Summary
Nous mesurons activation périgénitale mécanique de la sensibilité et des mastocytes dans la prostate des hommes C57BL / 6 qui a subi un début de paradigme du stress de la vie - la séparation maternelle néonatale, afin d'induire un modèle préclinique de syndrome chronique de la prostatite chronique / de douleurs pelviennes.
Abstract
La prostatite chronique / syndrome de la douleur pelvienne chronique (CP / CPPS) a une prévalence à vie de 14% et est le diagnostic urologique la plus courante pour les hommes de moins de 50 ans, mais il est le trouble le moins bien compris et a étudié la douleur pelvienne chronique. Un sous-ensemble significatif de patients avec le rapport de la douleur pelvienne chronique ayant connu le stress de début de la vie ou d'abus, ce qui peut sensiblement affecter le fonctionnement et la régulation du (HPA) axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien. L'activation des mastocytes, qui a été montré à être augmentée dans l'urine et exprimé sécrétions prostatiques de patients CP / CPPS, est partiellement régulée par activation en aval de l'axe HPA. La séparation maternelle néonatale (NMS) a été utilisé pendant plus de deux décennies à étudier les résultats de début de stress de la vie dans les modèles de rongeurs, y compris les changements dans l'axe HPA et la sensibilité viscérale. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'utilisation de NMS comme un modèle préclinique de CP / CPPS dans C57BL / 6 souris mâles. Nous décrivons la méthodologiepour effectuer NMS, évaluer allodynie mécanique périgénitale, et la preuve histologique de l'activation des mastocytes. Nous fournissons également des preuves que le stress psychologique précoce peut avoir des effets à long terme sur le système génito-urinaire masculin chez la souris.
Introduction
La douleur pelvienne chronique est pas en soi une maladie, mais plutôt un terme associé à la douleur continue spontanée et / ou évoquée vécue par les patients diagnostiqués avec le syndrome du côlon irritable (IBS), la cystite interstitielle / syndrome de la vessie douloureuse (IC / PBS), vulvodynie, ou le syndrome de douleur pelvienne prostatite chronique / chronique (CP / CPPS). Ces syndromes sont souvent des comorbidités et partagent beaucoup de caractéristiques en ce qu'ils présentent aucune pathologie associée ou étiologie identifiée, bien que a été montré un dysfonctionnement dans le système immunitaire, le système nerveux central et le système nerveux périphérique de contribuer à l'entretien et à la progression de ces troubles 1 -3. Les patients souffrant de douleurs pelviennes chroniques sont plus susceptibles de présenter des symptômes de plus, non-pelvienne liée à des troubles fonctionnels de la douleur et des troubles de l'humeur, y compris l'anxiété, la dépression et le trouble panique 4-6, qui a été associée avec le fonctionnement altéré de la hypothalamo hypophysosurrénalien (HHS) 7-10. L'exposition au stress de la vie au début ou à un traumatisme est un facteur de risque important pour le développement des anomalies HPA et les syndromes de douleur chronique associée 10,11 et, comme tel, un sous-ensemble significatif de patients atteints de troubles de douleur pelvienne fonctionnels ont indiqué avoir vécu les événements de l'enfance indésirables tels que l'abus ou la négligence 12-14.
des modèles de rongeurs de la séparation maternelle néonatale (SMN), qui consiste à enlever les chiots de leur mère pour une période de temps au cours de la période d'avant le sevrage, ont été utilisées pour les deux dernières décennies pour étudier les résultats de début de stress de la vie. En général, NMS a été montré pour augmenter l'activation de l'axe HPA, et les comportements de type anxieux qui en résultent, en affectant directement l'expression des gènes dans l'hypothalamus, ainsi que de perturber la régulation en aval de structures limbiques 15-18. Perturbation du bon fonctionnement de l'axe HHS a été montré pour contribuer à l'augmentation colorectal 19-22 16 sensibilité affichée par les modèles de NMS de rongeurs, mais malgré une caractérisation de l'effet à long terme de 23-25 postnatale inflammation de la vessie, de l'impact de début stress de la vie a largement pas été étudié dans les organes génito-urinaires. Par conséquent, l'étude suivante décrira comment effectuer NMS chez les souris et plus tard d'évaluer la sensibilité mécanique périgénitale et l'infiltration des mastocytes / activation dans la prostate pour valider l'utilisation de souris mâles NMS comme un modèle préclinique pour CP / CPPS.
De tous les troubles diagnostiqués de douleurs pelviennes chroniques, CP / CPPS est peut-être le syndrome de moins bien reconnu et caractérisé, en dépit d'une prévalence à vie d'environ 14% 26 et les coûts annuels de patients estimés à $ 4400 (deux fois celle de la lombalgie ou la polyarthrite retour l'arthrite 27). Les patients atteints de CP / CPPS rapport douleurs au niveau du périnée, du rectum, de la prostate, pénis, testicules, et / ou à l'abdomen 28, l'expérience d'un salutgher degré de stress psychologique que les patients témoins 29, et couramment présente avec des symptômes de ou sont diagnostiqués avec la douleur ou les troubles de l'humeur pelviennes chroniques concomitantes 5,29-31. Infection récurrente, l'épithélium qui fuit, une inflammation neurogène, et l'auto-immunité ont tous été supposé que les causes sous-jacentes potentielles de CP / CPPS 2,32,33, ainsi que l'activation des mastocytes et la dégranulation 34. Sécrétions prostatiques exprimé à partir d'hommes atteints de CP / CPPS avaient augmenté tryptase des mastocytes et le facteur de croissance des nerfs (NGF) niveaux 34, et une étude plus récente confirme que la tryptase et la carboxypeptidase A (CPA3), un marqueur de l'activation des mastocytes, ont également été augmenté dans le urine de patients CP / CPPS 35. Le rôle potentiel des mastocytes dans l'apparition et le maintien de CP / CPPS a été une préoccupation majeure de la recherche animale sur ce syndrome jusqu'ici. Le modèle de rongeur le plus couramment employé utilisé pour étudier CP / CPPS est une prostatite auto-immune expérimentale (PAE) modèle gensurvoltage par injection sous-cutanée de l'antigène de la prostate dans de l'adjuvant complet de Freund, qui se traduit par des degrés variés de l'inflammation de la prostate selon l'espèce et la souche utilisée 34,36-39. Il a été démontré infiltration de cellules de mât et l'activation / dégranulation à augmenter après l'induction de l'EAP 34,35,40. Les souris transgéniques déficientes en soit mastocytes 34 ou le récepteur PAR2 tryptase 35 ne développent pas la sensibilité de la prostate tactique suivante EAP, contrairement aux souris de type sauvage du PAE. Bien que ce modèle préclinique reproduit bon nombre des caractéristiques de CP humaine / CPPS, le protocole d'induction ne sont pas indicatifs de la condition humaine, qui a une étiologie diverse et souvent ne comporte pas l'inflammation directe, une infection ou une blessure de la prostate.
L'influence de début stress de la vie sur le développement de CP / CPPS chez les humains est largement passée objet d'aucune enquête; Toutefois, une étude menée par Hu et al. 41, a démontré que moin qui ont rapporté une histoire de physique de l'enfance, émotionnel, et / ou d'abus sexuels étaient beaucoup plus susceptibles d'éprouver des symptômes évocateurs d'CP / CPPS. En outre, ils ont montré que la douleur et les scores urinaires ont été augmentées chez les patients ayant des antécédents de violence physique et psychologique. Nous avons précédemment démontré que le même paradigme dans NMS femelle C57BL / 6 souris produit une hypersensibilité vaginal et l'expression du gène anormal à la fois dans le vagin et la vessie suggestif de sortie de l'axe HPA 16 dysfonctionnelle. Cette preuve combiné avec la forte prévalence de CP / CPPS patients présentant des comorbidités 42 autres, y compris les IC / PBS et troubles de l'humeur, qui ont été présentées plus clairement être lié à la vie tôt le stress exposition 12-14, fournit la justification de l'utilisation d'un NMS modèle d'enquêter CP / CPPS chez la souris.
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Protocol
Toutes les expériences décrites dans ce protocole sont conformes aux directives du NIH en conformité avec les orientations définies par l'Université du Kansas Medical Center Institutional Animal Care et l'utilisation Comité.
1. Séparation néonatale maternelle (NMS)
- Surveiller barrages enceintes quotidienne pour les naissances de litière.
Remarque: Le jour de la litière est né est considéré P0. - Sur P1, enlever le barrage de la cage de la maison et placer dans un récipient secondaire propre.
- Frottez une poignée de literie entre les mains propres gantée de maintenir parfum de la cage de la maison.
- Ajouter une profondeur de 1 - 2 cm de la maison de la literie cage dans un endroit propre, marquée de manière appropriée 2 L verre bécher. Ajouter environ la moitié de tout matériel supplémentaire d'enrichissement de literie qui est présent dans la cage d'accueil, par exemple, nestlet, papier froissé, dans le bêcher en verre.
- Placez délicatement tous les chiots à partir d'une seule portée, individuellement, dans le même bécher.
- Placer immédiatementle bêcher dans un incubateur maintenu à 33 ° C et 50% d'humidité pendant 180 min.
- Retirer le barrage de l'emballage secondaire et son retour à la cage de la maison. Retourner la cage à domicile à son lieu d'habitation approprié dans le vivarium.
- Répétez cette procédure pour chaque portée subir NMS, en utilisant des gants propres et des récipients secondaires pour chaque portée / barrage.
- À la fin de la période de séparation de 180 min, retourner les litières à leurs cages à domicile dans le même ordre qu'ils ont été enlevés.
- Récupérer la cage d'accueil de la première portée qui a été séparé plus tôt dans la journée. Retirer le barrage de la cage de la maison et placer dans un récipient secondaire propre.
- Retirer le premier bécher de l'incubateur et frotter une poignée de literie entre les mains gantées propres à maintenir le parfum de la cage de la maison lors de la manipulation des chiots.
- Déplacez doucement les chiots, individuellement, du bécher à la cage de la maison.
- Retour tout enrichissement et de la literie en restant dans le bécher pourla cage de la maison.
- Retour du barrage du conteneur secondaire à la cage de la maison et de le retourner à son lieu d'habitation approprié dans le vivarium.
- Rincer le bécher avec de l'eau et de le retourner à l'incubateur. Utiliser le même bêcher pour chaque portée tout au long de la procédure de séparation.
- Répétez cette procédure pour chaque portée subir NMS dans le même ordre qu'ils ont été placés dans l'incubateur.
- Répétez cette procédure pour chaque ensemble subissant litière NMS chaque jour grâce à la P21.
- Sevrer leur progéniture NMS et naïfs sur P22 en plaçant congénères du même sexe ensemble dans des cages propres complets avec de la nourriture et de l'eau. Naïve chiots doivent être nés et logés dans les mêmes conditions que les souris NMS, mais subissent aucun traitement supplémentaire en dehors des tâches normales d'élevage.
2. péri-Sensibilité mécanique
- von Frey Appareillage
- Apportez les souris à la salle d'examen et de leur permettre d'acclimater 30min tout en restant dans leur cage d'origine.
- Préparer la zone de test en plaçant une alèse absorbante sous un fil élevée tableau maille filet (79 cm x 28 cm) qui offre suffisamment d'espace pour permettre à l'enquêteur d'approcher de la face inférieure sans effaroucher les souris, environ 55 cm de hauteur.
- Placez jusqu'à 12 souris, individuellement, sous, les chambres de plastique perforés claires (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) sur le dessus de la table de treillis métallique. Placez un objet lourd sur le dessus des chambres pour empêcher les souris de se échapper.
- Acclimater la souris pour un 30 minutes supplémentaires sur l'écran avant l'évaluation de seuil de retrait.
- Évaluation périgénitale Sensibilité mécanique
- Effectuer la méthode de haut en bas en utilisant un ensemble standard de gradués monofilaments von Frey 43. Utilisez les monofilaments suivantes: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g et 4,74 g.
- Maintenir la base de la g monofilament 3.22 et exposer le mono rétractéefilament.
Remarque: Certains modèles peuvent ne pas avoir un monofilament rétractée. - Situer la sonde de telle sorte que le monofilament est orienté verticalement et lorsque la souris est alerte, immobile, et son poids du corps est réparti également entre les pattes de derrière l'appliquer soit à la gauche ou à droite du scrotum, en évitant la ligne médiane, jusqu'à ce qu'une légère pli est observé dans le filament.
- Tenez le monofilament en place pendant 10 secondes ou jusqu'à ce que l'animal montre une réponse positive.
Remarque: Une réponse positive est considérée comme une secousse rapide ou saut en réponse à la demande de monofilament ou léchage ou de comportement de morsure dirigé vers le monofilament. Si les mouvements de la souris lors de l'application de monofilament de 10 sec sans afficher ces comportements, le monofilament doivent être retestés après une 1 min longue période minimale de repos. Si une souris se déplace ni ni présente l'un des comportements énumérés ci-dessus lors de l'application de monofilament de 10 sec, il est considéré comme une réponse négative. - Enregistrer la réponse, positive ou négative, dans un cahier de laboratoire ou un ordinateur portable et répétez cette procédure sur toutes les souris restantes en utilisant la 3,22 g monofilament.
- Testez toutes les souris de nouveau en utilisant la prochaine monofilament appropriée. Remarque: Si la souris a présenté une réponse négative au monofilament 3,22 g, 3,61 g appliquer le monofilament de la même manière et enregistrer la réponse. Si la souris a montré une réponse positive à la monofilament 3,22 g, 2,83 g appliquer le monofilament et enregistrer la réponse.
- Maintenir la base de la g monofilament 3.22 et exposer le mono rétractéefilament.
- Continuer l'essai de chaque souris en utilisant la prochaine monofilament plus ou moins, selon le cas, pour une période supplémentaire de 4 applications après la première réponse positive est observée.
- Souris Retour à cages à domicile.
- Utilisez la valeur de la finale monofilament von Frey appliquée dans la série de procès dans des unités de journaux pour calculer un seuil g de retrait de 50% comme décrit dans Chaplan et al. 43.
- Effectuer la méthode de haut en bas en utilisant un ensemble standard de gradués monofilaments von Frey 43. Utilisez les monofilaments suivantes: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g et 4,74 g.
- Traitement des tissus
- On dissèque le tissu de la prostate à partir de 44 souris qui ont été perfuses avec intracardiaque glacée paraformaldehyde à 4% 45. Postfix le tissu dans du paraformaldéhyde 4% pendant 1 heure à température ambiante puis cryoprotect dans 30% de saccharose dans 1 x PBS à 4 ° CO / N.
- Préparer un petit (30 ml) de bain d'heptane et le placer sur la glace sèche.
- Rincez le tissu de la prostate chez 1x PBS et sécher en utilisant un devoir essuyer la lumière.
- Insérez le tissu de la prostate dans l'heptane froid jusqu'à ce qu'il soit congelé.
- Immédiatement placer le tissu de la prostate congelé dans un contenant cryomoule milieux de montage et les placer sur carboglace.
- Magasin cryomoules à -20 ° C.
- Transversalement couper le tissu de la prostate en 7 cryosections um d'épaisseur à l'aide d'un cryostat.
- Passer 8-12 cryosections non-série qui couvrent la longueur du tissu, sur des lames de microscope chargés positivement.
- Magasin terminé diapositives à -20 ° C jusqu'à leur traitement ultérieur.
- Préparation acidifiés bleu de toluidine
- Ajouter 1 g de bleu de toluidine O à 100 ml 70% d'éthanol et de vortex jusqu'à en solution pour préparer une solution mère à 1%. La solution stock peut être conservé à température ambiante pendant jusqu'à trois semaines.
- Ajouter 1 g NaCl à 100 ml d'eau dans un bécher placé sur le dessus d'une plaque d'agitation.
- Ajuster le pH de la solution de NaCl en utilisant du HCl 12 M jusqu'à un pH de 0,5 à 1,0 est atteint.
- Préparer la solution de travail de 0,25% bleu de toluidine en combinant 8 ml de la solution de bleu de toluidine et 32 ml de la solution de NaCl à 1%. Introduire à la pipette de haut en bas pour assurer l'incorporation totale de la solution stock bleu de toluidine et mélanger à l'aide d'un vortex. La solution de travail doit être fait frais et jeté après utilisation.
- La coloration de la prostate cryosections
- Retirez les diapositives à être transformés du congélateur et laisser équilibrer à température ambiante pendant environ 30 mdans.
- Laver les coupes de tissu par immersion individuellement les diapositives pendant environ 1 seconde dans un tube conique de 50 ml contenant une quantité suffisante de PBS 1x faire en sorte que les coupes de tissus montées sur les glissières seront complètement immergés. Laisser les lames sécher à l'air sur une serviette en papier.
- Placer les lames dans un bocal de coloration de verre contenant suffisamment de solution de travail bleu de toluidine 0,25% à veiller à ce que les coupes de tissus les diapositives montées seront complètement submergés et incuber pendant 10 - 15 min tandis que sur une plate-forme rocker fixé à 15 tours par minute.
- Tremper les lames dans du PBS 1X pour environ 1 sec pour laver l'excès de bleu de toluidine.
- Placer les lames dans une boîte à tiroir ou un rack de telle sorte que les coulisseaux se trouvent sur les côtés pour permettre le drainage.
- Sécher les lames dans un four à 37 ° C pendant un minimum de 2 heures ou O / N à température ambiante.
- Déshydrater diapositives rapidement en utilisant de l'alcool, permettant aux diapositives sécher complètement entre les expositions à l'alcool. Diapositives sec, par une vidange sur une serviette en papier unnd dos d'essuyage et les bords avec un devoir essuyer la lumière.
- Plonger les lames dans EtOH à 95% pendant environ 1 sec et laisser sécher complètement. Répétez cette procédure 1 - 10 fois jusqu'à ce que le tissu sèche plus bleu que la pourpre.
- Plonger les lames dans EtOH à 100% pendant environ 1 sec et laisser sécher complètement. Répétez cette procédure 1 - 10 fois jusqu'à ce que le tissu est foncé au bleu moyen, mais pas violet.
- Fixer la tache en incubant les lames dans 100% de xylène pendant 3 min. Laisser sécher.
- Lamelle les diapositives avec du glycérol, PBS, ou supports de montage permanent basé xylène. Égoutter les supports en excès et stocker à température ambiante.
- Cellules Quantifier Mast
- Visualisez les coupes de tissus de toluidine bleui à un grossissement de 20x en utilisant la microscopie optique (figure 2).
- Compter le nombre total des mastocytes présents dans la zone et de visualiser la différence entre les mastocytes et non dégranulés dégranulés. 40X magnification peut être nécessaire de confirmer l'état de granulation dans des mastocytes.
Remarque: les mastocytes non-dégranulés présentent métachromasie dense avec pas ou contour faible nucléaire et / ou ne extrusion granulaire autour de la cellule. Mastocytes dégranulés présenter métachromasie moins intense et d'avoir un aperçu clair évidente du noyau et / ou de granules libres dans le cytoplasme et à l'extérieur de la frontière de la cellule. - Continuer d'évaluer le nombre total de mastocytes non dégranulés dégranulés et dans la totalité de la coupe de tissu en cours. Répétez cette procédure sur au moins 7 sections supplémentaires distincts, couvrant la longueur de chaque tissu.
- Calculer le pourcentage de dégranulés (DG) de mastocytes totaux pour chaque tissu / souris selon l'équation suivante: (DG mastocytes / Total mastocytes) x 100.
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Representative Results
Les souris qui ont subi NMS a montré des preuves de comportement indicatif de CP / CPPS. Lors d'un essai avec une série graduée de monofilaments von Frey, souris NMS 8 semaines-vieux (n = 4) affiché allodynie mécanique périgénitale par rapport à leurs homologues naïfs (n = 5, figure 2). Ceci est démontré qu'une réduction significative (p <0,01; test t de Student) dans le seuil de retrait mécanique qui a suscité une réaction positive des comportements, enregistrée comme une secousse rapide ou saut en réponse à la demande de monofilament ou léchage ou le comportement de morsure dirigé vers le monofilament .
Les souris qui ont été exposés à NMS affichent également des signes histologiques de CP / CPPS. des sections de cryostat du tissu de la prostate sont colorées avec du o-toluidine bleue acidifié à observer granules de tryptase logés dans les mastocytes (figure 3A-D). Le pourcentage des mastocytes qui a montré la preuve de l'activation, par exemple, diffuse metachromasia, granulés présents à l'extérieur de la frontière de la cellule (figure 3D), a été significativement augmentée dans le tissu de la prostate de souris NMS 8 semaines-vieux, comparativement à naïve (p <0,0001, test t de Student, figure 3E). Le nombre total des mastocytes infiltrés, indépendamment du statut de granulation, n'a pas été significativement différente entre les naïfs (99,5 ± 15,2 cellules / section) et les souris NMS (108,2 ± 22,5 cellules / section).
Figure 1. ligne de temps de procédure. Le schéma décrit une ligne de temps recommandée pour effectuer la méthodologie décrite. La séparation maternelle néonatale (SMN) est effectué tous les jours de postnatale jour (P) 1 jusqu'à P21 et les souris sont sevrés sur P22. Les souris ne sont pas perturbés en dehors de l'élevage normal jusqu'à 8 semaines d'âge quand ils sont testés pour sens mécaniques périgénitaleibilité. Si la même souris vont être évalués pour la coloration des mastocytes, une semaine devrait être autorisé à écouler tests comportementaux suivant pour permettre des effets de contraintes résiduelles à résoudre.
Figure 2. péri-sensibilité mécanique. Péri-sensibilité mécanique a été mesurée en utilisant l'application de monofilament von Frey. Des souris mâles ayant subi une séparation de la mère du nouveau-né (NMS) ont montré une réduction significative de seuil de retrait, par rapport à des souris naïves, indicatifs de l'allodynie mécanique. Les données représentent moyenne SEM, n = 4 pour chaque groupe. * P <0,05, test t de Student.
Figure 3. L'activation des mastocytes. Toluidine acidifié bleu a été utilisée pour visualiser les granules de tryptase et calculer le pourcentage de mastocytes activés / dégranulés dans les sections de cryostat du tissu de la prostate. Photomicrographies représentatifs sont présentés de toluidine sections colorées en bleu de naïve (A) et NMS (B) de la prostate avec des flèches indiquant intacts (non-dégranulés) et des pointes de flèches indiquant activés (dégranulés) mastocytes. La hausse des images agrandies de naïve (C) et NMS (D) de la vessie sont présentés pour illustrer les différences histologiques de non-dégranulés (C) et (D) dégranulé mastocytes. Un pourcentage significativement plus élevé de cellules de mât dégranulés ont été observés dans les sections de la prostate de souris NMS par rapport à des souris naïves (E). Les données représentent moyenne SEM, n = 4 pour chaque groupe. **** P <0,0001, test t de Student.= "_ Blank"> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole fournit une méthodologie pour utiliser le stress néonatal, sous la forme de NMS, pour induire une symptomatologie indicatif de CP / CPPS chez les souris mâles adultes. Comme les adultes, les souris NEM affichent allodynie mécanique périgénitale importante, ainsi que la preuve de la dégranulation des mastocytes dans le tissu de la prostate. L'utilisation de NMS est une nouvelle approche pour développer un modèle préclinique de CP / CPPS en ce qu'elle reproduit le stress de la vie au début qui est souvent rapporté par les patients souffrant de douleurs pelviennes chroniques 12-14, ainsi que l'intégration d'une induction non-invasive, comme opposition à plus couramment utilisé, chemically- et l'inflammation de la prostate 34,36-39 immunologique induite. En outre, NMS chez la souris a été montré pour produire symptomatologie comorbidité, y compris les comportements d'anxiété-comme et anhédoniques altérés, l'augmentation des taux de la miction, et la patte arrière hypersensibilité (16; données non présentées), similaire aux somatiques, l'humeur et des troubles viscéraux concomitantes exposées par CP / CPPS patients 4-6.
Le principal avantage de l'utilisation de NMS pour induire CP / CPPS chez la souris est qu'il utilise une intervention psychologique pour amorcer les changements physiologiques. Les patients atteints de CP / CPPS ont étiologie variante largement ne comporte pas une infection antérieure, ou dommage direct à la prostate 1-3. En dépit de ce fait, les modèles affichés CP / CPPS ont incorporé inflammation directe ou indirecte de la prostate pour provoquer une hypersensibilité de la région périgénitale et / ou l'activation des mastocytes. Une proportion importante des CP / CPPS et les patients de la douleur pelvienne chronique en général, le rapport ayant connu l'adversité de la vie précoce, qui a largement pas été étudié dans des modèles rongeurs de syndromes de douleur urogénitale. Les travaux antérieurs de notre laboratoire a montré que NMS induit hypersensibilité vaginale et la perturbation associée du bon fonctionnement de l'axe HPA 16. Les travaux futurs en utilisant ce modèle va étudier les mécanismes qui sont entraînés au début de stress de la vie pour produire des til a modifié le phénotype à l'âge adulte, ainsi que d'explorer les interventions pharmacologiques ou mode de vie potentielles qui pourraient être appliquées dans un cadre préclinique ou clinique.
Obtenir des résultats optimaux et reproductibles de ce protocole dépend de l'observation de plusieurs étapes critiques qui peuvent avoir besoin d'être optimisé en fonction de l'environnement et de l'équipement utilisé. Considérant que NMS affecte considérablement le fonctionnement de l'axe HPA, il est important de contrôler les stimuli extérieurs et le stress de l'environnement au cours de deux périodes néonatale et adultes. , Souris naïves-traitées non appariés selon l'âge doivent être nés et logés en concordance avec chaque cohorte de souris NMS pour contrôler les facteurs de stress externes présents dans l'environnement qui peuvent affecter le développement de l'axe HPA. Il est important de déterminer le nombre de souris nécessaires pour réaliser l'expérience prévue avant d'entreprendre l'élevage ou de commander les femmes enceintes dans l'animalerie. NMS Lors de l'exécution, les greatest préoccupation est le rejet des chiots par le barrage, il est donc impératif de maintenir le parfum de la cage de la maison à travers le protocole NMS. Pour minimiser les effets de rythmes diurnes, le temps de séparation proposé pour NMS est au milieu du cycle de lumière (11 heures-14 heures). Mesures de sensibilité périgénitale devraient être obtenus chez les souris mâles adultes en pleine maturité, environ 8 semaines d'âge, et pris à la même heure de la journée pour chaque groupe, de préférence au début du cycle de lumière afin de coïncider avec le creux de rythmes diurnes. Pour réduire l'apparition de mouvements non-évoqués au cours de cette procédure, les évaluations peuvent être réalisées dans une pièce insonorisée à température contrôlée avec un bruit blanc à jouer (20 - 20 000 Hz). Le même enquêteur doit évaluer tous les seuils de retrait tout au long de l'étude pour maintenir la cohérence dans l'observance des réponses positives et négatives. Comme alternatives à mesurer le seuil mécanique de 50%, la fréquence de prélèvement à un seul cou de monofilamentld évaluée ou un appareil électronique von Frey 46 pourrait être utilisé. Pour la visualisation des mastocytes, toutes les diapositives qui sont à analyser doivent être traitées ensemble pour assurer l'égalité de coloration des mastocytes, que l'intensité de la coloration peut varier entre les expériences. Un pH inférieur à 1,0 est nécessaire pour un bon contraste entre les mastocytes Deep Purple et le fond bleu clair. Trop de rinçages dans de l'alcool peuvent se laver la tache des mastocytes et affecter négativement le contraste. Enfin, la superposition d'une grille sur le tissu peut être utile pour le comptage des cellules tout au long de la coupe de tissu ensemble.
Plusieurs aspects doivent être pris avant l'utilisation de NMS pour induire CP / CPPS ou troubles de la douleur centralisée liés. Tout d'abord, la grande majorité des publications qui ont intégré début stress de la vie ont été faites dans les modèles de rats de SMN, en utilisant une période de séparation tronquée de P1 - P14. De nombreux groupes ont montré que ce paradigme génère une symptomatologie IBS-comme dans rats et souris 15; Cependant, dans notre étude précédente, un P1 - période de séparation de P14 dans C57BL / 6 n'a pas généré une augmentation significative de la sensibilité vaginale 16, pas plus qu'elle n'a générer hypersensibilité colorectal (données non présentées). Par conséquent, les espèces et la longueur de NMS peuvent déterminer le résultat spécifique à l'âge adulte, y compris la gravité de la symptomatologie et l'organe spécifique (s) qui est affecté. Deuxièmement, les changements comportementaux et moléculaires résultant de NMS sont en grande partie due à la dérégulation de l'axe HPA 15-18, ce qui suggère que l'effet est au centre-médiation et pourrait avoir des résultats de comorbidité, y compris des changements dans Anxiété et / ou des comportements de dépression comme et sensibilité accrue dans d'autres organes pelviens ou des endroits plus éloignés. Ce phénotype comorbidité est indicatif de ce qui est communément vu cliniquement et peut être plus représentatif de patients CP / CPPS dans son ensemble 5,28-31,42. Troisièmement, sur la base de ces changements se produisant à la suite d'axe HPA dysregulation, l'impact du stress devrait être de plus grande préoccupation à la fois pendant la procédure NMS et les tests de comportement plus tard et une analyse in vitro. Sortie de l'axe HPA est diurne, avec plus de sortie pendant le cycle d'obscurité plus active et la sortie moins pendant le cycle de la lumière plus de repos, ce qui pourrait influer sur l'issue du comportement ou une analyse in vitro selon la période de l'essai / sacrifier 47. De même, l'exposition à des facteurs de stress, y compris l'objet de tests de sensibilité mécanique périgénitale, peut transitoirement effectuer fonctionnement de l'axe HPA 18 et de modifier potentiellement expression du gène dans les régions du cerveau associées et les tissus périphériques en aval.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant C57BL/6 female mice | Charles River | 027 | Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth. |
| 2 L glass beaker(s) | Sigma-Aldrich | CLS10002L | Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period. |
| VWR Forced Air Incubator, Basic | VWR International | 414005-124 | The incubator should be held at 33°C and 50% humidity. |
| Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) | Stoelting | 58011 | The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g. |
| Animal Enclosure (12 mice 6 rats) | IITC | 435 | Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. |
| Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) | IITC | 410 | Place stand on a stable table top for comfortable access. |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight. |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | Chill heptane on dry ice to freeze tissue. |
| Standard Cryomold | VWR International | 4557 | To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning |
| Tissue-Tek OCT Compound | Sakura | 4583 | 12 x 125 ml |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR International | 48311-703 | 75 x 25 x 1 mm |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells. |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections. |
| GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes | BioExpress | C-3394 | Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS. |
| Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover | Fisher Scientific | 08-815 | Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene. |
| Xylenes (Histological) | Fisher Scientific | X3P | Once dehydrated, tissue is cleared with xylene. |
| Microscope Slide Boxes, 100-Place | VWR International | 82003 | Boxes can be used for storage and transportation of slides. |
| Fisherbrand Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 22-363-400 | These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol is a traditional mounting medium. |
| Mounting Medium, Richard-Allan Scientific | VWR International | 4111 | Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide. |
| Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 | VWR International | 48393-106 | A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample. |
| Light Microscope | Nikon | The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E. |
References
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