-achtige en anhedonic gedrag, verhoogde mictie rates produceren en achterpoot overgevoeligheid (16; data niet getoond), vergelijkbaar met de comorbide somatisch, stemming en viscerale stoornissen vertoond door CP / CPPS patieNTS 4-6.
Het grote voordeel van NMS te CP / CPPS induceren in muizen is dat het een psychologische interventie om fysiologische veranderingen leiden. Patiënten met CP / CPPS hebben variant etiologie dat maakt een groot deel geen sprake eerdere infectie of directe schade aan de prostaat 1-3. Desondanks gepubliceerde modellen van CP / CPPS hebben opgenomen direct of indirect ontsteking van de prostaat overgevoeligheid van de perigenital regio en / of activering van mestcellen te induceren. Een aanzienlijk deel van CP / CPPS en chronische pijn in het bekken-patiënten in het algemeen, rapport vroege leven tegenspoed, die grotendeels is gegaan unstudied in knaagdiermodellen van urogenitale pijnsyndromen hebben meegemaakt. Vorige werk van onze lab heeft aangetoond dat NMS induceert vaginale overgevoeligheid en bijbehorende verstoring van de goede werking van de HPA-as 16. Toekomstig werk met behulp van dit model zal de mechanismen die worden gedreven door vroege leven stress t produceren onderzoekenHij veranderde fenotype bij volwassenen, evenals potentiële farmacologische of leefstijlinterventies die in een preklinische of klinische omgeving kan worden toegepast verkennen.
Het bereiken van optimale en reproduceerbare resultaten van dit protocol afhankelijk waarnemen aantal kritische stappen die moeten worden geoptimaliseerd afhankelijk van de omgeving en apparatuur. Aangezien nms dramatisch effect op de werking van de HPA-as, is het belangrijk om te controleren voor externe stimuli en omgevingsstress in zowel de neonatale en volwassen perioden. Leeftijd gematchte, niet-behandelde naïeve muizen worden geboren en gehuisvest in overeenstemming met elk cohort van NMS muizen voor externe stressoren in het milieu die de ontwikkeling van de HPA-as kunnen beïnvloeden. Het is belangrijk om het aantal muizen nodig beoogde experiment alvorens de start kweken of laten drachtige dier in de inrichting voeren bepalen. Tijdens het uitvoeren van NMS, de greatest zorg is de afwijzing van de pups van de dam, daarom is het noodzakelijk om de geur van de kooi gedurende de NMS-protocol te houden. Om de effecten van dagelijkse ritmes te minimaliseren, de voorgestelde scheiding tijd voor NMS is in het midden van het licht cyclus (11:00-2:00). Perigenital gevoeligheidsmetingen worden verkregen volgroeid volwassen mannelijke muizen van ongeveer 8 weken oud en die op hetzelfde tijdstip voor elke groep, bij voorkeur vroeg in de lichtcyclus te laten samenvallen met het dieptepunt van diurnale ritmes. Om het optreden van niet-opgeroepen bewegingen verminderen tijdens deze procedure, kunnen evaluaties worden uitgevoerd in een temperatuur-gecontroleerde, geluidsdichte kamer met witte ruis spelen (20 - 20.000 Hz). Dezelfde onderzoeker moet alle terugtrekking drempels te bepalen gedurende de studie om de consistentie in de naleving van de positieve en negatieve reacties te behouden. Als alternatieven voor het meten van de mechanische drempel van 50%, de terugtrekking frequentie naar een monofilament could beoordeeld of een elektronische von Frey inrichting 46 kunnen worden gebruikt. Voor mestcel visualisatie, dienen alle objectglaasjes die moeten worden geanalyseerd tezamen verwerkt gelijke kleuring van mestcellen waarborgen, zoals kleurintensiteit kan variëren tussen experimenten. Een pH onder 1.0 is noodzakelijk voor een goede contrast tussen de diepe paarse mestcellen en de lichtblauwe achtergrond. Te veel spoelingen in alcohol kan wassen de vlek van de mestcellen en het contrast negatief beïnvloeden. Tenslotte superponeren een raster op het weefsel kan behulpzaam zijn bij het tellen van cellen door het hele gedeelte weefsel.
Verscheidene overwegingen dienen vóór gebruik van NMS CP / CPPS of verwante centrale pijn aandoeningen induceren worden. Ten eerste hebben de overgrote meerderheid van de publicaties die het vroege leven van stress hebben opgenomen gedaan in rat modellen van NMS, met behulp van een afgeknotte scheiding periode van P1 - P14. Veel groepen hebben aangetoond dat dit paradigma genereert een IBS-achtige symptomology in rats en muizen 15; In onze vorige studie P1 - P14 scheidingsperiode in C57BL / 6-muizen gaf geen significante toename van vaginale gevoeligheid 16, evenmin genereren colorectale overgevoeligheid (data niet getoond). Daarom kan de soort en lengte van NMS de specifieke resultaten op volwassen leeftijd te bepalen, inclusief de ernst van symptomology en de specifieke organen (en) die wordt beïnvloed. Ten tweede, de gedrags- en moleculaire veranderingen als gevolg van MNS zijn grotendeels te wijten aan ontregeling van de HPA-as 15-18, wat suggereert dat het effect is centraal-gemedieerde en kon hebben comorbide resultaten, waaronder veranderingen in angst- en / of depressie-achtig gedrag en verhoogde gevoeligheid in andere organen van de pelvis of meer afgelegen locaties. Dit comorbide fenotype is indicatief voor wat gewoonlijk klinisch waargenomen en kunnen representatiever voor CP / CPPS patiënten als geheel 5,28-31,42. Ten derde, op basis van deze veranderingen als gevolg van de HPA-as dysregulatie, moet de impact van stress zijn van het grootste belang, zowel tijdens de NMS procedure en later gedrags testen en in vitro analyse. Uitvoer van de HPA as overdag, met een grotere productie van het actievere donkercyclus en minder productie van het meer rustende lichtcyclus, die de uitkomst van gedrags- of in vitro analyse afhankelijk van de tijd van de test kan beïnvloeden / 47 opofferen. Ook de blootstelling aan stressoren, met inbegrip ondergaan perigenital mechanische gevoeligheid testen, kunnen tijdelijk effect functioneren van de HPA-as 18 en mogelijk wijzigen genexpressie in verband hersengebieden en downstream perifere weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant C57BL/6 female mice | Charles River | 027 | Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth. |
| 2 L glass beaker(s) | Sigma-Aldrich | CLS10002L | Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period. |
| VWR Forced Air Incubator, Basic | VWR International | 414005-124 | The incubator should be held at 33°C and 50% humidity. |
| Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) | Stoelting | 58011 | The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g. |
| Animal Enclosure (12 mice 6 rats) | IITC | 435 | Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. |
| Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) | IITC | 410 | Place stand on a stable table top for comfortable access. |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight. |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | Chill heptane on dry ice to freeze tissue. |
| Standard Cryomold | VWR International | 4557 | To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning |
| Tissue-Tek OCT Compound | Sakura | 4583 | 12 x 125 ml |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR International | 48311-703 | 75 x 25 x 1 mm |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells. |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections. |
| GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes | BioExpress | C-3394 | Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS. |
| Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover | Fisher Scientific | 08-815 | Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene. |
| Xylenes (Histological) | Fisher Scientific | X3P | Once dehydrated, tissue is cleared with xylene. |
| Microscope Slide Boxes, 100-Place | VWR International | 82003 | Boxes can be used for storage and transportation of slides. |
| Fisherbrand Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 22-363-400 | These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol is a traditional mounting medium. |
| Mounting Medium, Richard-Allan Scientific | VWR International | 4111 | Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide. |
| Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 | VWR International | 48393-106 | A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample. |
| Light Microscope | Nikon | The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E. |
References
- Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
- Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
- Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
- Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
- Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
- Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
- Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
- Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
- Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
- Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
- Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
- Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
- Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
- Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
- Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
- Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
- Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
- Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
- Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
- Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
- Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
- Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
- DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
- Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
- Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18 (2011).
- Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
- Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
- Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
- Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
- Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
- Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
- Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
- Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
- Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
- Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
- Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
- Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
- Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
- Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
- Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
- Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
- Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3791 (2012).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51212 (2013).
- Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).
