Protocol
Tutte le procedure di sangue disegno devono essere effettuate da professionisti abilitati e certificati. L'utilizzo di soggetti umani per la ricerca riguarda l'approvazione del Institutional Review Board o altra autorità. Precauzioni particolari per quanto riguarda il consenso informato e che proteggono l'identificazione dei partecipanti devono essere seguite. Tutti gli esperimenti elencati in questo protocollo riguardano la manipolazione del sangue umano e / o di prodotti ematici e dispositivi di protezione adeguati devono essere indossati in ogni momento. I rifiuti dovrebbe essere considerata come rischio biologico e smaltiti secondo le norme.
1. venipuntura
- Identificare il paziente / partecipante e confermare con i record esistenti. Spiega lo studio in dettaglio e ottenere un consenso informato.
- Avere un vassoio impostato per singolo paziente con i tubi marcati su una superficie piana e stabile.
- Spiegare la procedura e rendere la seduta paziente comodamente con il braccio appoggiato. Informare il paziente che lui o she si sentirà una piccola presa e dovrebbe rimanere ancora tutta la procedura.
- Attaccare l'ago per l'adattatore.
- Lavarsi le mani e indossare guanti.
- Preparare la fossa antecubitale per venipuntura pulendo con il 70% di alcool isopropilico in cerchi concentrici dal centro verso l'esterno. Consentire al sito asciugare per 30 sec.
- Identificare la vena appropriata con la palpazione.
- Applicare il laccio emostatico 3-4 sopra il sito della puntura fare in modo che non sia troppo stretto (mentre ancora sentire il polso radiale).
- Eseguire la puntura venosa inserendo la smussatura dell'ago 15-30 gradi per la pelle in un unico movimento fluido. Spingere il tubo di raccolta del sangue attraverso l'ago e raccogliere 9 ml di sangue intero.
- Rimuovere il laccio emostatico. Rimuovere il tubo dall'ago.
- Ritirare l'ago ed applicare la piazza garza presso il sito di puntura prima della rimozione dell'ago. Smaltire l'ago in un contenitore adeguato a rischio biologico.
- Chiedi paziente di mantenere la pressure presso il sito di puntura.
- Etichettare i tubi
- Controllare il sito di puntura per essere sicuri che il sanguinamento si è fermato.
- Applicare bendaggio adesivo o nastro sulla piazza garza, chiedere se il paziente si sente bene (nessun dolore, gonfiore o testa leggera)
- Grazie al paziente / partecipante prima della dimissione.
2. L-PRF Preparazione
- Subito dopo la raccolta di sangue venoso nel tubo di vetro rosso secco ripiano, inserirlo nella centrifuga.
- Centrifugare a 400 xg per 12 minuti a temperatura ambiente dopo aver piazzato un contrappeso adeguato.
- Rimuovere il tubo al termine del ciclo. Notare la tre strati: povero di piastrine plasma (PPP), ricco di piastrine di fibrina (L-PRF) e base RBC (Figura 1).
- Aspirare il PPP con una pipetta. Con una pinzetta tirare delicatamente la L-PRF fuori e metterlo in una, rete metallica perforata sterile.
- Utilizzando bisturi chirurgico, raschiare la maggior parte di RBC strato lasciando cura il buffy cappotto intatto.
- Comprimere delicatamente il coagulo L-PRF (usando la piastra metallica sterili, peso approssimativo 225 g) per 30 sec. Plasma povero di piastrine sarà spremuto fuori.
- Rimuovere la piastra e sollevare delicatamente la membrana L-PRF. La membrana L-PRF è pronto per l'uso negli esperimenti 12.
3. uniassiale Prove di Trazione
- Luogo membrane L-PRF (n = 6) su una carta da filtro per facilità di trattamento e punzone in "ossa di cane" utilizzando metallo misura muore (2,75 mm di larghezza al loro punto più stretto con un tratto utile di 7,5 mm).
- Misurare lo spessore di ciascun campione a tre punti e fare la media.
- Impegnarsi con cautela la membrana L-PRF nel centro delle pinze a ganascia del sistema di prova uniassiale.
- Strappare con attenzione il supporto della carta filer per esporre la membrana L-PRF.
- Programmare lo strumento in modo che la testa mobile funziona ad una velocità costante (10.0 mm / min) e iniziare l'esperimento quando il L-PRF è ancora bagnato.
- Registrare il modulo elastico, energia per rompere, e deformazione a rottura del software che accompagna il sistema di prova monoassiale. Questi valori sono calcolati automaticamente e non è richiesta in ingresso definito dall'utente. Si prega di vedere la figura 3.
4. sutura Retention Forza
- Posizionare membrane L-PRF (n = 3) su una carta da filtro per facilità di trattamento e tagliato in campioni rettangolari di misurazione (10 mm x 25 mm) utilizzando un bisturi chirurgico.
- Misurare lo spessore di ciascun campione (media di 3).
- Effettuare un foro nel centro del campione utilizzando il filo per legatura ortodontica dell'acciaio inossidabile (220 micron di diametro).
- Far passare il filo di legatura attraverso il foro stenopeico per formare un anello e fissarlo alla macchina per prove di trazione. Posizionare il bordo della membrana L-PRF all'impugnatura mascella inferiore 13.
- Programmare lo strumento in modo che la testa mobile funziona ad una velocità costante (10 mm / min) e iniziol'esperimento.
- Registrare il modulo elastico, energia per rompere, e deformazione a rottura del software che accompagna il sistema di prova monoassiale. Questi valori sono calcolati automaticamente e non è richiesta in ingresso definito dall'utente. Si prega di vedere la figura 3.
5. Esame morfologica
- Preparare i campioni L-PRF per l'esame SEM con un 10 millimetri cutanea biopsia e metterli in un 24-pozzetti.
- Lavare i campioni con PBS e fissare con glutaraldeide al 2,5% (in PBS) per 20 min.
- Disidratare i campioni di immersione in sequenza concentrazioni crescenti di etanolo (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) per 5 minuti ciascuna.
- Trattare con 0,5 ml di 100% HMDS (esametildisilazano) per 5 min. Aerare O / N per rimuovere l'eccesso HMDS 14.
- Campioni di montaggio su stub usando un nastro biadesivo, sputter-coat platino per 70 secondi ed esaminare in un microscopio elettronico a scansione che opera ad un accelerazioneTensione razione di 20 kV (o l'impostazione appropriata).
6. genipina reticolazione di L-PRF, tripsina suscettibilità e Ninidrina Assay
- Per preparare genipina reticolato L-PRF, sciacquare membrane con PBS e immergersi in 4 ml di soluzione genipina 1% (in etanolo al 70%) per 48 ore. Risciacquare con PBS prima di esperimenti per rimuovere l'eccesso genipina 15, 16.
- Valutare la stabilità di reticolazione genipina di L-PRF dalla sua resistenza alla degradazione da tripsina. Membrana posto L-PRF (n = 3) e genipina reticolato L-PRF in 500 ml di 0,01% tripsina e incubate a 37 ° C per 3 giorni con cambio giornaliero di tripsina.
- Pesare i campioni al giorno 1 prima di enzima esposizione e al giorno 3. La differenza di inizio e fine il peso rappresenta degradazione enzimatica 17.
- Quantificare la quantità di reticolazione in genipina trattata L-PRF (G-PRF) di ninidrina dosaggio. Per prima cosa preparate la curv normae con glicina (1 mm 0,031 mM) curva per stabilire il rapporto tra la concentrazione di acido ammino libero (FAA) e l'assorbanza.
- Campioni PRF calore con 1 ml di 2% (w / v) ninidrina per 15 min a 100 ° C.
- Lasciare che la soluzione per raffreddare a RT e aggiungere 1,5 ml di etanolo al 50%.
- Analizzare l'assorbanza a 570 nm con uno spettrofotometro adeguato.
- Determinare la percentuale di cross-linking utilizzando la formula sotto 15
7. MTS proliferazione cellulare Assay
- Grow MC3T3 (topo preosteoblasts cranica) in Essential Media -alfa modifica minima (αMEM) in T-75 flaconi fino ad ottenere un confluenti monostrato 80%.
- Preparare fresco, sterile membrana L-PRF (aprire il tubo L-PRF all'interno della cappa di coltura cellulare) e trasferire la membrana su un nuovo piatto di coltura cellulare.
- Supporti Aspirare dal pallone e lavare il monostrato con PBS, aggiungere 5 ml di 0,05% tripsina e posizionare il pallone nella 37 ° C incubatore per 5 minuti, pipettare il contenuto del pallone in una provetta da centrifuga e centrifugare a 400 xg per 5 min.
- Decantare il surnatante, toccare delicatamente il tubo per rompere il pellet e risospendere con 4 ml di α fresco MEM, erogare una miscela di sospensione cellulare (50 ml) e blu trypan (50 microlitri) nel emocitometro e contare il numero di cellule
- Seed 4x10 5 cellule all'interno di 10 mm anelli di clonazione vetro posti sulla parte superiore della membrana L-PRF per mantenere le cellule all'interno delle membrane (anelli possono essere rimossi dopo 24 ore).
- Al giorno 4, sciacquare costrutti con PBS tre volte per 10 minuti.
- Aggiungere 1 ml di siero media liberi e 200 pl MTS reagente ad ogni pozzetto e incubare per 2 ore a 37 ° C.
- Misurare l'assorbanza da 200 microlitri aliquote a 490 nm.
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Representative Results
L'immagine microscopio elettronico a scansione del coagulo L-PRF in diverse sezioni (superiore, centrale e inferiore) strato è illustrato nella figura 2. Come si può vedere, la parte superiore è costituita prevalentemente da rete di fibrina senza cellule. Lo strato intermedio è arricchito con piastrine con evidenza della loro attivazione e degranulazione. Lo strato inferiore è un misto di leucociti e globuli rossi intrappolate all'interno di una matrice di fibrina.
Le proprietà meccaniche sono state valutate in due modalità: prove di trazione uniassiale e prova di resistenza di ritenzione di sutura. I risultati dimostrano comportamento viscoelastico di L-PRF. Anche se il modulo elastico è basso (0,47 MPa), la membrana è dura (energia per rompere, 5 N · mm) ed è in grado di subire deformazioni significative (217%, figura 3). I dati di test ritenzione di sutura, un indicatore della capacità della membrana da suturare ai tessuti, suggerito una significativamente durand materiale deformabile (modulo-0.2 MPa, strain-140% e l'energia per rompere-3,2 N.mm) in L-PRF (Figura 4).
Uno dei limiti dei prodotti fibrina nella medicina rigenerativa è la sua breve vita biologica. Realizzata in fibrina endogena, L-PRF è suscettibile di degradazione enzimatica e subisce fibrinolisi. Per valutare la resistenza di L-PRF alla degradazione mediata da enzimi, fresco L-PRF è stato sottoposto a trattamento con tripsina (0,01%) ed incubato a 37 ° C. Abbiamo osservato completa degradazione della L-PRF entro tre giorni. Reticolazione genipina di membrane L-PRF diminuita degradazione del 60% (Figura 5).
La capacità delle membrane L-PRF per sostenere la crescita delle cellule è stata valutata mediante coltura del mouse osteoblasti cranica sulle membrane reticolate e non reticolato. Coaguli non reticolato sottoposti degrado a vari livelli, mentre le membrane genipina reticolato mantenuto la loro struttura e sostenute ccrescita ell (Figura 6).
Figura 1. Passi nella generazione di L-PRF. (A) Dopo la centrifugazione del sangue intero in una provetta di vetro, tre strati sarà visibile. (B) Dopo la decantazione del PPP, la L-PRF si sta rimosso utilizzando una pinzetta sterile . (C) La base di globuli rossi viene asportata con un bisturi e posato su un vassoio di metallo perforato (D). Dopo la compressione dolce, il PPP è spremuto fuori e una membrana L-PRF ditta è formato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. curve sforzo-deformazione seguenti carico meccanico di L-PRF in modalità monoassiale prove di trazione (A) e la forza di ritenzione di sutura (B). Il modello di carico di ciascun campione è rappresentato in colore. I dati di prova di trazione monoassiale (A) indicano un basso modulo, una grande deformazione elastica e un rapido fallimento. Su distensione da una sutura (B), L-PRF rappresenta una membrana che è dura (area sotto la curva) e dilatabile. Buona raggruppamento di dati suggeriscono una variazione minima tra i campioni. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Fotografie di fallimento reale nei test di sutura forza di ritenzione. Una spessa in acciaio inox filo 220 micron legatura ortodontica è stata approvata attraverso il centro di L-PRF e legato al membro mascella superiore della macchina per prove di trazione. L'altra estremità è collegata all'impugnatura inferiore e allungato ad una velocità costante. Si noti l'allungamento della membrana e la sua resistenza allo strappo, suggerendo ottima resilienza di L-PRF.om / files / ftp_upload / 53221 / 53221fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Degradazione delle membrane L-PRF seguito di incubazione a 0,01% tripsina. Tutte le membrane L-PRF disintegrato completamente in tripsina entro 3 giorni mentre genipina reticolato L-PRF sono stati il 60% più stabile. Questo dimostra che reticolazione chimica può essere una strategia percorribile per migliorare la longevità delle membrane L-PRF quando sono immessi in vivo.
Figura 6. Effetto di L-PRF reticolazione sulla vitalità cellulare. Immagini rappresentative della cultura 4 giorno di cellule MC3T3 su reticolato L-PRF (A), genipina reticolato L-PRF (B) unnd plastica coltura tissutale (C). Non reticolato L-PRF degradato in cultura in misura variabile e ha mostrato l'attività delle cellule simile alla plastica. Genipina reticolato L-PRF mantenuto la loro struttura e sostenuto la sopravvivenza cellulare robusto. A destra sono dati quantificati (+ SD) da esperimenti indipendenti con tre repliche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Concentrati piastrinici autologhi sono promettenti nel campo della medicina rigenerativa 18 per l'abbondanza di fattori di crescita. Tuttavia, questi preparati spesso mancavano di una struttura definita che rende molto difficile la manipolazione chirurgica. Molte volte, le sospensioni e gel non si mantengono efficacemente nel sito di consegna, con conseguente esiti imprevedibili. L-PRF rappresenta un enorme progresso nell'evoluzione di concentrati piastrinici in quanto è essenzialmente una membrana di fibrina ditta con piastrine intrappolate. Queste membrane solide possiedono eccellenti caratteristiche di maneggevolezza, e possono essere suturate saldamente in una posizione anatomicamente desiderata durante interventi chirurgici aperti. Tuttavia, le proprietà fisiche e biologiche sono relativamente sconosciuto.
La L-PRF formerà costantemente quando le fasi sopra descritte sono rigorosamente rispettati (Figura 1). Una delle considerazioni importanti nel generare un buon membrana L-PRF è il timi Ritardo tra prelievo del sangue e centrifugazione. Il successo della tecnica L-PRF dipende interamente la velocità di raccolta del sangue e trasferimento immediato alla centrifuga 19, di solito entro un minuto. È impossibile generare un coagulo L-PRF ben strutturato (con il contenuto della cella, l'architettura della matrice e fattore di rilascio di crescita profilo specifico), se la raccolta del sangue è prolungato e non omogenea; un piccolo incoerente, friabile la massa di fibrina con contenuto sconosciuto si forma invece.
È stato accettato che le interazioni tra le cellule mechanobiological e matrice extracellulare (ECM) hanno un'influenza fondamentale in tutti gli aspetti del comportamento delle cellule tra cui la migrazione, proliferazione e differenziazione 20,21. L-PRF, un unico tipo di coagulo di sangue, si forma in determinate circostanze e comprende complessa, ramificata rete di fibrina. Funzioni di L-PRF come ECM provvisoria che viene girato in tessuto funzionale durante la guarigione. Subire mforze echanical, esiti di guarigione di successo dipendono l'integrità strutturale della L-PRF e quindi chiarire le loro proprietà fisiche è importante. Abbiamo eseguito prove di trazione monoassiale (per identificare le proprietà del materiale intrinseche) e test di ritenzione di sutura (per identificare le caratteristiche di guasto) su fresco L-PRF. A differenza di gel PRP o sangue coagulato che non dispone di una strutture definite, L-PRF assomiglia tessuto connettivo denso con caratteristiche di maneggevolezza superiori. Riportiamo un modulo elastico di 0.470 MPa (DS = 0.107) per le membrane L-PRF e allungare due volte la sua lunghezza iniziale prima della rottura (ceppo del 215%). Questi dati corrispondono con la letteratura pubblicata 22,23 che ha riportato una bassa rigidità (1-10 MPa) e alta pressione (fino al 150%) prima di rompersi. La differenza nei valori può essere dovuto all'uso di rete di fibrina rispetto all'uso di analisi AFM di singola fibra fibrina studi sopra indicati.
Forza di ritenzione di sutura è un chirurgicamenteimportante parametro di innesti e viene definita come la forza necessaria per tirare una sutura dall'innesto o causare la parete dell'innesto di sicuro. I nostri esperimenti utilizzati lineare attraverso procedura (come definito da ANSI 24). La forza necessaria per la trazione del filo di legatura attraverso la L-PRF di 3.23 N.mm (DS = 0,329). Nel complesso, abbiamo trovato il L-PRF di essere elevata resistenza meccanica, in grado di sostenere carichi e la capacità di allungare due volte tanto in tensione e mantiene suture abbastanza bene (si deforma in modo significativo prima di strappo).
La mancanza di stabilità e l'integrità strutturale di L-PRF in ambienti biologici è una limitazione importante nel suo uso in ingegneria tissutale. Abbiamo cercato di affrontare questo problema reticolazione chimicamente L-PRF utilizzando genipina. Diversamente glutaraldeide che è associato con la tossicità, genipina è una molecola biodegradabile naturale con bassa citotossicità. Dopo il trattamento genipina, le membrane erano significativamente stabile in tripsina e suppoari proliferazione cellulare in 4 giorni. Tuttavia, solo il 20% di L-PRF stato reticolato con genipina (determinato mediante saggio ninidrina). Questi dati suggeriscono che mentre reticolazione chimica è una strategia praticabile, altre alternative devono essere esplorate.
Sulla base di questi risultati, è chiaro che la L-PRF è un romanzo biomateriale con caratteristiche uniche: preparazione prevedibile dal sangue autologo, semplicità di protocollo, l'architettura definita, impressionanti le proprietà meccaniche e l'abbondanza di fattori di crescita da piastrine attivate. Il sangue è permesso di coagulare in condizioni fisiologiche con nessuna conoscenza di anticoagulanti, trombina esogena e cloruro di calcio. Tutte queste caratteristiche fanno di L-PRF promettenti biomateriali per applicazioni in medicina rigenerativa.
Uno dei problemi clinici per affrontare nell'applicazione di L-PRF è l'eterogeneità nella qualità delle piastrine e componenti del sangue. Allo stato attuale, molto poco è capito suL-PRF generato da pazienti con disturbi della coagulazione o pazienti sui farmaci che influenzano la coagulazione del sangue (eparina, warfarin o inibitori piastrinici). Le risposte a queste domande saranno sicuramente migliorare la nostra comprensione di guarigione e contribuire per far avanzare il campo della medicina personalizzata.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare e confermare che non vi siano conflitti di interesse noti associati a questa pubblicazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle 19G | BD | 305186 | |
| Needle Disposal Container | Fisherbrand | 14-827-122 | |
| Red-Topped Glass Collection Tube | BD | 8020129 | |
| Gauze Pads | Tyco | 5750 | |
| Bandage | Johnson & Johnson | 5005989 | |
| Surshield | Terumo | SV*S19BL | Safety winged infusion set |
| Blood Collection Assembly | BD | 303380 | |
| Tourniquets | BD | 367203 | |
| Brand Luer Adapter | Vacutainer | L42179 | |
| Intra-Spin System | Intra-Lock International | ISS110 | Centrifuge and Xpression L-PRF FabricationKit |
| Pipettes (Serological & Micro) | Corning | ||
| Scalpel | Exelint | 29552 | |
| MTS Bionix 200 | MTS Systems Corporation | Material testing systems | |
| MTS Test Works 4 | MTS Systems Corporation | ||
| Whatman Filter Paper | Whatman | 1004 070 | |
| SS Orthodontic ligature wire | Patterson Dental | 628-4228 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Aldrich | 440191 | |
| Aluminium Mounting Stubs | Ted Pella | 16324 | |
| Double Sided Carbon Tape | PELCO Tabs | 16084-1 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | LV 5610 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| Cell Culture Incubator | Thermo Fisher Scientific Inc | 51026282 | |
| Antibiotic-Antimicotic | Gibco | 15240-062 | |
| Genipin | Wako | 078-03021 | |
| Cell Culture Media | Gibco | 12000-022 | Minimum Essential Medium-Alpha |
| MTS Reagent | Promega | G1118 | |
| PMS Reagent | Sigma | P9625 | |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch Spectrophotometer | |
| 10mm Glass Cloning Rings | Corning | 3166-10 | |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| DPBS | Corning | 55-031-PB | |
| Ninhydrin 98% | Aldrich | 454044 | |
| 24 Well Plate | Corning | 3987 | |
| Biopsy Punch | Acu Punch | P1025 | |
| Digital Micrometer | Pittsburgh | 68305 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| 12 Well Plate | Corning | 3336 | |
| 96 Well Plate | Corning | 3596 |
References
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