Protocol
1. Framställning av Agar Injektions Plates (Tid: 45 min)
- Koka 2% till 3% agaros i E3 media och låt lösningen svalna något på bänken. Obs: Antalet insprutningsplattor förbereds dikterar mängden agaros krävs. Varje injektion plattan behöver ca 35 ml av agaroslösningen.
- Efter kokning, tillåta agarosen svalna tills önskad temperatur uppnåtts (t.ex.., 45 ° C) såsom per sprutformen tillverkarens instruktioner.
- Häll ca 35 ml av den kylda agarosen in i en 100 mm skål.
- Placera ena änden av föredragna injektion mögel i lösning, sedan lägga resten av mögel på agaroslösning (detta kommer att bidra till att minska förekomsten av luftbubblor).
- Låt agaroslösningen stelna antingen vid RT eller 4 ° C i ungefär 30 minuter.
- Använd en spatel för att separera en ände av formen från den fasta agarosen. Sakta ut resten av m gammal.
2. Framställning av Evans Blue Dye (EBD) Injektion Blanda (Tid: 30 min)
- Gör en 1% stam av EBD i 1X Ringers lösning (155 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 2 mM Na 2 HPO 4; 10 mM HEPES; 10 mM glukos; pH till 7,2), som kan lagras vid RT.
- Gör en stamlösning av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -dextran MW 10 tusen kDa vid 25 mg / ml i 1X Ringers lösning och förvara vid -20 ° C.
- Förbered injektion mix genom att späda EBD till 0,1% direkt i stamlösning av FITC-dextran lager (dvs. för en slutlig arbetsvolym av 100 ul. Blanda 10 il 1% EBD på 90 il FITC dextran lager).
- Grundligt virvel injektion mix (det ska bli grön) och hålla sig borta från direkt ljus genom att linda injektion mix rör i aluminiumfolie.
3. EBD injektionsberedning (Tid: Cirka 30 min)
ent "> Obs: Protokoll fungerar bäst med larver från 3-7 dagar efter befruktningen (DPF).- Pre-varm injektion plattan RT.
- Ställ in injektionsapparaten genom att arrangera mikromanipulator på plåt och stå bredvid mikroskopet används för injektion. Slå på luftdriven mikroinjektion controller. Obs: Det föredragna insprutningssystemet varierar beroende på labbet och bör inte ändra resultatet av analysen.
- Tillbaka fylla injektionsnålen med cirka 2-4 il EBD mix.
- Kalibrera injektionsvolymen till cirka 5 nl av EBD mix. Obs: Injektionsvolym kalibrering beror på kalibreringsmetod. En kolv driven injektion direkt kan sättas till ett givet injektionsvolym medan gastrycks injektorer behöver injektionsvolymen kalibreras via volym bolus med användning av en mikrometer.
- Våt injektion tallrik med 1X Ringers lösning och avlägsna överskott från brunnar.
- Pre-treat larver med 0,04% etyl-3-aminobensoat metansulfonat salt (tricaine) utspädd i 1 x Ringers lösning för att immobilisera larver före starten av injektionen. Obs: Se till larver är helt orörliga är viktigt eftersom ordentlig injektion är svårt med eventuell kvarvarande rörelse.
- Placera bedövade larver i brunnar i agar injektionsplåtarna med en glaspipett. Se till att larverna är helt inuti brunnen och ligger på sin sida. Obs: Antalet larver per brunn är upp till försöksledaren.
- Efter larver placeras i brunnarna, avlägsna överskott Ringers lösning för att minimera larver rörlighet inom väl. Lämna en restmängd av lösning så att larverna inte torka.
4. Perikardiell Injektion av Zebrafish Larver med EBD (Tid: Beroende på antal larver injicering, uppskattningsvis 1-3 timmar)
- Placera injektions skylt som innehåller larver på en dissekera omfattning där injektionerna kommer att utföras.
- Placera injektionspipetten nålen innehållandeEBD blanda över en zebrafisk larver.
- Re-positionen insprutningsplattan genom att vrida den så att injektionsnålen är nära larver hjärta och ungefär 45 ° ventralt från den främre-bakre axeln.
- För in injektionsnålen i den gemensamma kardinal ven (CCV) i området av venen vid den främre delen av äggulan där venen initialt vrida i dorsal riktning (figur 1). Obs: En förstoring på upp till 40x kan vara bra att tydligt se CCV.
- Injicera 5 nl av EBD mix och hålla injektionsnålen i läge för 5-8 sekunder för att minimera omedelbara läckage av EBD mix. Obs: En bra injektion kommer att ha färg färgning ses i hjärtats kammare (Figur 1). Om EBD mix inte observeras i hjärtat, sedan injicera ytterligare 5 nl av EBD mix kan vara tillräcklig för att framkalla färgupptagning. Alternativt kan embryot kasseras.
Obs! I vissa situationer kan hjärtat slutar slå. Om denna Occurs, fortsätta att övervaka larverna för 20-40 sekunder. Typiskt återupptar hjärta slå när färgämnet rör sig genom cirkulationssystemet. - Flytta till nästa larver och upprepa.
- Identifiera framgångsrikt injicerade embryon genom att observera närvaron av FITC-dextran i vaskulaturen omedelbart efter injektion (fig 2).
5. Inkubering och EBD Upptag (Tid: 4-6 timmar)
- Efter det önskade antalet larver injiceras, retur injicerade larver till 1X Ringers lösning utan tricaine i 100 mm skålar.
- Håll rätter inslagna i aluminiumfolie. Obs: Att hålla injiceras larver i mörker ökar kraftigt överlevnad och säkerställer den största konsekvensen i signalstyrka. Omslags i aluminiumfolie är särskilt viktigt för den tidsperiod som larverna är utanför inkubatorn.
- Låt larver inkubera vid 28,5 ° C under 4-6 timmar för att säkerställa tillräcklig EBD upptag. 6. Visualisering av EBD i Muscle (Tid: Beroende på antal larver injicering och typ av mikroskopi, beräknade 0,5-3 timmar)
- Före avbildning, bedöva larverna med 0,04% tricaine att förhindra rörelse.
- Se larver under rött fluorescens för att bestämma om EBD upptag sker i skelettmuskulaturen (Figur 3).
Representative Results
EBD injektionsblandningen injicerades i CCV av sapje homozygota mutanter och vildtyp syskon vid 3 dpf. Injektioner som fyllde hjärtkamrama (Figur 1B) analyserades sedan för lyckad injektion genom att visualisera FITC-dextran i vaskulaturen under grönt fluorescens (figur 2).
Efter en fyra timmars inkubation period var EBD upptag undersöktes på somit nivå med hjälp av fluorescensmikroskopi. Vildtyp syskon uppvisade ingen EBD fluorescens inom några synliga muskelfibrer (Figur 3A), medan de sapje homozygota mutanter visade EBD upptag, vilket indikerar skada på muskelmembran 15 (figur 3B).
Figur 1. Injicera EBD insprutningsblandningen i gemensamma kardinal ven (CCV) hos en zebrafisk embryo. (A) icke-injicerade embryot. Arrow betecknar idealisk plats för CCV injektion. (B) Framgångsrik injektion i CCV. Färgämnet går in i hjärtats kammare (pil) och börjar att pumpas genom vaskulaturen. (C) En misslyckad CCV injektion kommer att resultera i några eller alla av färgämnet in gulesäcken av embryot (pilen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Embryon kan sorteras för lyckad injektion genom att observera FITC-dextran distribution under grön fluorescens hela kärl omedelbart efter injektionen och före EBD upptag.Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: EBD kommer att tas upp av fibrer med skadade membran (A) vildtyp syskon visar ingen EBD fluorescens i muskelfibrerna.. (B) Sapje homozygot mutant med EBD fluorescens inom flera muskelfibrer (pilar). Alla larver injicerades med EBD injektionsblandningen och analyserades efter en 4 h inkubationsperiod vid 3 DPF. Syskon och mutanter sorterade muskelfibrer lossnar före CCV injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Zebrafisk växer fram som ett kraftfullt verktyg för att studera neuromuskulär sjukdom 2,29. Hittills har zebrafisk systemet använts för att validera nya muskel sjukdomsalstrande mutationer 16,17,30, belysa nya pathomechanisms 18, och identifiera potentiella nya terapeutiska läkemedel 12,24. Dessa kollektiva ansträngningar har etablerat nyttan av zebrafisk att modellera mänskliga neuromuskulära sjukdomar. Trots de framsteg som gjorts med zebrafisk och däggdjurs modeller, det finns begränsade behandlingsalternativ för patienter inom brett spektrum av neuromuskulära förhållanden. Därför finns en stor efterfrågan för terapi utveckling för denna grupp av förödande sjukdomar. Parallellt denna efterfrågan på läkemedel är motsvarande behovet av pågående experimentella innovation, samt en noggrann analys för att verifiera nya djurmodeller och förmodade terapeutiska strategier.
EBD-analys används ofta i musmodeller förstudie vävnad och cellskador i hjärnan, hjärtat och skelettmuskulaturen 27,31. Framför allt är EBD används flitigt i musmodeller av olika muskeldystrofi subtyper att visa allvaret i muskelmembran instabilitet och skada 8. Användningen av EBD att avslöja muskel membranskada är en stödjande parameter upprättandet likheter i djurmodell för att den mänskliga sjukdomstillståndet 9. Kraften i EBD i mus har lett flera laboratorier, inklusive vår egen, att utveckla och tillämpa EBD till zebrafisk modeller av neuromuskulär sjukdom. På grund av tillämpligheten av EBD analys är denna teknik aktivt genomförs för att bekräfta zebrafisk modeller till den mänskliga sjukdomstillståndet 11,15,22,24,32. Larver med skadade muskelmembran har EBD upptag och därför röd fluorescens inom muskelfibrer. Fluorescens observerades i inter-fiber utrymme, men inte inom de enskilda muskelfibrer kan också vara informativ fibrer lossnar från basalmembranet i than avsaknad av membranskada, ger användbar diagnostisk detalj. EBD-analys har potential ansökan bortom djurmodell validering. Insatser från vårt labb har nyligen visat att EBD analys är fördelaktigt att validera potentiellt nya terapeutiska läkemedel 24. Avgöra om potentiella terapeutiska behandlingar minska eller avskaffa EBD upptag i neuromuskulära sjukdomsmodeller kan betyda relevant terapeutiska verkan 8. Denna typ av analys kan hjälpa till att etablera den mekanism (er) av terapeutika och expanderar tillämpningen av EBD analys.
I likhet med många tekniker, inte EBD analys har flera förbehåll som skall iakttas vid experimentell design och praktik. Till exempel kan det vara svårt att identifiera CCV grund av förtjockningen av vävnaden med åldern. Dessutom är det lätt att skada larver som förberedelse före och under perikardiell injektionen, minska experimentella räknas och ökar behovet att prep stort antal larver.Dessutom kan fysiska skador på larver under hantering och injektion resultera i falska positiva som skadade muskler kan ta upp EBD. För att övervinna några av dessa hinder, har vi beskrivit en co-injektion strategi i denna video artikeln som gör det lätt och tillförlitlig identifiering av larver med framgångsrika färg infusion omedelbart efter injektionen och före efterföljande analys. FITC-dextran co-injektion kontroller för lyckad injektion genom att tillåta en bekräftelse på EBD i kärlsystemet före dess upptag av muskelfibrerna. Detta kan vara särskilt användbart när EBD fluorescens blir mycket diffusa larver efter flera timmar om det inte samlats in i muskelfibrerna; som sådan, kan det vara svårt att upptäcka. Dessutom saknas CCV och injicera EBD i gulan eller kroppskaviteten kan, efter inkubation, leda till diffus röd fluorescens liknande kontrollera embryon, men med minskad sannolikhet för upptag av skadade muskelfibrer. Kollektivt dessa grottaats föreslår EBD injektion kräver tålamod och praxis för att uppnå konsekventa och tillförlitliga resultat.
I alla, beskriver vi en praktisk och enkel metod för att utföra EBD analys på zebrafisk larver. Hittills har användningen av zebrafisk som ett modellsystem, särskilt som en mänsklig sjukdomsmodell, har snabbt växande. Denna expansion är delvis på grund av den fortsatta utvecklingen och ändrade experimentella tekniker som förbättrar på de nuvarande fördelarna med zebrafisk systemet. EBD injektionsteknik ger en extra och kraftfullt verktyg för en forskare arsenal för validering och studier av zebrafisk modeller muskelsjukdom. Den pågående genomförandet och modifiering av denna teknik har potential att bidra till att avslöja nya terapeutiska strategier samt sjukdoms orsakar mekanismer.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Trent Waugh för hans tekniskt bistånd. Vi erkänner också avdelningen av Pediatrics på sjukhuset för sjuka barn och Cure medfödd muskeldystrofi (CMD) för deras generösa stöd för detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
References
- Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
- Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
- Lancet, , 381-845 (2013).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
- Cohn, R. D., Campbell, K. P. Molecular basis of muscular dystrophies. Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).
- Yoshida, M., Ozawa, E. Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem. 108, 748-752 (1990).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
- Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
- Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
- Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
- Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
- Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
- Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.
- Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
- Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).
